龍 熙 孫文陽 潘紅梅 張 亮 陳四清 涂 志 郭宗義

(重慶市畜牧科學院,重慶 402460)

微小RNA(microRNA,miRNA)是動物內一類內源性的單鏈非編碼RNA,長度22個堿基左右。miRNA與Argonaute(AGO)蛋白結合形成的RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)可以通過種子序列與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)(UTR)結合,從而發(fā)揮降解mRNA或抑制翻譯的功能,在轉錄后水平上抑制基因的表達[1-3]。miRNA廣泛分布于動物體內,幾乎參與了動物體內所有的生物學過程,具有重要的生物學功能[4-5]。動物體內經典的miRNA生物學加工過程主要有4步:1)在細胞核內RNA聚合酶Ⅱ的作用下,miRNA基因轉錄形成miRNA初級轉錄本(pri-miRNA)[6];2)pri-miRNA隨后被“微處理器(microprocessor)”[由核糖核酸酶Ⅲ Drosha及其輔酶DiGeorge綜合征關鍵區(qū)域8(DGCR8)構成)]剪切形成“發(fā)卡”狀的miRNA前體(pre-miRNA)[7-8]];3)pre-miRNA被轉運至細胞質被另外一種核糖核酸酶Ⅲ Dicer剪切成小的雙鏈RNA[9];4)小雙鏈miRNA裝載進入AGO蛋白,AGO蛋白會選擇其中一條單鏈RNA最終形成RISC,另一條被釋放[10-11]。

miRNA介導的基因表達沉默是一種重要的表觀遺傳調控方式,廣泛參與調控家畜的胚胎發(fā)育、肌肉生長、脂肪沉積、繁殖和免疫反應等過程[12-13]。miRNA的生物學加工過程(表達)受到了精密調控,種子序列、成熟體或前體部位的突變都可能會影響其加工過程,甚至影響其功能發(fā)揮[14-15]。一些miRNA或其靶基因3′ UTR miRNA結合位點的突變與家畜能量代謝和生產性能的改變密切相關。微小RNA-378(miR-378)被報道在動物脂肪組織中高表達,參與調控脂肪細胞的能量代謝和脂質合成[16-17],其表達量與家畜的背膘厚度顯著相關[18];有研究報道,豬miR-378種子序列上1個A>G的突變能夠抑制脂肪細胞的脂肪合成[19]。特克塞爾羊肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)基因3′ UTR發(fā)生1個G>A突變,產生了1個能與微小RNA-1(miR-1)和微小RNA-206(miR-206)結合的位點,肌肉組織中高表達的miR-1和miR-206與突變的3′ UTR結合抑制了MSTN的表達,從而使特克塞爾羊表現(xiàn)出優(yōu)良的產肉性能[20]。由此可見,miRNA基因突變對農業(yè)動物營養(yǎng)代謝和生產性能的影響是非常值得研究的。

微小RNA-15b(miR-15b)是調控細胞增殖凋亡和細胞周期的重要基因,在許多癌變組織中異常表達[21-24]。豬miR-15b位于3號染色體,與微小RNA-16-1(miR-16-1)成簇排列。miR-15b可以通過抑制叉頭框蛋白O1(Forkhead box protein O1,FOXO1)的表達,促進豬前體脂肪細胞的成脂分化[25]。本研究發(fā)現(xiàn),豬miR-15b前體(pre-miR-15b)基因位點第58位堿基發(fā)生了1個C>T突變(+58C>T),通過構建miR-15b野生型和突變型過表達載體,轉染豬原代前體脂肪細胞,探究此突變對miRNA生物學加工過程、miR-15b成熟體表達量以及豬前體脂肪細胞分化和脂肪合成的影響,從而揭示miRNA基因突變改變農業(yè)動物機體能量代謝和生產性能的潛在可能性,為今后農業(yè)動物miRNA基因突變的功能研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物和樣品采集

本試驗隨機選取500頭長白豬、500頭杜洛克豬(重慶市黔江區(qū)69豬場)和300頭榮昌豬(重慶市榮昌區(qū)國家級榮昌豬保種場)用于pre-miR-15b基因多態(tài)性、基因型及等位基因頻率分析。采用耳號鉗夾取試驗豬耳組織塊,用生理鹽水洗凈后置于盛有75%乙醇的離心管中,帶回實驗室于-20 ℃保存?zhèn)溆?。選取3頭3日齡榮昌豬(重慶市榮昌區(qū)國家級榮昌豬保種場)用于豬原代前脂肪細胞的分離:將3頭仔豬用新潔爾滅洗凈后窒息處死,再用75%的乙醇擦洗干凈后移至細胞間,取后頸部皮下白色脂肪組織。本研究的所有動物試驗均得到了重慶市畜牧科學院實驗動物倫理委員會的許可(審批編號:XKY-No.20220105)。

1.1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR反應體系(TaKaRa Ex Taq?)、T載體(pMD?19-T simple Vector)、miRNA表達質粒(pmR-mCherry)、mRNA反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)和熒光定量試劑盒(TB Green?Premix Ex TaqTM)購自寶生物工程(大連)有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)Top10感受態(tài)細胞(Top10 Competent Cell)購自康為世紀生物科技股份有限公司;限制性核酸內切酶XhoⅠ、BamHⅠ和T4 DNA連接酶購自NEB公司;膠回收試劑盒(E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit)、普通質粒提取試劑盒(E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit)和去內毒素質粒提取試劑盒(E.Z.N.A.?Endo-Free Plasmid Mini Kit)購自Omega公司;1×Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)緩沖液、胎牛血清、牛血清白蛋白、地塞米松、胰島素和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)購自Sigma公司;膠原蛋白酶D購自Roche公司;DMEM/F12購自Hyclone公司;轉染試劑LipofectamineTM2000和Trizol Reagent購自Invitrogen公司;miRNA反轉錄試劑盒(miScript?Ⅱ RT Kit)、miRNA熒光定量試劑盒(miScript?SYBR?Green PCR Kit)購自QIAGEN公司。

1.1.3 主要儀器

振蕩水浴鍋(Thermo Scientific),Centrifuge 5804 R冷凍離心機(Eppendorf),常溫離心機(Thermo Scientific);SW-CJ-1C型超凈工作臺(江蘇凈化設備有限公司);熒光顯微鏡(奧林巴斯),普通PCR儀與7900 HT熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬pre-miR-15b基因多態(tài)性分析

采用TIANamp Genomic DNA Kit提取豬耳組織基因組DNA。參照miRBase數據庫中pre-miR-15b的序列(登錄號:MI0002419),利用Ensembl數據庫的BLASTN工具將此序列對比到豬參考基因組(Sscrofa 11.1)上,并下載以pre-miR-15b為中心上下游各延伸200 bp的miR-15b初級轉錄本(pri-miR-15b)部分序列,用Primer 3.0在該pri-miR-15b序列上設計pre-miR-15b基因片段擴增引物(基因分型引物),引物序列如下:miR-15bFx-F,5′-GGTTCTCTCGTCCTTGTTTTTG-3′;miR-15bFx-R,5′-AGAGCGGAACAAGTATGTCAGT-3′。擴增片段長度為275 bp,引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。以基因組DNA為模板,miR-15bFx-F和miR-15bFx-R為引物,用TaKaRa Ex Taq?對pre-miR-15b基因片段進行擴增。PCR反應程序為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,合格的PCR產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行Sanger測序。測序結果利用MEGA5和Chromas進行基因多態(tài)性分析。

1.2.2 pre-miR-15b二級結構及其自由能預測

野生型和突變型pre-miR-15b的二級結構及自由能使用RNAfold(http://rna.tbi. univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)進行預測。

1.2.3 miR-15b表達載體的構建

參照miRBase數據庫pre-miR-15b的序列(登錄號:MI0002419),利用Ensembl數據庫的BLASTN工具將此序列對比到豬參考基因組(Sscrofa 11.1)上,并下載以pre-miR-15b為中心上下游各延伸300 bp的pri-miR-15b部分序列,用Primer 3.0在該pri-miR-15b序列上設計pri-miR-15b基因片段擴增引物(表達載體構建引物),引物序列如下:miR-15bPc-F,5′-CTCGAGCACATAAGTGGGAAGAAGAAGACA-3′;miR-15bPc-R,5′-GGATCCCAGGAAAAGGACTAT TGCAAGATAA-3′(下劃線部分分別為XhoⅠ和BamHⅠ的酶切位點)。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,擴增片段長度為559 bp(包含pre-miR-15b基因片段、miR-16-1前體(pre-miR-16-1)及部分上下游側翼片段,側翼區(qū)的存在可以保證miRNA被Drosha識別和剪切)。采用miR-15bPc-F和miR-15bPc-R對野生型和突變型豬的pre-miR-15b及其側翼區(qū)進行PCR擴增,PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并對目的片段進行膠回收,具體操作按照E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit說明書進行。將膠回收的DNA片段與T載體進行連接,隨后將重組T載體轉化入Top10感受態(tài)細胞,轉化后的感受態(tài)細胞37 ℃培養(yǎng)45 min(菌體復蘇),再均勻的涂抹在LB固體培養(yǎng)基(含氨芐西林)上,37 ℃培養(yǎng)12～16 h。待LB固體培養(yǎng)基長出菌落后,挑單菌落進行培養(yǎng),再利用miR-15bPc-F和miR-15bPc-R引物進行菌液PCR,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定出陽性克隆,陽性克隆的菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行Sanger測序,經Sanger測序確保插入的DNA片段無誤后,對陽性克隆的菌液進行擴大培養(yǎng),并使用E.Z.N.A.?Plasmid Mini Kit提取質粒。用XhoⅠ和BamHⅠ分別對插入野生型和突變型pre-miR-15b片段的T載體和pmR-mCherry進行雙酶切,膠回收野生型和突變型pri-miR-15b目的片段(559 bp)和pmR-mCherry酶切片段(約4 700 bp),再用T4連接酶將野生型和突變型pri-miR-15b DNA片段分別與pmR-mCherry酶切片段進行連接,隨后依次進行轉化、涂板、挑單菌落培養(yǎng)和質粒提取(方法同上);對提取出的質粒進行XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切,酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,依據DNA條帶數量和大小判定陽性克隆,分別將成功插入野生型和突變型pre-miR-15b DNA片段的重組質粒命名為pmR-miR-15bW和pmR-miR-15bM。將鑒定為陽性克隆的菌液擴大培養(yǎng),采用E.Z.N.A.?Endo-Free Plasmid Mini Kit提取質粒,用于細胞轉染試驗。

1.2.4 豬前脂肪細胞的分離培養(yǎng)

參照Sun等[26]的方法對豬前脂肪細胞進行分離,具體方法如下:用眼科剪刀將1.1.1中獲取的豬脂肪組織充分剪碎,加入含有1 mg/mL Ⅰ型膠原酶的HBSS,置于振蕩水浴鍋中消化45 min(37 ℃,200 r/min),將消化液轉移至超凈臺,加入與消化液等體積的含血清的F12培養(yǎng)基終止消化,用70 μm細胞篩過濾2次,濾液轉移至10 mL離心管中2 000 r/min離心10 min,棄上清加10 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞,重復清洗3次,清洗后的細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.2.5 細胞轉染

將分離的豬前脂肪細胞傳代至24孔板,待細胞長至80%左右進行轉染。用LipofectaminTM2000將600 ng的pmR-miR-15bW、pmR-miR-15bM和pmR-mCherry分別轉染細胞進行miR-15b的過表達試驗,每組設置5個生物學重復,轉染的具體操作參照LipofectaminTM2000說明書。細胞培養(yǎng)48 h后提取RNA。

1.2.6 總RNA提取、miRNA的反轉錄與實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

采用Trizol提取細胞的總RNA,具體操作參照其說明書。采用miScript?Ⅱ RT Kit對總RNA進行反轉錄(此試劑盒在反轉錄miRNA成熟體的同時也可以反轉錄pre-miRNA),并采用miScript?SYBR?Green PCR Kit在7900 HT熒光定量PCR儀上進行RT-qPCR,對miR-15b、微小RNA-16(miR-16)及pre-miR-15b的表達量進行檢測(每個基因設置3個技術性重復),各基因RT-qPCR qPCR引物見表1,具體反應體系和反應程序詳見試劑盒說明書。以pmR-mCherry自帶的紅色熒光蛋白基因為內參(此基因與插入基因共用一個啟動子,可以消除轉染效率的微弱差異引起的數據誤差),采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.7 前脂肪細胞的成脂誘導分化及成脂分化相關基因表達量的檢測

在誘導分化前先進行miR-15b的過表達試驗,方法和試驗分組同1.2.5,轉染24 h后更換為普通F12培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行成脂誘導分化。采用雞尾酒法進行誘導,先用誘導液Ⅰ(包含1 mmol/L地塞米松、5 mg/mL胰島素和0.5 mmol/L IBMX)培養(yǎng)2 d,然后更換為誘導液Ⅱ(包含5 mg/mL胰島素)培養(yǎng)4 d(每2 d更換1次誘導液),分別收集各組誘導前后的細胞提取總RNA。用PrimeScript?RT Master Mix將mRNA反轉錄為cDNA,隨后利用TB Green?Premix Ex TaqTM進行RT-qPCR,檢測成脂分化相關基因固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和脂肪細胞蛋白2(aP2),以及miR-15b靶基因FOXO1相對表達量(每個基因設置3個技術性重復),各基因引物序列見表2,具體反應體系和反應程序詳見試劑盒說明書。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。

表2 引物序列

表3 3個品種豬pre-miR-15b基因型和等位基因頻率

1.2.8 分化后脂肪細胞的油紅O染色

向培養(yǎng)皿中加入PBS漂洗2次分化后的細胞,加入4%多聚甲醛固定40 min;采用PBS漂洗2次,加0.3%油紅O染色40 min;再用PBS漂洗2次,隨后置于顯微鏡下觀察。

1.3 數據統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件中的獨立樣品t檢驗進行組間各基因相對表達量的差異顯著性分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 豬pre-miR-15b基因多態(tài)性及不同品種基因型和等位基因頻率分析

以3個品種豬(長白豬、杜洛克豬和榮昌豬)基因組DNA為模板,PCR擴增pre-miR-15b基因片段,Sanger測序結果發(fā)現(xiàn)pre-miR-15b第58位堿基發(fā)生了1個C>T突變(+58C>T),與豬參考基因組(Sscrofa 11.1)進行序列比對,發(fā)現(xiàn)CC基因型為野生型pre-miR-15b(pre-miR-15bW),TT基因型為突變型pre-miR-15b(pre-miR-15bM)(圖1)。3個品種豬pre-miR-15b基因型頻率和等位基因頻率見表1,+58C>T只發(fā)現(xiàn)于長白豬和杜洛克豬,而榮昌豬群體中未發(fā)現(xiàn)此突變。

圖1 豬pre-miR-15b基因序列的C>T突變

2.2 +58C>T對pre-miR-15b二級結構和熱力學穩(wěn)定性的影響

為了探究+58C>T對pre-miR-15b二級結構和熱力學穩(wěn)定性的影響,利用RNAfold對pre-miR-15bW和pre-miR-15bM的二級結構及自由能進行預測,結果發(fā)現(xiàn)+58C>T導致pre-miR-15bM二級結構出現(xiàn)了一個A-U堿基互補配對,替代了pre-miR-15bW的A-C堿基對,從而使自由能降低了14.38%,二級結構更加穩(wěn)定(圖2)。結果還發(fā)現(xiàn),+58C>T極大地降低了pre-miR-15b第39位和第58位堿基的熵值(圖3)。

pre-miR-15bW:野生型pre-miR-15b;pre-miR-15bM:突變型pre-miR-15b;G:自由能 free energy;1 kcal≈4.184 kJ。

圖3 pre-miR-15bW(左)和pre-miR-15bM(右)各位點的熵值

2.3 +58C>T對miR-15b成熟體表達量的影響

本試驗分別構建了野生型(pmR-miR-15bW)和突變型(pmR-miR-15bM)miR-15b過表達載體(miR-16-1與miR-15b同簇表達,所以此片段同時包含了miR-16-1基因片段)(圖4)。分離、培養(yǎng)豬原代前脂肪細胞,分別進行pmR-miR-15bW、pmR-miR-15bM及pmR-mCherry(對照組)質粒的細胞轉染試驗,每種處理設置5個生物學重復。利用RT-qPCR檢測各細胞內miR-15b和miR-16的相對表達量,結果發(fā)現(xiàn)pmR-miR-15bM組細胞miR-15b和miR-16的表達量均極顯著低于pmR-miR-15bW組(P<0.01),說明+58C>T阻礙了miR-15b的加工過程,降低了其表達量。

pre-miR-15b wild-type:野生型pre-miR-15b;pre-miR-15b mutant-type:突變型pre-miR-15b;pUC ori:復制起始點 replication origin;CMV promoter:巨細胞病毒啟動子。

pmR-miR-15bW:野生型miR-15b過表達載體;pmR-miR-15bM:突變型miR-15b過表達載體;*:P<0.05;**:P<0.01。圖7～圖9同 the same as Fig.7 to Fig.9.

2.4 +58C>T對miR-15b生物學加工過程的影響

為了探究+58C>T具體影響miR-15b生物學加工過程中的哪一過程,設計了pri-miR-15b-F1、pre-miR-15b-F2和pre-miR-15b-R這3個引物(圖6),利用RT-qPCR檢測分別轉染了pmR-miR-15bW、pmR-miR-15bM及pmR-mCherry質粒的豬前體脂肪細胞中pri-miR-15b和pre-miR-15b的相對表達量。利用引物pri-miR-15b-F1及pre-miR-15b-R檢測豬前體脂肪細胞中pri-miR-15b的相對表達量,發(fā)現(xiàn)pmR-miR-15bW組與pmR-miR-15bM組沒有顯著差異(P>0.05)(圖7),說明+58C>T并未影響miR-15b基因的轉錄過程。利用引物pre-miR-15b-F2及pre-miR-15b-R檢測pri-miR-15b與pre-miR-15b兩者總的表達量,發(fā)現(xiàn)pmR-miR-15bW組極顯著高于pmR-miR-15bM(P<0.01)(圖7),這說明+58C>T阻礙了pri-miR-15b到pre-miR-15b的加工過程,從而降低了miR-15b成熟體的表達量。

圖6 pre-miR-15b定量引物設計圖示

圖7 pri-miR-15b和pre-miR-15b的相對表達量

2.5 +58C>T對豬前體脂肪細胞成脂分化的影響

為了探究+58C>T對豬前體脂肪細胞成脂分化的影響,將豬前體脂肪細胞分別轉染pmR-miR-15bW、pmR-miR-15bM及pmR-mCherry后,再誘導前體脂肪細胞分化,隨后利用RT-qPCR,以β-actin為內參,檢測不同組細胞分化前后成脂分化相關基因(SREBP-1c、PPARγ和aP2),以及miR-15b靶基因FOXO1的相對表達量。結果表明:誘導分化前,3組細胞SREBP-1c、PPARγ和aP2相對表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖8-A～圖8-C);而pmR-miR-15bM組FOXO1相對表達量極顯著高于pmR-miR-15bW組(P<0.01),且這2組都極顯著低于pmR-mCherry組(P<0.01)(圖8-D)。誘導分化后,3組細胞SREBP-1c、、PPARγ和aP2相對表達量較分化前均表現(xiàn)出上調表達趨勢,pmR-miR-15bW組SREBP-1c和PPARγ相對表達量均顯著高于pmR-miR-15bM組(P<0.05),pmR-miR-15bW組和pmR-miR-15bM組SEBP-1c、PPARγ和aP2相對表達量都極顯著高于pmR-mCherry組(P<0.01)(圖8-A～圖8-C);3組細胞FOXO1相對表達量較分化前均表現(xiàn)出下調表達趨勢,pmR-mCherry組FOXO1相對表達量極顯著高于其他2組(P<0.01)(圖8-D)。用油紅O對成脂分化后3組細胞內的脂滴進行染色,結果發(fā)現(xiàn)pmR-miR-15bW組脂滴含量明顯高于pmR-miR-15bM組,且這2組脂滴含量均明顯高于pmR-mCherry組(圖9)。

圖9 油紅O染色結果

3 討 論

miRNA的生物學加工過程直接影響miRNA成熟體的表達量,且受到時空性的精密調控,這種動態(tài)調節(jié)使miRNA能夠靈活精確的調控其靶基因的表達[27]。miRNA基因序列的突變,包括pri-miRNA、pre-miRNA和miRNA成熟體(種子序列)上的突變都有可能影響其加工過程,或者影響miRNA與靶基因mRNA的結合,從而影響miRNA的生物學功能[15]。有研究發(fā)現(xiàn),人微小RNA-125a(miR-125a)種子序列上的1個G>U突變通過降低miR-125a初級轉錄本(pri-miR-125a)與DGCR8結合,阻礙了pri-miR-125a到miR-125a前體(pre-miR-125a)的加工過程,降低了miR-125a的表達量,減弱了其對靶基因的翻譯抑制作用[14]。還有研究發(fā)現(xiàn),人微小RNA-96(miR-96)種子序列上+13G>A和+14C>A 2個位點的突變可導致聽力喪失,這2個突變增加了miR-96前體(pre-miR-96)的熱力學穩(wěn)定性,體外細胞水平試驗發(fā)現(xiàn)這2個突變極大程度影響了miR-96的加工過程,降低miR-96成熟體表達量,且影響miRNA對靶基因轉錄后的抑制作用[28]。此外,一些發(fā)生在miRNA成熟體外的突變也能夠影響miRNA的加工過程和功能發(fā)揮。微小RNA-126(miR-126)初級轉錄本(pri-miR-126)上1個A>G突變(距miR-126成熟體3′末端24 bp)阻礙了pri-miR-126到miR-126前體(pre-miR-126)的加工過程,導致miR-126成熟體表達量下降,進而影響了其對靶基因的翻譯抑制作用[29]。體內和體外驗證試驗發(fā)現(xiàn),人miR-15a/miR-16-1簇上的1個C>T突變(位于pre-miR-16-1 3′末端下游7 bp)導致細胞內miR-15a與miR-16-1成熟體表達量明顯降低,且可能與慢性淋巴細胞白血病的發(fā)生相關[30]。此外,還有研究在一種易感B細胞淋巴瘤的新西蘭黑鼠家系中發(fā)現(xiàn)pre-miR-16-1 3′端的側翼區(qū)發(fā)生了1個A>T突變,突變個體淋巴組織內miR-16-1表達量下降,推測此突變可能與B細胞淋巴瘤的發(fā)生相關[31]。

本研究在豬pre-miR-15b基因位點第58位堿基發(fā)現(xiàn)了1個C>T突變,此突變降低了pre-miR-15b二級結構的熱力學穩(wěn)定性,通過構建野生型和突變型miR-15b過表達載體,分別轉染豬原代前體脂肪細胞進行miR-15b的過表達試驗,探究此突變對pre-miR-15b和miR-15b成熟體表達的影響。結果發(fā)現(xiàn),此突變并沒有改變pri-miR-15b的表達量,而使pre-miR-15b和miR-15b的表達量降低,據此推測此突變可能阻礙了pri-miR-15b到pre-miR-15b的生物學加工過程。經典的pri-miRNA二級結構是一種“莖環(huán)結構”,其5′端和3′端各包含1條RNA單鏈,還包含1個堿基互補配對的雙鏈RNA莖結構(33～35 bp)和終端的1個環(huán)結構[32](圖6)。動物體內pri-miRNA到pre-miRNA的過程主要依靠“microprocessor”的剪切實現(xiàn)的,“microprocessor”由Drosha及其輔酶DGCR8構成[32-33]。Drosha可以幫助“microprocessor”識別pri-miRNA經典的莖環(huán)結構,并像“分子尺”一樣從單鏈RNA與雙鏈RNA的交匯點向雙鏈RNA方向量取11 bp進行剪切,Drosha還可以識別pri-miRNA 5′端和3′端RNA單鏈上的一些特異堿基序列(UG)來提高剪切的精確性,所以Drosha對于pri-miRNA的識別和精確剪切至關重要[32-33]。DGCR8具有穩(wěn)定和激活Drosha的作用,DGCR8還可與pri-miRNA的雙鏈RNA莖結構結合,提高“microprocessor”的剪切效率;此外DGCR8還能夠識別pri-miRNA末端環(huán)結構上特異的堿基序列(UGU)提高“microprocessor”剪切的精確性[32,34]。本研究中,+58C>T沒有改變pri-miR-15b的“單鏈RNA-雙鏈RNA”結構,也沒有影響Drosha識別的特異堿基,而是將pri-miR-15b雙鏈莖結構上引入了1個A-U配對(沒有突變時為A-C)(圖2),因此推測+58C>T可能通過影響了DGCR8(而不是Drosha)與pri-miR-15b的結合,從而降低了“microprocessor”對pri-miR-15b的剪切效率,減少了pre-miR-15的生成,最終降低miR-15b的表達量。本研究還發(fā)現(xiàn),+58C>T同時影響了與miR-15b同簇miR-16-1的表達,但是其具體作用機理還需進一步研究。

農業(yè)動物miRNA突變或者靶基因與miRNA結合位點的突變都可能與一些生產性狀的改變相關,例如生長性能[35]、脂肪沉積[19]和肌纖維的構成[36],但目前關于此類的研究報道甚少。本研究的體外細胞試驗發(fā)現(xiàn),+58C>T改變了豬脂肪細胞內miR-15b與miR-16成熟體的表達量;又有研究報道,miR-15b可以通過抑制其靶基因FOXO1促進豬前體脂肪細胞的成脂分化[25],因此推測+58C>T可能會影響前體脂肪細胞的分化。通過誘導轉染不同基因型miR-15b表達載體的前體脂肪細胞成脂分化,結果發(fā)現(xiàn)此突變減弱了miR-15b對FOXO1 mRNA的降解作用,因此導致突變組細胞內FOXO1相對表達量顯著高于野生組,高水平表達的FOXO1抑制了前體脂肪細胞的分化,具體表現(xiàn)為成脂分化相關基因表達量降低,脂肪細胞脂滴合成減少。但是,以上研究結果只是建立在體外細胞水平,今后還需在體內水平進一步探究此突變對豬脂肪沉積相關性狀的影響。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),+58C>T存在于長白和杜洛克2個外種豬種,而本土品種榮昌豬中確沒有發(fā)現(xiàn)此突變。眾所周知,長白豬和杜洛克豬屬于瘦肉型品種,而榮昌豬屬于脂肪型品種,此突變是否與這些品種間脂肪代謝和脂肪沉積相關性狀的差異有關,值得進一步研究。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)了豬pre-miR-15b基因位點發(fā)生了1個+58C>T突變,體外細胞水平試驗發(fā)現(xiàn),此突變阻礙了pri-miR-15b到pre-miR-15b的生物學加工過程,降低了豬前體脂肪細胞miR-15b的表達量,在一定程度上抑制了豬前體脂肪細胞成脂分化和脂肪合成。