劉禹彤 楊冠華 張 菊 李玉鵬 喬家運* 李?；?/p>

(1.天津師范大學生命科學學院,天津市動物多樣性保護與利用重點實驗室,天津 300387;2.天津市寶坻區(qū)農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊,天津 301800;3.天津市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300381;4.天津市畜禽分子育種與生物技術(shù)重點實驗室,天津 300381;5.天津市畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心,天津 300381;6.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院,天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室,天津 300384)

氧化應激是指機體氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡造成機體損傷的過程,在此過程中產(chǎn)生的大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)若不能被機體自身抗氧化系統(tǒng)及時清除,就會造成ROS在細胞內(nèi)過量積累,導致細胞DNA損傷、線粒體損傷、蛋白質(zhì)降解和脂質(zhì)過氧化等[1]。仔豬在生長發(fā)育過程中可能會遭受多種因素的應激,如病原微生物感染、斷奶[2]、飼養(yǎng)環(huán)境改變[3]和運輸[4]等,這些應激通常會影響仔豬的腸道健康。腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所,也是仔豬應激反應的主要部位。仔豬腸道健康狀況直接影響著養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益,因此,在仔豬生產(chǎn)中,維護腸道健康至關(guān)重要。

為提高仔豬腸道健康,近年來一些新型綠色飼料添加劑在生產(chǎn)中被廣泛應用,如植物精油和有機酸等。肉桂醛(cinnamic aldehyde,CA)是從肉桂等植物中所提取的一種精油,CA能改變大腸桿菌的細胞膜通透性及細胞壁的狀態(tài),導致細胞內(nèi)容物泄漏,生存力降低[5],其結(jié)構(gòu)中的醛基也能與菌體蛋白質(zhì)功能基團產(chǎn)生化學反應,抑制代謝過程中相關(guān)酶的活性,進而使蛋白完全失活[6];CA與羰基直接相連的α-碳原子上的氫具有較強氧化還原性,可使ROS成為穩(wěn)定物,從而減少ROS對細胞造成的氧化損傷[7]。富馬酸(fumaric acid,FA)又名延胡索酸,是一種常見的有機酸化劑,可調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)的酸堿平衡輔助改善動物消化系統(tǒng)功能并參與生物體內(nèi)的糖異生過程,也是機體內(nèi)三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物,生能途徑較葡萄糖短,可在應激狀態(tài)下緊急合成ATP,作為抗應激劑迅速為機體供能減少因各種應激反應而造成的動物損傷[8]。研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加延胡索酸可以提高熱應激肉雞的體增重及機體抗氧化和免疫能力,同時降低料重比[9]。植物精油和有機酸單獨或組合使用可用于改善動物的腸道健康,并且不同類型的植物精油和有機酸復配具有協(xié)同效應[10-11]。研究表明,CA與甲酸、乙酸、丙酸聯(lián)用能夠提高仔豬的腸道健康[12],和檸檬酸聯(lián)用可破壞病原體的細胞結(jié)構(gòu),和檸檬酸、山梨酸、蘋果酸、FA聯(lián)用可改善斷奶仔豬的生長性能,并調(diào)節(jié)仔豬的菌群群落[13]。然而,CA與FA聯(lián)用對IPEC-J2細胞的作用尚未見報道。基于CA良好的抑菌和抗氧化作用及FA的抗應激作用,推測CA和FA聯(lián)用對調(diào)節(jié)ETEC K88誘導IPEC-J2細胞氧化應激具有有益作用。因此,本研究以豬腸上皮細胞IPEC-J2為模型,探索FA和CA聯(lián)用對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)K88誘導IPEC-J2細胞氧化應激的調(diào)節(jié)作用,同時以核因子-κB抑制因子激酶(IKK)/核因子-κB抑制因子α(IκBα)/核因子-κB(NF-κB)信號通路為切入點,探索FA和CA聯(lián)用調(diào)節(jié)細胞氧化應激的分子機制,為FA和CA在動物生產(chǎn)上的聯(lián)合應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞和菌株

IPEC-J2細胞購于上海冠導生物工程有限公司。ETEC K88為天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院實驗室保存菌株。細胞培養(yǎng)方法與細菌活化方法參照Qiao等[14]的方法。

1.2 試驗試劑

RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細胞消化液均購自美國Gibco公司;青鏈霉素、二甲基亞砜(DMSO)均購自北京索萊寶科技有限公司;細胞增殖-毒性檢測試劑盒CCK-8購自東仁化學科技(上海)有限公司;熱休克蛋白70(Hsp70)抑制劑VER155008購自Sigma公司;CA和FA由廈門中農(nóng)科化新材料有限公司提供。

1.3 FA與CA最佳復配濃度及培養(yǎng)時間的篩選

將IPEC-J2細胞接種于96孔板中培養(yǎng)(5×104個/mL),將不同添加濃度的FA和CA添加至細胞培養(yǎng)基中,分別培養(yǎng)12和24 h,然后按照CCK-8試劑盒說明書計算細胞活力,根據(jù)細胞活力結(jié)果確定FA與CA最佳復配濃度及培養(yǎng)時間。

1.4 FA與CA抑制ETEC K88黏附IPEC-J2細胞能力的測定

將IPEC-J2細胞分別接種于2塊24孔板中,待細胞融合至80%,加入最佳復配濃度的FA與CA置細胞培養(yǎng)箱孵育12 h,用ETEC K88(濃度為1×103CFU/mL)感染細胞3、6、12和24 h;感染結(jié)束后參照Qiao等[14]的方法測定FA與CA抑制ETEC K88黏附IPEC-J2細胞的能力。

1.5 試驗設(shè)計

試驗分為3組,分別是非處理的對照組、FA與CA調(diào)節(jié)ETEC K88感染細胞組(FC+ETEC組)和ETEC K88感染細胞組(ETEC組)。細胞貼壁24 h后對照組添加DMSO繼續(xù)培養(yǎng)24 h;ETEC組用ETEC K88(濃度為1×103CFU/mL)感染細胞3、6、12和24 h;FC+ETEC組加入最佳復配濃度的FA與CA置細胞培養(yǎng)箱孵育12 h,用ETEC K88(濃度為1×103CFU/mL)感染細胞3、6、12和24 h。感染結(jié)束后無菌收集細胞和上清進行后續(xù)試驗。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 炎性細胞因子含量檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測細胞培養(yǎng)上清液中的白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)含量,按照ELISA檢測試劑盒(購自美國BD公司)操作說明進行檢測。

1.6.2 IKK/IκB/NF-κB信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量的測定

以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中IKKα、IKKβ、IκBα、NF-κBp65和Hsp70 mRNA相對表達量。相關(guān)引物設(shè)計、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR反應條件和相對定量法2-△△Ct法的計算參照Qiao等[14]的方法。引物序列信息見表1,Hsp70擴增引物為本試驗使用Primer 5.0設(shè)計。所用RT-qPCR試劑盒均購自美國GeneCpoeia公司。

表1 RT-qPCR引物序列

1.6.3 細胞中氧化應激蛋白超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量檢測

采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中的SOD、GSH-Px活性和MDA含量,按照ELISA檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)操作說明進行操作。

1.7 Hsp70在FA與CA調(diào)節(jié)ETEC K88感染的IPEC-J2 細胞氧化應激中的作用

使用Hsp70抑制劑VER155008(10 μmol/L)或DMSO(10 μmol/L)處理細胞6 h,再用ETEC K88感染IPEC-J2細胞,感染12 h后收集細胞及其培養(yǎng)上清液。試驗分為7組,即非處理的對照組(僅添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、DMSO組(僅用DMSO處理細胞)、VER組(僅用Hsp70抑制劑處理細胞)、DMSO+ETEC組(先用DMSO處理細胞,再用ETEC K88感染細胞)、VER+ETEC組(先用Hsp70抑制劑處理細胞,再用ETEC K88感染細胞)、DMSO+FC+ETEC組(先用DMSO處理細胞,再用FA與CA孵育細胞,最后用ETEC K88感染細胞)和VER+FC+ETEC組(先用Hsp70抑制劑處理細胞,再用FA與CA孵育細胞,最后用ETEC K88感染細胞),每組3個重復。按照上述ELISA法檢測SOD、GSH-Px活性和MDA含量,采用RT-qPCR檢測細胞中IKKα、IKKβ、IκBα和NF-κBp65的mRNA相對表達量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行初步處理,采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD法進行多重比較,采用GraphPad Prism 5軟件進行圖像處理及分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA與CA最佳復配濃度及培養(yǎng)時間的篩選

細胞活力測定結(jié)果如圖1所示。FA處理細胞12和24 h時,1.00 mg/mL FA組的細胞活力顯著高于其他各組(P<0.05);但2.00 mg/mL FA組的細胞活力顯著低于其他各組(P<0.05),說明2.00 mg/mL FA處理對IPEC-J2細胞的生長具有抑制作用。CA處理細胞12和24h時,1.00和2.00 μL/mL CA組的細胞活力顯著高于其他各組(P<0.05);但CA處理細胞24 h時,1.00 μL/mL CA組的細胞活力顯著高于2.00 μL/mL CA組(P<0.05)。在細胞培養(yǎng)時間上,FA和CA處理的結(jié)果都顯示12 h時的細胞活力高于24 h時的細胞活力。因此在后續(xù)試驗中,確定FA添加濃度為1.00 mg/mL,CA添加濃度為1.00 μL/mL,細胞培養(yǎng)時間為12 h。

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

2.2 FA與CA對ETEC K88黏附IPEC-J2細胞的影響

FA與CA處理細胞3、6、12和24 h對ETEC K88黏附IPEC-J2細胞的影響如圖2所示,ETEC K88對經(jīng)FA與CA預處理后的IPEC-J2細胞黏附率有不同程度的降低,與ETEC組相比,FC+ETEC組的細胞黏附率在3、12和24 h時均顯著降低(P<0.05),在6 h時極顯著降低(P<0.01)。試驗結(jié)果表明,FA與CA復配能夠有效抑制ETEC K88黏附IPEC-J2細胞,并以ETEC K88感染細胞6 h時其黏附率降低為最多。

圖2 FA與CA對ETEC K88黏附IPEC-J2細胞的影響

2.3 FA與CA對ETEC K88感染IPEC-J2細胞產(chǎn)生炎性細胞因子的影響

如圖3所示,與對照組相比,ETEC組IL-8和TNF-α含量極顯著提高(P<0.01),IL-10和TGF-β含量極顯著降低(P<0.01);與ETEC組相比,FC+ETEC組IL-8和TNF-α含量極顯著降低(P<0.01),IL-10和TGF-β含量極顯著提高(P<0.01)。結(jié)果表明,ETEC K88感染可促進IPEC-J2細胞產(chǎn)生促炎性因子IL-8和TNF-α,在此基礎(chǔ)添加FA與CA可有效抑制IPEC-J2細胞產(chǎn)生促炎性因子IL-8和TNF-α并促進IPEC-J2細胞釋放抗炎因子IL-10和TGF-β,緩解ETEC K88對IPEC-J2細胞造成的損傷。

圖3 FA與CA對ETEC K88感染IPEC-J2細胞產(chǎn)生炎性細胞因子的影響

2.4 FA與CA對ETEC K88感染IPEC-J2細胞中IKK/IκB/NF-κB信號通路活化的影響

如圖4所示,與對照組相比,ETEC組NF-κBp65和IKKβmRNA相對表達量在6、12和24 h時顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01),IKKαmRNA相對表達量在3、6、12和24 h時顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01),IκBαmRNA相對表達量在6、12和 24 h時極顯著降低(P<0.01),Hsp70 mRNA相對表達量在3、6、12和24 h時顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

圖4 FA與CA對ETEC K88感染IPEC-J2細胞中IKK/IκB/NF-κB信號通路活化的影響

與ETEC組相比,FC+ETEC組NF-κBp65 mRNA相對表達量在6、12和24 h時顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),IKKαmRNA相對表達量在3、6、12和24 h時顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),IKKβmRNA相對表達量均無顯著變化(P>0.05),IκBαmRNA相對表達量在6、12和24 h時均極顯著升高(P<0.01),Hsp70 mRNA相對表達量在3、6、12和24 h時顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

結(jié)果表明,ETEC K88能引起IPEC-J2細胞IκBα和Hsp70 mRNA相對表達量降低,以及引起NF-κBp65、IKKα和IKKβmRNA相對表達量升高;添加FA與CA可上調(diào)ETEC K88感染細胞中Hsp70 mRNA相對表達量,降低NF-κBp65和IKKαmRNA相對表達量并穩(wěn)定IκBαmRNA相對表達量。

2.5 FA與CA對ETEC K88感染IPEC-J2細胞中氧化應激蛋白SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

如圖5所示,與對照組相比,ETEC組的MDA含量極顯著升高(P<0.01),SOD和GSH-Px活性均極顯著降低(P<0.01);與ETEC組相比,FC+ETEC組的MDA含量極顯著降低(P<0.01),SOD和GSH-Px活性均顯著升高(P<0.05)。試驗結(jié)果表明,ETEC K88能引起IPEC-J2細胞MDA含量升高,以及SOD和GSH-Px活性下降,添加FA與CA可逆轉(zhuǎn)ETEC K88感染IPEC-J2細胞引起的MDA含量升高,以及SOD和GSH-Px活性降低。

圖5 FA與CA對ETEC K88感染IPEC-J2細胞中氧化應激蛋白SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

2.6 Hsp70在FA與CA調(diào)節(jié)ETEC K88感染的IPEC-J2細胞氧化應激中的作用

ETEC K88處理細胞后采用Hsp70抑制劑處理細胞,以確定Hsp70在FA與CA緩解ETEC K88誘導IPEC-J2氧化應激中的作用,結(jié)果如圖6所示。與對照組相比,VER組的IKKαmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05),IκBαmRNA相對表達量、SOD和GSH-Px活性呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05);DMSO+ETEC組的IKKα、IKKβ、NF-κBp65 mRNA相對表達量和MDA含量顯著升高(P<0.05),IκBαmRNA相對表達量、SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。與DMSO+ETEC組相比,VER+ETEC組的MDA含量顯著升高(P<0.05),IKKα、IKKβ、NF-κBp65 mRNA相對表達量以及GSH-Px活性均無顯著差異(P>0.05),同時IκBαmRNA相對表達量和SOD活性顯著降低(P<0.05)。與DMSO+ETEC組相比,DMSO+FC+ETEC組的IKKα、IKKβ、NF-κBp65 mRNA相對表達量及MDA含量均顯著降低(P<0.05),IκBαmRNA相對表達量及SOD和GSH-Px活性均顯著升高(P<0.05)。與VER+ETEC組相比,VER+FC+ETEC組的IKKα、IKKβ、NF-κBp65 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05),IκBαmRNA相對表達量及SOD和GSH-Px活性均顯著升高(P<0.05)。

圖6 Hsp70在FA與CA調(diào)節(jié)ETEC K88感染的IPEC-J2細胞氧化應激中的作用

3 討 論

在仔豬的生長發(fā)育過程中,飼養(yǎng)管理水平、病理和環(huán)境等因素均能誘導仔豬發(fā)生氧化應激,氧化應激的發(fā)生會引起斷奶仔豬肝臟抗氧化酶活性降低和羥自由基抑制能力下降,造成腸道和肝臟的病理性損傷,嚴重阻礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。為防止氧化應激對機體造成的影響,機體具有一套完整的抗氧化系統(tǒng)。SOD、GSH-Px和過氧化氫酶(CAT)是抗氧化系統(tǒng)中的重要組分,是機體抵御氧化應激的第一道防線,可消除超氧化物和羥基自由基。SOD可以歧化超氧化物加氧生成過氧化氫,保護細胞免受超氧化物介導的細胞毒性[17];谷胱甘肽(GSH)是細胞質(zhì)、細胞核和線粒體中最常見的非酶性抗氧化物,通過GSH-Px清除過氧化氫[18];機體脂質(zhì)物質(zhì)發(fā)生過氧化反應時會產(chǎn)生醛類物質(zhì)MDA,該物質(zhì)可反映機體過氧化程度[19]。SOD、GSH-Px和MDA的水平常被用于評估組織或細胞中的氧化應激水平[20]。

研究表明,補充外源性抗氧化劑能夠改善腸道炎癥和黏膜損傷,減輕氧化應激[21],利用植物精油和有機酸為主的天然產(chǎn)物是保持仔豬腸道健康的新趨勢。FA和CA對動物具有多種有益作用,FA學名反丁烯二酸,它是琥珀酸-丙酸途徑的關(guān)鍵中間產(chǎn)物,作為三羧酸循環(huán)(TCA)的中間產(chǎn)物,廣泛存在于生物組織中,可直接參與機體生理生化反應,應激狀態(tài)下可用于ATP的緊急生成,與礦物質(zhì)元素生成絡合物從而提高礦物質(zhì)元素的吸收率[22]。據(jù)報道,早期斷奶仔豬消化系統(tǒng)和免疫器官發(fā)育不完善,消化道中酶和胃酸的分泌量不足,胃蛋白酶的活性低使蛋白質(zhì)消化率降低,導致仔豬消化不良和大腸桿菌病的發(fā)生[23],FA可通過降低胃內(nèi)pH增強胃內(nèi)多種消化酶活性,提高仔豬對飼糧蛋白質(zhì)的利用率,抑制有害菌的生長,促進有益菌的生長,使胃腸道菌群維持平衡[22]。CA是一種植物提取物,可通過改變有害菌細胞膜或細胞壁的狀態(tài)來抑菌,也可通過改變機體的氧化還原狀態(tài)來調(diào)控機體的健康,具有抑菌、抗炎等多種生物學活性[24]。研究發(fā)現(xiàn),在大鼠腸道黏膜液、漿膜液和腸道組織勻漿液中加入CA,肉桂酸的產(chǎn)量及產(chǎn)生速率快速增加,表明CA可以在小腸細胞中可轉(zhuǎn)化為肉桂酸發(fā)揮作用[25]。有研究表明,CA可提高CAT活性和SOD并消除過量的ROS,降低MDA含量[26],還可激活抗氧化防御系統(tǒng),降低大鼠肝臟TNF-α和MDA含量,提高GSH-Px和CAT活性,抑制促炎性細胞因子的產(chǎn)生[27]。在飼糧中添加CA可降低肉兔十二指腸和空腸MDA含量,提高空腸GSH-Px活性,降低腸道氧化應激,改善小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu),且將CA和凝結(jié)芽孢桿菌組合添加改善效果更優(yōu)[28]。本研究以IPEC-J2細胞為模型,探索CA和FA聯(lián)用對ETEC K88誘導IPEC-J2細胞氧化應激的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),FA與CA預處理可顯著降低ETEC K88感染的IPEC-J2細胞MDA含量,提高SOD和GSH-Px活性,表明FA與CA聯(lián)用可有效緩解IPEC-J2細胞氧化應激。

NF-κB是一種蛋白質(zhì)復合物,廣泛存在于真核細胞內(nèi),參與動物和人體多種生物學過程,例如,調(diào)節(jié)多種細胞因子、生化因子及酶等基因表達,在應激反應、免疫應答和細胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[29]。NF-κB信號通路主要由NF-κB、IκB、IKK 3種信號分子組成,是重要的炎癥信號通路[30-32]。NF-κB信號通路胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制已被廣泛研究。正常情況下,NF-κB與抑制劑IκB結(jié)合而保留在細胞質(zhì)中[33],當受到細胞外信號刺激,如病原體相關(guān)分子模式或細胞因子,IKK首先磷酸化,然后磷酸化的IKK進一步磷酸化IκB,進而IκB與NF-κB分離,導致NF-κB易位到細胞核并觸發(fā)靶基因轉(zhuǎn)錄[34]。p65是NF-κB家族成員之一,其對應的核轉(zhuǎn)位是NF-κB通路被有效激活的關(guān)鍵標志[35]。NF-κB調(diào)節(jié)免疫介質(zhì)的表達并驅(qū)動單核細胞分化為M1或M2巨噬細胞,M1巨噬細胞主要產(chǎn)生白細胞介素-6(IL-6)、IL-8、TNF-α等促炎細胞因子,激活先天免疫;M2巨噬細胞主要分泌IL-10等抗炎細胞因子,使機體恢復到正常免疫和生理水平[36]。促炎細胞因子與抗炎細胞因子的平衡有助于控制炎癥的發(fā)展,因此,減少促炎性細胞因子的分泌,提高抗炎性細胞因子的生成可能是調(diào)節(jié)ETEC K88誘導IPEC-J2細胞氧化應激的有效方法。本試驗中觀察到,在ETEC K88誘導的IPEC-J2細胞氧化應激模型中,促炎性細胞因子IL-8和TNF-α含量顯著提高,抗炎性細胞因子IL-10和TGF-β等含量顯著降低,與前人的研究結(jié)果[37-38]一致;同時,本試驗顯示,添加FA與CA可以顯著提高抗炎性細胞因子IL-10和TGF-β含量,并顯著降低促炎性細胞因子IL-8和TNF-α含量,表明FA與CA對ETEC K88誘導的IPEC-J2細胞的炎癥反應有積極的調(diào)節(jié)作用。

熱休克蛋白是一類高度保守的應激蛋白,Hsp70是迄今為止已知的最高度保守的蛋白,在應激條件下(如紫外線輻射、細菌感染或炎癥)對細胞具有保護作用,如提高細胞對損傷的耐受和應激能力[39]。近年來,多項研究表明Hsp70與抗氧化應激相關(guān),例如,Mesalam等[40]研究發(fā)現(xiàn),鉛中毒可造成小鼠產(chǎn)生氧化應激并誘導Hsp70和炎癥標志物的表達,而抗氧化劑硒和維生素E組合對小鼠鉛中毒具有協(xié)同保護作用。目前,越來越多的研究表明,高水平的Hsp70對細胞具有保護作用,其保護機制與Hsp70直接調(diào)控特定的細胞信號通路有關(guān),且可能與調(diào)節(jié)NF-κB活性有關(guān)[41]。Bao等[42]早期研究表明,Hsp70在肝損傷小鼠中分別與IKKα和IκBα相互作用,從而抑制IκB降解和NF-κB活化。Lyu等[43]研究發(fā)現(xiàn),Hsp70上調(diào)可顯著抑制脂多糖(LPS)誘導的促炎介質(zhì)TNF-α和IL-6的表達,以及犬巨噬細胞中的NF-κB活化。Bhagat等[44]研究表明,Hsp70通過阻止NF-κB活化來預防急性胰腺炎;Zhou等[45]研究發(fā)現(xiàn),香葉基丙酮可誘導Hsp70表達,并通過抑制NF-κB/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)/ROS信號通路減輕肺纖維化;Li等[46]研究發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺通過促進Hsp70的表達緩解多鱗鲃毒液引起的谷氨酰胺代謝紊亂和心肺損傷,并抑制NF-κB p65和p53的活化延緩蛇毒的過程,降低死亡率。然而,Hsp70是否參與調(diào)節(jié)豬氧化應激仍未見報道。本試驗發(fā)現(xiàn),FA與CA能上調(diào)ETEC K88造成的Hsp70的mRNA相對表達量的下降,通過消耗IKKα穩(wěn)定IκBα抑制NF-κB信號通路的激活。另外,本研究通過抑制Hsp70的表達,檢測Hsp70對NF-κB信號通路的作用,試驗結(jié)果表明,DMSO與ETEC K88共同處理和Hsp70抑制劑與ETEC K88共同處理均會激活NF-κB信號通路并降低上清液中抗氧化酶的活性,Hsp70抑制劑單獨處理能降低上清液中抗氧化酶的活性,而FA與CA共同處理后上清液中抗氧化酶活性上調(diào)且NF-κB信號通路的激活被抑制,FA與CA共同處理與Hsp70在激活NF-κB信號通路方面具有相似的作用。這表明,抑制Hsp70的表達會加重ETEC K88造成的IPEC-J2細胞氧化應激,FA與CA可通過上調(diào)Hsp70抑制NF-κB信號通路的激活緩解這種氧化應激。

4 結(jié) 論

FA與CA聯(lián)用可調(diào)節(jié)炎性細胞因子和氧化應激蛋白平衡,抑制ETEC K88黏附IPEC-J2細胞,可能通過上調(diào)Hsp70抑制NF-κB信號通路增強IPEC-J2細胞的抗炎與抗氧化能力,緩解ETEC K88誘導的IPEC-J2細胞氧化應激。