聶倩倩 王 鑫 楊發(fā)樹 楊 娟 張鳳枰,4*

(1. 四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司,成都 610041;2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;3. 通威股份有限公司農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)營養(yǎng)與智慧養(yǎng)殖重點實驗室,成都 610093;4. 宜賓學(xué)院質(zhì)量管理與檢驗檢測學(xué)部,宜賓 644007)

膽汁酸(BA)是膽汁的主要脂質(zhì)成分,是動物體內(nèi)膽固醇代謝過程中產(chǎn)生的固醇類物質(zhì)。研究表明,添加外源性膽汁酸可提高動物對飼料的脂肪利用率、抗脂肪肝、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)膽汁分泌、暢通膽道、殺菌等,在動物脂肪代謝中起重要作用[1-3],能有效促進(jìn)養(yǎng)殖動物生長、顯著改善養(yǎng)殖動物產(chǎn)品品質(zhì)[4-6]。2014年膽汁酸被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)為飼料添加劑,產(chǎn)品為混合型飼料添加劑,其主要成分為豬膽酸(hyocholic acid,HCA)、豬去氧膽酸(hyodeoxycholic acid,HDCA)和鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA),目前允許在斷奶仔豬、淡水魚和產(chǎn)蛋雞配合飼料中限量使用[7-9]。目前國內(nèi)已獲得混合型飼料添加劑膽汁酸生產(chǎn)許可證的企業(yè),盡管都是依據(jù)農(nóng)業(yè)部備案標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的,但實際生產(chǎn)中由于采用的生產(chǎn)原料和生產(chǎn)工藝不盡相同,產(chǎn)品中的膽汁酸含量和規(guī)格不一、產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。因此,飼料生產(chǎn)企業(yè)準(zhǔn)確測定混合型飼料添加劑中3種膽汁酸含量、合規(guī)使用非常重要。目前,國內(nèi)外已有關(guān)于飼糧中添加膽汁酸對養(yǎng)殖動物肝臟代謝、生長性能影響等的研究[10-14],但尚未見混合型飼料添加劑中膽汁酸含量測定的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)報道。隨著我國畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)混合型飼料添加劑膽汁酸應(yīng)用越來越廣泛,研究建立混合型飼料添加劑中膽汁酸含量的測定方法,對于混合型飼料添加劑膽汁酸生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制、飼料企業(yè)科學(xué)規(guī)范使用膽汁酸具有重要意義。目前,國內(nèi)外文獻(xiàn)報道有關(guān)膽汁酸含量測定方法主要有薄層色譜法[15]、分光光度法[16]、高效液相色譜法[17-18]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[19-20]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[21-22]。薄層色譜法需要復(fù)雜的純化前處理,其結(jié)果易受試驗條件影響;分光光度法操作簡單,但無法準(zhǔn)確定量測定3種膽汁酸含量;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法需要進(jìn)行復(fù)雜的衍生處理,液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法樣品需要凈化處理,靈敏度均特別高,不適合含量較高的飼料添加劑膽汁酸定量分析;高效液相色譜法樣品前處理簡單,線性范圍、靈敏度等更適合混合型飼料添加劑膽汁酸主成分含量檢測。本試驗研究建立混合型飼料添加劑中3種膽汁酸含量的高效液相色譜-示差折光(HPLC-RID)法、高效液相色譜-熒光(HPLC-FLD)法,并與現(xiàn)有的重量法、容量法進(jìn)行對比,明確4種方法的測定原理、測定對象、測定結(jié)果的差異,旨在為飼料和飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)選擇適宜的混合型飼料添加劑中膽汁酸含量檢測方法、加強(qiáng)混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品質(zhì)量控制及其科學(xué)規(guī)范使用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

1260高效液相色譜儀(Agilent公司)、KS-5200E超聲波振蕩器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)、Auto EVA 80氮吹儀(?？苾x器有限公司)、Multi Reax渦旋混合儀(Heidolph公司)、DZKW-4水浴鍋(北京中興偉業(yè)公司)、CP225d分析天平(Sartorius公司)、101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)公司)。

豬膽酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.8%,北京曼哈格生物科技有限公司)、豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司)、鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥97.3%,北京曼哈格生物科技有限公司)、甲醇和乙腈(色譜純,成都市諾爾施科技有限責(zé)任公司)、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(純度≥98%,上海安譜實驗科技股份有限公司)、1,4,7,10,13,16-六氧雜環(huán)十八烷(純度為99%,北京索萊寶科技有限公司)、氫氧化鉀、三氟乙酸、磷酸、乙醚、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸(均為分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司)、Milli-Q Gradient超純水(美國Millipore公司)。

混合型飼料添加劑膽汁酸樣品由通威股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 HPLC-RID法

1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱取豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品各約5.00 mg(精確至0.1 mg)于10 mL容量瓶,用甲醇溶解、定容,混勻,制備成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的膽汁酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。取適量膽汁酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、50、100和200 μg/mL的膽汁酸混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2)試樣溶液制備:稱取混合型飼料添加劑膽汁酸試樣200 mg(精確至0.1 mg)于100 mL容量瓶中,加流動相(甲醇+乙腈+水=110+100+90,v/v,pH=2.6)約70 mL,常溫超聲30 min,取出,冷卻至室溫,用流動相定容至100 mL,混勻,用0.45 μm微孔濾膜過濾,待HPLC-RID分析。

3)高效液相色譜條件:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱,長150 mm,內(nèi)徑4.6 mm,粒徑5 μm;流動相為甲醇+乙腈+水=110+100+90(v/v),用磷酸調(diào)pH至2.6;流速為1.0 mL/min;檢測池溫度為40 ℃;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.2 HPLC-FLD法

1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:同1.2.1。

2)試樣溶液制備:稱取混合型飼料添加劑膽汁酸試樣200 mg(精確至0.1 mg)于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解、定容,混勻。準(zhǔn)確移取0.5 mL膽汁酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液,分別置于10 mL具塞試管中,準(zhǔn)確加入2.5 mL 1.8 mmol/L氫氧化鉀甲醇溶液,渦旋混合1 min,55 ℃水浴皂化10 min,55 ℃氮?dú)獯蹈?準(zhǔn)確加入0.5 mL 10 mmol/L 4-溴甲基-7-甲氧基香豆素乙腈溶液、0.5 mL 5 mmol/L 1,4,7,10,13,16-六氧雜環(huán)十八烷乙腈溶液,加塞密封,渦旋混合1 min,在避光條件下,65 ℃衍生反應(yīng)2 h,取出,冷卻至室溫。用0.45 μm微孔濾膜過濾,待HPLC-FLD分析。

3)高效液相色譜條件:Thermo Scientific Acclaim 120 C18色譜柱,長250 mm,內(nèi)徑4.6 mm,粒徑5 μm;流動相中A相為0.05%三氟乙酸溶液,B相為乙腈;流速為1.0 mL/min;檢測波長為熒光激發(fā)波長為330 nm,發(fā)射波長為410 nm;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。流動相梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.2.3 重量法

參考《中華人民共和國藥典(2015年版一部)》[23]中的豬膽粉法,稍作修改,試驗步驟如下:稱取試樣0.5 g(精確至0.1 mg),置于250 mL三角瓶中,加無水乙醇20 mL,連接冷凝回流裝置,加熱回流30 min,過濾,濾渣用無水乙醇10 mL洗滌,洗液與濾液合并,蒸干,加15%氫氧化鈉溶液30 mL、乙醇1 mL,加熱回流6 h,再加水30 mL,搖勻,濾入分液漏斗中,濾渣使用熱水20 mL洗滌,與濾液合并,稀硫酸調(diào)pH至酸性(pH=2～5),放至室溫,再用乙醚振搖提取4次(50、50、30、30 mL),合并乙醚提取液,用水洗滌2次,每次10 mL,乙醚液濾過,濾器用10 mL乙醚洗滌,洗液與濾液合并于干燥至恒重的250 mL錐形瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),回收乙醚,105 ℃干燥至恒重,計算公式如下:

X=100×(W1-W0)/m。

式中:X表示樣品中膽汁酸含量(%);m表示樣品重量(g);W1表示三角燒瓶+提取物恒重的重量(g);W0表示三角燒瓶恒重的重量(g)。

1.2.4 容量法

參考某飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)膽汁酸檢測方法,試驗步驟如下:稱取試樣適量(約含有膽汁酸0.5 g,精確至0.1 mg),置于250 mL三角瓶中,用50 mL 95%乙醇超聲溶解,濾紙過濾,濾液加酚酞指示劑2滴,用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行滴定,至試樣溶液變粉紅色且30 s內(nèi)不褪色為止,同時做空白試驗。計算公式如下:

X=100×[c×(V-V0)×392.6]/m。

式中:X表示樣品中膽汁酸含量(%);c表示氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/L);V0表示空白試驗消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);V表示滴定樣液時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);m表示樣品質(zhì)量(mg)。

1.3 統(tǒng)計方法

采用Excel 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,采用Origin 2021軟件進(jìn)行作圖,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-RID方法研究

2.1.1 樣品前處理條件優(yōu)化

試驗使用流動相(甲醇+乙腈+水=110+100+90,v/v,pH=2.6)作為膽汁酸提取溶液,考察不同提取時間(10、20、30和40 min)、不同提取溫度(20、30、40、50和60 ℃)對3種膽汁酸含量測定結(jié)果的影響,如圖1所示。結(jié)果表明,隨著提取時間的延長,3種膽汁酸含量不斷升高,30 min時達(dá)到最高;隨著提取溫度的變化,3種膽汁酸含量發(fā)生改變,30 ℃時達(dá)到最高,30～60 ℃逐步下降,因此,最終確定提取時間為30 min、提取溫度為30 ℃。

HCA:豬膽酸 hyocholic acid;HDCA:豬去氧膽酸 hyodeoxycholic acid;CDCA:鵝去氧膽酸chenodeoxycholic acid。下圖同 the same as below。

2.1.2 色譜條件選擇和優(yōu)化

試驗比較了流動相A(甲醇+乙腈+水=140+120+40,v/v)、流動相B(甲醇+乙腈+水=110+100+90,v/v)3種膽汁酸色譜峰的分離效果,如圖2所示。結(jié)果表明,采用流動相A,豬膽酸、豬去氧膽酸未分開,3種膽汁酸色譜峰分離效果不佳,有拖尾現(xiàn)象;而采用流動相B,3種膽汁酸完全分開,色譜峰峰形尖銳、分離效果較好。不同品牌C18色譜柱對3種膽汁酸的分離效果有一定差異,其中短柱(Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱)保留時間提前,峰形較好。另外,采用示差檢測器測定,柱溫對色譜峰的響應(yīng)值及保留時間影響較大,試驗比較了不同色譜柱溫度(30、35、40和45 ℃)3種膽汁酸色譜峰分離效果,結(jié)果表明,當(dāng)色譜柱溫度為40 ℃時,目標(biāo)物色譜峰分離效果較好、響應(yīng)值較高。

圖2 不同流動相(A)、色譜柱(B)和色譜柱溫度(C)下3種膽汁酸色譜圖

2.1.3 方法學(xué)考察

取“1.2.1”制得的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照優(yōu)化后的前處理及色譜條件進(jìn)行測定,各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo),線性擬合得各目標(biāo)化合物在一定線性范圍內(nèi)線性回歸方程,并計算其定量限(S/N≥10.0,P/P)。稱取200 mg添加劑預(yù)混料樣品,按照優(yōu)化后方法對預(yù)混料樣品進(jìn)行3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,各濃度水平分別進(jìn)行4次重復(fù)測定,計算其回收率及測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果如表2所示。

表2 3種膽汁酸線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和定量限

2.2 HPLC-FLD方法研究

2.2.1 皂化條件選擇

考察不同皂化溫度(30、40、50和60 ℃)、不同皂化時間(10、20、30和40 min)、不同氫氧化鉀甲醇溶液添加量(1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL)對豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量測定結(jié)果的影響,如圖3所示。皂化溫度、皂化時間對膽汁酸含量測定結(jié)果影響并不大,考慮到皂化后需要進(jìn)行55 ℃氮吹,因此最終選擇膽汁酸皂化溫度為55 ℃、皂化時間為10 min;3種膽汁酸含量隨著氫氧化鉀甲醇溶液(1.8 mmol/L)添加量的增加而增大,當(dāng)添加量為2.0～2.5 mL時,3種膽汁酸含量測定結(jié)果達(dá)到最高值,且隨著氫氧化鉀甲醇溶液添加量的增大,測定結(jié)果不再增加,因此,最終確定氫氧化鉀甲醇溶液添加量為2.5 mL。

圖3 不同皂化溫度(A)、皂化時間(B)和KOH甲醇溶液添加量(C)下3種膽汁酸含量變化曲線

2.2.2 衍生條件選擇

其他條件不變,考察不同衍生溫度(50、65、70和80 ℃)、不同衍生時間(1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h)對豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量測定結(jié)果的影響,如圖4所示。隨著衍生溫度的升高,3種膽汁酸含量測定結(jié)果不斷升高,65 ℃達(dá)到最高點,經(jīng)過多次試驗,當(dāng)衍生溫度高于70 ℃時,試管塞易被蒸汽沖開造成損失,測定結(jié)果不穩(wěn)定,因此選擇衍生反應(yīng)溫度為65 ℃;隨著衍生時間的延長,3種膽汁酸含量測定結(jié)果不斷升高,2 h時達(dá)到最高點,高于2 h后各膽汁酸含量測定結(jié)果變化趨于穩(wěn)定,表明衍生反應(yīng)完全,最終選擇衍生時間為2 h。

圖4 不同衍生溫度(A)、衍生時間(B)下3種膽汁酸含量變化曲線

2.2.3 色譜條件選擇和優(yōu)化

為了獲得良好分離度,試驗比較甲醇-乙腈-水體系、三氟乙酸-乙腈體系流動相對3種膽汁酸色譜分離效果、保留時間和響應(yīng)值的影響,同時,比較不同品牌C18色譜柱3種膽汁酸色譜分離效果,如圖5所示。以三氟乙酸-乙腈體系作為流動相時,3種膽汁酸色譜峰的峰形較好,響應(yīng)值較高;長柱(Thermo Scientific Acclaim 120 C18色譜柱)分離效果較好,峰形尖銳不拖尾,響應(yīng)值較高。

圖5 不同流動相(A)、色譜柱(B)下3種膽汁酸色譜圖

2.2.4 方法學(xué)考察

取“1.2.2”制得的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照優(yōu)化后的前處理及色譜條件進(jìn)行測定,各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo),線性擬合得各目標(biāo)化合物在一定線性范圍內(nèi)線性回歸方程,并計算其定量限(S/N≥10.0,P/P)。稱取200 mg添加劑預(yù)混料樣品,按照優(yōu)化后方法對預(yù)混料樣品進(jìn)行3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,各濃度水平分別進(jìn)行4次重復(fù)測定,計算其回收率及測定值的RSD,結(jié)果如表3所示。

表3 3種膽汁酸線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和定量限

2.3 HPLC-FLD和HPLC-RID方法比較

采用HPLC-RID和HPLC-FLD 2種方法測定4個混合型飼料添加劑樣品中膽汁酸的含量,如表4所示。結(jié)果表明,4個樣品中3種膽汁酸含量,HPLC-RID法均較HPLC-FLD法高。

表4 混合型飼料添加劑中3種膽汁酸含量測定結(jié)果

2.4 HPLC法與重量法、容量法的比較

目前,國內(nèi)外針對混合型飼料添加劑中膽汁酸含量檢測方法并不多,目前各飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)檢測膽汁酸含量的方法主要有重量法和容量法。試驗采用HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法、容量法對4個混合型飼料添加劑膽汁酸樣品進(jìn)行膽汁酸總含量的測定,如表5所示。容量法膽汁酸總含量測定結(jié)果最高,重量法次之,而HPLC-RID法和HPLC-FLD法相對偏低。

表5 4種方法混合型飼料添加劑中膽汁酸總含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 前處理條件的選擇與優(yōu)化

膽汁酸含量的檢測可以通過HPLC各種檢測器實現(xiàn)[24-28],但該技術(shù)在分離復(fù)雜的膽汁酸化合物方面仍具有一定的局限性。天然存在的膽汁酸既沒有紫外吸收,也沒有熒光特性,因此可以使用通用型的示差折光檢測器,利用折射率的變化對膽汁酸含量進(jìn)行測定。本試驗直接以流動相作為提取液,通過對比不同提取時間、不同提取溫度來確定膽汁酸的提取條件,最終確定HPLC-RID法的提取時間為30min、提取溫度為30℃,方法簡便、易操作,方法重復(fù)性、再現(xiàn)性好。

與示差折光檢測器相比,熒光檢測器對于化合物的含量測定具有更高的靈敏度,因此本試驗采用衍生劑進(jìn)行熒光標(biāo)記。常用的試劑一般是香豆素類衍生物,如本試驗使用的4-溴甲基-7-甲氧基香豆素,同時一般以18-冠醚-6作為相轉(zhuǎn)移催化劑,即本試驗使用的1,4,7,10,13,16-六氧雜環(huán)十八烷。先以氫氧化鉀與膽汁酸皂化生成膽汁酸鉀鹽,因皂化反應(yīng)進(jìn)行較快,因此混勻后反應(yīng)時間10 min左右即可;皂化后,膽汁酸鉀鹽的鉀離子與1,4,7,10,13,16-六氧雜環(huán)十八烷絡(luò)合,絡(luò)合物再與4-溴甲基-7-甲氧基香豆素衍生化反應(yīng)得到膽汁酸熒光衍生物。其中,衍生條件的影響較大,參照前人研究[29]對衍生時間、衍生溫度進(jìn)行考察優(yōu)化,得到上述HPLC-FLD法衍生最優(yōu)條件。

3.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化

對于通用型的示差折光檢測器,因為不同比例流動相的密度以及折光系數(shù)不同,改變流動相比例會引起基線的持續(xù)變化,因此需要對流動相比例進(jìn)行比較研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)有機(jī)相比例增高時,保留時間減小;同時,示差折光檢測器是對溫度要求最高的檢測器,對溫度變化較為敏感,因此需要對柱溫箱溫度條件進(jìn)行探索比較,一般室溫條件峰形較差,響應(yīng)值較低,40 ℃最佳。參考前人[30]研究,高效液相色譜-熒光檢測器檢測膽汁酸含量時,多使用不同比例有機(jī)相與水進(jìn)行梯度洗脫。本試驗發(fā)現(xiàn),對于預(yù)混料樣品中的膽汁酸含量,使用有機(jī)相-水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫時,3種膽汁酸分離效果較差,峰形較為難看,因此,為增強(qiáng)其分離效果,改善其峰形,試驗使用三氟乙酸調(diào)節(jié)流動相pH來有效克服峰展寬和拖尾問題。經(jīng)方法學(xué)考察,在上述優(yōu)化的HPLC-RID和HPLC-FLD法樣品前處理、液相色譜條件下,所建立的HPLC-RID和HPLC-FLD法的選擇性、線性范圍、定量限、正確度、精密度等方法特性參數(shù)基本能滿足混合型飼料添加劑膽汁酸含量檢測需要。

3.3 不同測定方法結(jié)果的比較

3.3.1 HPLC-RID法和HPLC-FLD法

采用HPLC-RID和HPLC-FLD 2種方法測定樣品中3種膽汁酸含量測定結(jié)果,HPLC-RID法均較HPLC-FLD法高,這可能是由于HPLC-FLD法前處理較復(fù)雜,需要皂化、衍生后進(jìn)行HPLC測定,皂化、衍生過程易產(chǎn)生損失,方法回收率、重復(fù)性均較HPLC-RID法低,使其最終總含量略低于HPLC-RID法。經(jīng)過多次試驗發(fā)現(xiàn),HPLC-RID法和HPLC-FLD法檢測3種膽汁酸的定量限相差數(shù)倍,這是基于檢測器本身引起的差異,示差折光檢測器的檢測基于被分析物的折光指數(shù)的差異,即測量樣品流路與參比流路在折光指數(shù)上的差別,其靈敏度較低、選擇性較差,對流速、溫度及黏度的變化敏感;而熒光檢測器是一種高靈敏的選擇性檢測器,它適用于檢測物質(zhì)本身具有熒光或為了提高靈敏度將沒有熒光的物質(zhì)衍生成熒光衍生物;由于飼料添加劑膽汁酸含量較高,RID的檢出限、線性范圍均可以滿足混合型飼料添加劑膽汁酸主成分含量的檢測需要。另外,試驗發(fā)現(xiàn),HPLC-FLD法容易受混合型飼料添加劑載體影響,因為混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品大多會使用麥飯石、糠、淀粉等作為載體,每家生產(chǎn)企業(yè)配方可能不一樣,HPLC-FLD法衍生過程中易受載體基質(zhì)等影響,造成膽汁酸衍生反應(yīng)不穩(wěn)定、衍生效果不穩(wěn)定,最終導(dǎo)致3種膽汁酸響應(yīng)值不穩(wěn)定,特別容易引起批間測定結(jié)果差別大,方法重復(fù)性和再現(xiàn)性差;HPLC-RID法前處理非常簡單,僅需要用流動相提取后直接進(jìn)行HPLC分析,方法穩(wěn)定性好,非常適合混合型飼料添加劑中的豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量的測定。

3.3.2 HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法和容量法之間的比較

采用HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法、容量法對混合型飼料添加劑膽汁酸樣品進(jìn)行膽汁酸總含量的測定,容量法膽汁酸總含量測定結(jié)果最高,重量法次之,而HPLC-RID法和HPLC-FLD法相對偏低。這主要是因為4種方法的原理不同,重量法用乙醇-氫氧化鈉水解試樣、乙醚提取所有膽汁酸,回收乙醚后干燥,重量法得到混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品的總膽汁酸含量,因各混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品原料來源不一,生產(chǎn)工藝差異大,混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品除含有《飼料添加劑品種目錄》規(guī)定的豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸外,還可能含有膽酸、去氧膽酸、石膽酸等10多種膽汁酸;而容量法用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,滴定過程會中和混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中所有無機(jī)酸和有機(jī)酸,含量最高;HPLC-RID法、HPLC-FLD法可對豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸等3種膽汁酸進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析,僅測定這3種膽汁酸的總含量。混合型飼料添加劑膽汁酸生產(chǎn)企業(yè)、飼料企業(yè)可根據(jù)自身實驗室條件和檢測需要選擇適宜的膽汁酸含量測定方法。

4 結(jié) 論

① 若針對混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量進(jìn)行檢測,HPLC-RID法和HPLC-FLD法均可準(zhǔn)確測定。但HPLC-FLD法測定結(jié)果重復(fù)性和再現(xiàn)性差,建議選擇前處理更簡單、穩(wěn)定性好的HPLC-RID法測定混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量。

② 若針對混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中的所有膽汁酸的總含量檢測,由于容量法滴定中和產(chǎn)品中所有的無機(jī)酸和有機(jī)酸,測定結(jié)果不能正確反映產(chǎn)品中所有膽汁酸的總含量,建議采用《中華人民共和國藥典(2015年版一部)》規(guī)定的重量法(豬膽粉法)測定混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中的膽汁酸總含量。