楊躍杰 連 帥,2 武 瑞,2 王建發(fā),2*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,大慶 163319;2.黑龍江省牛病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大慶 163319)

乳鐵蛋白(LF)是一種天然的屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的陽離子糖基化球狀蛋白,存在于各種哺乳動(dòng)物分泌物中,包括初乳、牛奶、唾液、眼淚和黏液,在先天免疫防御系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[1]。近年來,LF因在治療病理方面和調(diào)節(jié)生理方面的潛在應(yīng)用而受到諸多學(xué)者的關(guān)注。除了螯合游離的二價(jià)鐵離子(Fe2+)和三價(jià)鐵離子(Fe3+),LF的生物學(xué)功能也涉及抗菌、抗炎、抗病毒、參與鐵代謝、抗氧化、抗腫瘤和提高自身抗體等多領(lǐng)域[2]。我國(guó)乳制品工業(yè)所需LF原料98%依靠進(jìn)口,如何提高牛乳中LF的含量也是目前的難題,能否保障LF的自主可控供應(yīng)直接決定了我國(guó)乳品產(chǎn)業(yè)的安全水平和核心競(jìng)爭(zhēng)力[3]。

目前為止,LF的基因表達(dá)和合成分泌受到多維性和整體性的不同影響。根據(jù)體內(nèi)和體外研究,LF的表達(dá)和分泌受核受體、轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、刺激和炎癥的調(diào)控[2]。已有研究表明,頻繁刺激乳頭擠奶可顯著降低牛奶中LF的含量,延長(zhǎng)擠奶間隔可增加LF的產(chǎn)量[4-5]。另外,4 mmol/L纈氨酸處理山羊乳腺上皮細(xì)胞增加了細(xì)胞內(nèi)LF的分泌[6]。在試驗(yàn)中給小鼠喂食鐵(120 mg/kg),結(jié)果表明鐵顯著增加哺乳期第1天和第25天乳腺組織LFmRNA的表達(dá)[7]。報(bào)道顯示,視黃醇和雌激素呈時(shí)間和劑量依賴性誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞中LF的表達(dá)[8]。與此同時(shí),在人類和小鼠LF啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)的雌激素受體結(jié)合元件以受體和激素依賴的方式上調(diào)乳腺上皮細(xì)胞LFmRNA的表達(dá)水平,同時(shí)甲氧氯通過GC-Ⅱ序列刺激雌激素受體無效小鼠子宮中LF基因的表達(dá)[9-10]。因此,明確LF基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律對(duì)通過體外生物技術(shù)合成LF具有重要意義。

LF啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn),特異性蛋白-1(SP-1)和雌激素受體結(jié)合在鼠LF啟動(dòng)子上,電泳遷移率轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中證明激活蛋白-2(AP-2)和SP-1在調(diào)控豬LF的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用[11-12]。同時(shí),牛LF具有信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5(STAT5)的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn),而催乳素(PRL)調(diào)控STAT5在奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)產(chǎn)奶過程中起到核心作用[13-14]。此外,PRL通過酪氨酸激酶2/STAT5(JAK2/STAT5)信號(hào)通路的活化,可以促進(jìn)哺乳期乳腺中乳脂、乳糖和乳蛋白的合成與分泌[15-16]。不同濃度的PRL和賴氨酸組合升高體外BMECs中LF的基因表達(dá)[17]。因此,本試驗(yàn)檢測(cè)了PRL對(duì)BMECs中LF合成和分泌的影響,分析了PRL調(diào)控LF合成的作用機(jī)制,旨在為提升牛奶中功能性蛋白含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PRL(HEK293)、匹莫齊特(Pimozide,HY-12987)購(gòu)自MedChemExpress公司,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(SEA780Bo)購(gòu)自武漢云克隆科技有限公司,Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠(H+L)(A0521)、Cy3標(biāo)記驢抗山羊(H+L)(A0502)和Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔 (H+L)抗體(A0423)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司,HRP-山羊抗兔二抗(H+L)(SA00001-2)、HRP-兔抗山羊二抗(H+L)(SA00001-4)和HRP-山羊抗鼠二抗(H+L)(SA00001-1)均購(gòu)自Proteintech Group公司,HRP Anti-LF抗體(ab112970)和Anti-角蛋白-18抗體(ab668)均購(gòu)自Abcam公司,JAK2(bs-23003R)和STAT5(bs-1142R)抗體均購(gòu)自BIOSS公司,磷酸化抗體JAK2(AF3022)購(gòu)自AFFINIY公司,磷酸化STAT5抗體(4322S)購(gòu)自CST公司。

1.2 BMECs的分離純化與鑒定

本試驗(yàn)采集了黑龍江省某正規(guī)奶牛屠宰場(chǎng)1頭處于泌乳高峰期健康的中國(guó)荷斯坦奶牛乳腺組織。用手術(shù)刀切碎乳腺組織(0.5～1.0 mm3),用膠原酶Ⅰ型消化,37 ℃輕搖。用無菌的100目細(xì)胞篩過濾消化液和組織塊后,收集細(xì)胞,1 200×g離心3 min。細(xì)胞在37 ℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中用添加10%胎牛血清、1%青霉素(100 U/mL)/鏈霉素(100 mg/mL)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用差異胰蛋白酶分離出BMECs,驗(yàn)證BMECs的來源和純度。免疫熒光法檢測(cè)BMECs的標(biāo)志蛋白(角蛋白-18)的表達(dá)。最后使用熒光顯微鏡拍攝。

1.3 BMECs合成分泌LF功能的鑒定

將BMECs以2×105個(gè)/mL的濃度接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí),使用饑餓培養(yǎng)基(無血清、無激素)培養(yǎng)純化后的BMECs 16 h后,添加不同濃度的PRL[0(對(duì)照)、10、100、1 000 ng/mL]處理BMECs 24 h,為了驗(yàn)證STAT5在PRL促進(jìn)BMECs LF合成和分泌的關(guān)鍵作用,添加STAT5抑制劑Pimozide [未添加Pimozide(對(duì)照)、10 μmol/L Pimozide、100 ng/mL PRL、10 μmol/L Pimozide+100 ng/mL PRL]處理BMECs 24 h(本研究添加的PRL濃度參考國(guó)內(nèi)外通過放射免疫分析法檢測(cè)的奶牛體內(nèi)PRL濃度設(shè)置,同時(shí)探索高濃度PRL對(duì)BMECs中LF的影響[18-23];添加PRL培養(yǎng)BMECs 24 h參考前人[24]的研究方法)。收集細(xì)胞上清液,用ELISA試劑盒檢測(cè)BMECs中LF的含量;收集細(xì)胞檢測(cè)LF基因相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量;細(xì)胞使用LF熒光抗體染色,免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LF的熒光強(qiáng)度。所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次,每組技術(shù)重復(fù)3次。

1.4 LF、PRLR和JAK2/STAT5信號(hào)通路相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

利用總RNA提取試劑提取不同條件處理的BMECs中總RNA,根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒說明書,檢測(cè)BMECs中LF、PRLR、JAK2和STAT5基因相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃、1 min預(yù)變性;95 ℃、20 s變性,60 ℃、1 min延伸;40個(gè)循環(huán)。所用引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列如表1所示。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因,目的基因相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5 BMECs中LF和p-STAT5相對(duì)熒光強(qiáng)度檢測(cè)

將BMECs接種于待檢測(cè)培養(yǎng)皿中,細(xì)胞培養(yǎng)至融合,洗滌,BMECs用4%多聚甲醛固定,0.5%Triton X-100溶液處理,3%牛血清白蛋白溶液(BSA)封閉,用p-STAT5和LF分別抗體孵育,在4 ℃過夜。熒光二抗37 ℃染色2 h。用抗熒光淬滅封片液(含DAPI)細(xì)胞核染色。最后在熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度和入核水平。

1.6 BMECs中LF蛋白和JAK2/STAT5信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測(cè)

將處理后的BMECs在含有蛋白磷酸酶抑制劑混合物的放射免疫沉淀法緩沖液中裂解。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)其濃度進(jìn)行定量后,等量的樣品總蛋白(20 μg)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)制備試劑盒制備10%的SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移到甲醇活化的聚偏二氟乙烯膜上。一抗為L(zhǎng)F、JAK2、p-JAK2、STAT5、p-STAT5 1∶1 000、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)1∶10 000,二抗根據(jù)一抗的種屬來源不同選擇。免疫反應(yīng)條帶采用超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行可視化,使用Image Lab軟件(Bio-Rad)測(cè)定條帶強(qiáng)度。蛋白表達(dá)水平歸一化為GAPDH表達(dá),將蛋白磷酸化水平歸一化為相應(yīng)蛋白的總水平。

1.7 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphpad prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMECs體系分離、純化、標(biāo)志蛋白鑒定

由圖1-A可見組織塊經(jīng)過72 h后開始生長(zhǎng)大量細(xì)胞;由圖1-B可見原代純化培養(yǎng)后,BMECs多呈現(xiàn)卵圓形;由圖1-C可知BMECs在25 m3細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.63×106個(gè)/mL,存活率達(dá)到97%。由圖1-D、圖1-E和圖1-F可知經(jīng)免疫熒光檢測(cè),BMECs中CK-18在細(xì)胞上明顯表達(dá),證明本試驗(yàn)已獲得純化的BMECs,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A:組織塊接種72 h后生長(zhǎng)出的上皮樣細(xì)胞;B:純化后BMECs細(xì)胞;C:25 m3細(xì)胞培養(yǎng)瓶中BMECs細(xì)胞計(jì)數(shù);D: BMECs細(xì)胞核DAPI染色;E:BMECs細(xì)胞CK-18染色;F:D、E合圖。

2.2 LF的ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果

為了檢測(cè)PRL對(duì)BMECs中LF含量的影響,用不同濃度的PRL處理BMECs 24 h后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LF的含量。由圖2-A可知,BMECs細(xì)胞上清液中的LF含量隨著PRL濃度的增加,呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),與對(duì)照組相比,10、100、1 000 ng/mL PRL能夠顯著或極顯著提高BMECs中LF的含量(P<0.05或P<0.01)。由圖2-B可知,與對(duì)照組相比,10 ng/mL PRL處理使BMECs中LF基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),100 ng/mL PRL處理使BMECs中LF基因相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01),1 000 ng/mL PRL處理使BMECs中LF基因相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組,但無顯著差異(P>0.05)。

與對(duì)照組相比,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。下圖同。

2.3 PRL處理細(xì)胞可促進(jìn)JAK2/STAT5相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄

由圖3可知,與對(duì)照組相比,10 ng/mL PRL處理使BMECs中JAK2、STAT5和PRLR基因相對(duì)表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),100 ng/mL PRL處理使BMECs中JAK2和PRLR基因相對(duì)表達(dá)量極顯著提高(P<0.01),100 ng/mL PRL處理BMECs中STAT5基因相對(duì)表達(dá)顯著上調(diào) (P<0.05),1 000 ng/mL PRL處理使BMECs中PRLR基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),1 000 ng/mL PRL處理使BMECs中STAT5基因相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01),1 000 ng/mL PRL處理使BMECs中JAK2基因相對(duì)表達(dá)量提高,但無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同濃度PRL處理BMECs中JAK2、STAT5和PRLR基因表達(dá)量的結(jié)果

2.4 PRL處理細(xì)胞可促進(jìn)JAK2/STAT5信號(hào)通路蛋白表達(dá)

由圖4可知,隨著PRL濃度的升高,p-JAK2的蛋白表達(dá)量呈逐漸上升的趨勢(shì),與對(duì)照組相比,10、100、1 000 ng/mL的PRL處理的BMECs中p-JAK2的蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01);p-STAT5的蛋白表達(dá)量隨著PRL濃度增加呈先升高后下降的趨勢(shì),10和1 000 ng/mL的PRL處理的BMECs中p-STAT5的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05),100 ng/mL的PRL處理的BMECs中p-STAT5的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著升高(P<0.01);隨著PRL濃度的升高,LF的蛋白表達(dá)量呈逐漸上升的趨勢(shì),100和1 000 ng/mL的PRL處理的BMECs中LF的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著升高(P<0.01),10 ng/mL的PRL處理的BMECs中LF的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比升高,但無顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同濃度催乳素處理BMECs中LF、JAK2和STAT5蛋白表達(dá)的結(jié)果

2.5 PRL和Pimozide對(duì)BMECs中LF和p-STAT5相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果(圖5)顯示,與對(duì)照組相比,Pimozide組BMECs中p-STAT5的相對(duì)熒光強(qiáng)度極顯著降低(P<0.01),PRL組BMECs中p-STAT5的相對(duì)熒光強(qiáng)度極顯著升高(P<0.01),Pimozide+PRL組p-STAT5的相對(duì)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)。

由圖6可知,Pimozide組LF的相對(duì)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05),PRL組LF的相對(duì)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比極顯著升高(P<0.01),Pimozide+PRL組LF的相對(duì)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)。

2.6 Pimozide對(duì)BMECs中LF含量的影響

由圖7-A可知,在用Pimozide處理上皮細(xì)胞24 h后,與對(duì)照組相比,Pimozide組細(xì)胞上清液中LF含量極顯著下調(diào)(P<0.01),PRL組細(xì)胞上清液中LF含量極顯著上調(diào)(P<0.01)。由圖7-B可知,與對(duì)照組相比,Pimozide組LF基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),PRL組LF基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。由圖8-A和圖8-B可知,Pimozide組LF的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著降低(P<0.01),PRL組LF的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著升高(P<0.01),Pimozide+PRL組LF的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明,STAT5抑制細(xì)胞模型構(gòu)建成功,且抑制JAK2/STAT5信號(hào)通路部分抑制BMECs中LF的合成和分泌。

圖7 PRL和匹莫齊特對(duì)BMECs中LF含量及基因表達(dá)的影響

圖8 PRL和匹莫齊特對(duì)BMECs中LF蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

BMECs合成和分泌乳蛋白是復(fù)雜的過程,受到多種因素的影響。早期通過隔絕細(xì)胞與基質(zhì)的接觸途徑的方式,通過引起細(xì)胞形態(tài)變化而直接影響著細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,這種調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀的方式也被證明可以調(diào)節(jié)其細(xì)胞功能[25-26]。乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)具有其他貼壁細(xì)胞類型相似的特性,都是極其容易受到周圍細(xì)胞密度和細(xì)胞外基質(zhì)變化的影響。與牛奶中的β-酪蛋白和乳清蛋白不同,LF在乳房發(fā)育過程中由乳腺上皮細(xì)胞大量合成和分泌,乳腺上皮細(xì)胞形狀的改變與LF的表達(dá)息息相關(guān)[27]。此外,乳腺上皮細(xì)胞中的細(xì)胞形狀和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改變可以介導(dǎo)LF的表達(dá)[28]。本試驗(yàn)通過組織塊貼壁法提取原代BMECs,經(jīng)過純化培養(yǎng)后進(jìn)行LF的檢測(cè)。通過與前人ELISA檢測(cè)BMECs中LF分泌量相比,本試驗(yàn)純化的細(xì)胞分泌LF的能力與其他人差異不大[29]。因此,本試驗(yàn)獲得純化細(xì)胞形態(tài)良好的BMECs用于后續(xù)檢測(cè)調(diào)控LF合成和分泌的機(jī)制研究。

乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和蛋白質(zhì)的合成分泌受到細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞形態(tài)、多肽類和類固醇類激素等多種因素的調(diào)控[30]。JAK2/STAT5信號(hào)通路參與乳腺上皮細(xì)胞的增殖、分化和乳蛋白的合成分泌。有研究報(bào)道,STAT5促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖,JAK2/STAT5途徑的抑制會(huì)破壞乳腺形態(tài)發(fā)生和分化,抑制STAT5活化會(huì)減弱小鼠乳腺上皮細(xì)胞的增殖[31-32]。同時(shí),STAT5除了對(duì)乳腺發(fā)育很重要,也被認(rèn)為是參與調(diào)節(jié)和控制哺乳動(dòng)物乳蛋白合成的主要因子[33]。前人的結(jié)果表明,炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子、氨基酸和激素等都可以通過STAT5的活化調(diào)控牛奶蛋白的合成和分泌[34-36]。PRL是一種由垂體、乳腺、肝臟和性腺等組織分泌的多肽類激素,參與多種生理功能,包括葡萄糖和脂質(zhì)代謝作用、泌乳和性腺功能以及免疫調(diào)節(jié)作用等[37-38]。Lollivier等[39]試驗(yàn)結(jié)果顯示,喹那啉內(nèi)酯可以減少奶牛的產(chǎn)奶量并抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞中α-乳清蛋白和κ-酪蛋白的基因表達(dá)。不同濃度的PRL和賴氨酸組合升高體外BMECs中LF、β-酪蛋白和α-乳白蛋白的基因表達(dá)[17]。目前已知PRL、STAT5和乳蛋白之間存在交互網(wǎng)絡(luò),因此我們研究了PRL調(diào)控LF合成和分泌的機(jī)制,探究JAK2/STAT5信號(hào)通路與LF之間的作用關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度的PRL處理BMECs后可以提高LF的含量,且10、100、1 000 ng/mL PRL可以促進(jìn)LF、PRLR、JAK2和STAT5的基因表達(dá),p-JAK2、p-STAT5和LF的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

同時(shí),LF基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)除了STAT5,還具有類固醇激素、感染應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子等多個(gè)重復(fù)元件和結(jié)合位點(diǎn)[40]。其中牛LF基因啟動(dòng)子區(qū)域的類固醇激素結(jié)合位點(diǎn)包括雌激素受體結(jié)合位點(diǎn)和糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合位點(diǎn)。在鼠LF的啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)的雌激素受體結(jié)合元件能夠以受體和激素依賴的方式上調(diào)鼠乳鐵蛋白的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄過程[41]。此外,乳腺上皮細(xì)胞中LF的表達(dá)和產(chǎn)生受到LPS的刺激,牛乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)錄活性可被LPS通過牛乳鐵蛋白啟動(dòng)子區(qū)域上的核因子-κB(NF-κB)結(jié)合位點(diǎn)誘導(dǎo),且具有劑量依賴性[42]。因此,為了進(jìn)一步對(duì)LF基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)進(jìn)行分析。本試驗(yàn)添加了Pimozide處理BMECs。通過ELISA、qRT-PCR、免疫熒光技術(shù)和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,添加Pimozide抑制了LF的合成和分泌。

綜上所述,PRL對(duì)于LF的轉(zhuǎn)錄和分泌過程發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明,PRL通過JAK2/STAT5途徑,促進(jìn)LF的合成和分泌,從而導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量的升高。通過對(duì)PRL調(diào)控LF機(jī)制的深入研究,有助于激素與LF之間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,為調(diào)控牛奶中LF的含量提供理論依據(jù),豐富了體外調(diào)節(jié)LF基因表達(dá)和分泌的理論知識(shí)。通過明確了PRL促進(jìn)LF合成和分泌的機(jī)制,在生產(chǎn)實(shí)踐中可以使用多巴胺受體抑制劑提高奶牛PRL分泌量進(jìn)而提高奶產(chǎn)量和LF產(chǎn)量,也可以使用合成生物技術(shù)在構(gòu)建的基盤細(xì)胞或元件中過表達(dá)STAT5結(jié)合位點(diǎn)序列,在PRL環(huán)境下大量分泌LF。因此,通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平或體外構(gòu)建過表達(dá)STAT5的方式,發(fā)揮激素調(diào)控LF合成和分泌的作用,將對(duì)我國(guó)牛奶功能性蛋白含量的提高和我國(guó)奶業(yè)持續(xù)健康的發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。

4 結(jié) 論

添加10、100、1 000 ng/mL PRL處理BMECs可以促進(jìn)LF的合成和分泌,其中100 ng/mL PRL處理結(jié)果最佳,并且STAT5抑制后,試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞中LF的表達(dá)下降。因此,PRL通過JAK2/STAT5信號(hào)通路促進(jìn)BMECs中LF合成和分泌。