張 靜 卜麗君 郎姣姣 劉亞鵬 夏呈強(qiáng) 霍文婕 劉 強(qiáng)

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,太谷 030801)

發(fā)展奶業(yè)的主要目標(biāo)是生產(chǎn)更多的優(yōu)質(zhì)牛奶,牛乳腺的良好發(fā)育和功能分化是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵[1]。產(chǎn)奶量被廣泛認(rèn)為與乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量及其分泌功能有關(guān)[2]。因此,奶牛乳腺發(fā)育調(diào)控是提高奶牛泌乳性能的關(guān)鍵。丁酸鈉(SB)作為奶牛飼料添加劑,能夠提升奶牛泌乳性能[3-4],降低乳房炎的發(fā)生率[5],也可以提高牛乳中脂肪的含量[4,6]。已有文獻(xiàn)表明,在奶牛飼糧中添加丁酸鹽可提高乳脂含量和產(chǎn)量[3-4]及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率[7-8],但降低了血液中葡萄糖[9-11]、尿素氮和非酯化脂肪酸含量[10-11]。此外,SB在體外可提高牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)中與泌乳相關(guān)基因的表達(dá)[12-13]。

迄今為止,關(guān)于SB的研究文獻(xiàn)多數(shù)聚焦于對(duì)動(dòng)物腸道形態(tài)、乳品質(zhì)和抗氧化能力的影響等方面,體外研究主要聚焦于對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響等方面[14-15]。在乳腺組織中,SB通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體41(GPR41)介導(dǎo)腺苷5′-單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖體蛋白S6激酶(S6K)信號(hào)通路,增加了膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)的核易位,并通過(guò)GPR41/AMPK/沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)信號(hào)通路增加SREBP1的乙酰化,進(jìn)而促進(jìn)乳脂合成[13];SB也可通過(guò)激活GPR41介導(dǎo)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路,改善脂多糖誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T細(xì)胞)氧化應(yīng)激損傷和凋亡[5]。因此,本研究假設(shè)SB通過(guò)激活GPR41介導(dǎo)Akt/mTOR信號(hào)通路,從而調(diào)控BMECs增殖和凋亡相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá),通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn),研究不同濃度SB對(duì)BMECs增殖的影響,并探究SB是否通過(guò)GPR41介導(dǎo)Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控BMECs增殖的作用機(jī)制,為生產(chǎn)實(shí)踐中利用SB營(yíng)養(yǎng)手段促進(jìn)奶牛乳腺的發(fā)育、提高奶牛泌乳性能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

膠原酶A、SB購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素(PSN)、新生胎牛血清(FBS)和DMEM/F12購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。Akt阻斷劑(Akt-IN-1)和mTOR阻斷劑雷帕霉素(Rap)購(gòu)自美國(guó)MCE公司。GPR41小干擾RNA(siRNA)購(gòu)自吉瑪基因股份有限公司,RNA提取試劑盒購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司,cDNA合成購(gòu)自試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自日本Dojindo公司。5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)體外試劑盒(Cell-LightTM)購(gòu)于廣州瑞博生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司。試驗(yàn)用的細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、0.22 μm一次性過(guò)濾器購(gòu)自美國(guó)Corning公司,聚偏二氟乙烯(PVDF)蛋白轉(zhuǎn)印膜購(gòu)于德國(guó)Merck Millipore公司,70 μm細(xì)胞過(guò)濾篩購(gòu)自美國(guó)BD公司。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Akt和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。細(xì)胞周期蛋白(CCN)A1購(gòu)自美國(guó)Novusbio Biologicals公司。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、mTOR、B細(xì)胞淋巴瘤2(BCL2)、B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白(BAX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì),將BMECs于37 ℃、5% CO2條件下在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[16],當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到90%時(shí)開(kāi)始傳代,傳至4代,接種至96孔板,分別更換為添加不同濃度(0、15、30、45、60和75 μmol/L)SB的DMEM/F12(含10% FBS)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d,每次平行復(fù)孔8個(gè),重復(fù)3次。通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性,確定最適SB濃度。然后,以對(duì)照(Control,0 μmol/L)和最適SB濃度培養(yǎng)BMECs,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)BMECs細(xì)胞增殖、凋亡以及GPR41和Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化,確定SB對(duì)BMECs細(xì)胞增殖、凋亡的影響及是否可能通過(guò)GPR41介導(dǎo)Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控。之后,采用AKT-IN-1、Rap和GPR41 siRNA對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行阻斷及受體進(jìn)行沉默,采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性,qRT-PCR和Western blot檢測(cè)阻斷后SB對(duì)BMECs細(xì)胞增殖、凋亡以及Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化,確定SB是否通過(guò)GPR41受體調(diào)控Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控對(duì)BMECs細(xì)胞增殖和凋亡。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 BMECs分離與培養(yǎng)

參考孔慶洋[17]的方法,從奶牛場(chǎng)采集3頭健康泌乳奶牛[體重(638±14) kg、(45±4)月齡、泌乳(28±2) d]的乳腺組織,進(jìn)行BMECs的分離培養(yǎng)。簡(jiǎn)而言之,乳腺先用75%酒精和磷酸鹽緩沖液(PBS)(含50 μg/mL慶大霉素和1×PSN)進(jìn)行沖洗,然后剝開(kāi)外層乳腺組織,剪取適當(dāng)?shù)慕M織塊(避開(kāi)乳導(dǎo)管和血管等部位),放入Hank’s液(含50 μg/mL慶大霉素和1×PSN)中,轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞房;組織塊用3×雙抗PBS清洗2次,轉(zhuǎn)至超凈臺(tái);在培養(yǎng)皿中修剪乳腺組織,然后轉(zhuǎn)至另一培養(yǎng)皿中將組織塊剪碎;剪碎的組織碎塊置于25 cm2卡氏瓶中,加入20 mL消化培養(yǎng)基(DMEM/F12+5% FBS+1 mg/mL膠原酶A+50 μg/mL慶大霉素+1×PSN),在37 ℃條件下于搖床消化;然后以滴管輕輕吹散懸液,用細(xì)胞篩(70 μm)過(guò)濾至離心管(15 mL),在4 ℃條件下1 000×g離心10 min,棄上清,用PBS(含50 μg/mL慶大霉素和1×PSN)洗3次。用完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10% FBS+1×PSN)重懸細(xì)胞,按25 cm2培養(yǎng)瓶中1.5×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種后,在37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)傳代,本次試驗(yàn)所用細(xì)胞為第4代細(xì)胞。

1.3.2 不同濃度SB溶液的配制

稱取5 mg的SB,用超純水溶解,然后將SB溶液(初始濃度75 μmol/L)加到細(xì)胞完全培養(yǎng)基中,通過(guò)稀釋調(diào)整SB濃度分別為15、30、45、60和75 μmol/L,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 SB對(duì)BMECs活性的影響

根據(jù)Zhang等[18]的方法,將BMECs接種于96孔板中(1×103個(gè)/孔),每孔200 μL,在37 ℃、5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞貼壁后更換為含不同濃度(0、15、30、45、60和75 μmol/L)SB的DMEM/F-12(含有10%FBS,1×PSN)培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 d。每次平行復(fù)孔8個(gè),重復(fù)3次。最后每孔加入10 μL不含F(xiàn)BS的DMEM-F12和CCK-8檢測(cè)液,繼續(xù)孵育1 h,最后用酶標(biāo)儀(Infinite 200 PRO)測(cè)定450 nm處吸光度值(OD450 nm)[16]。細(xì)胞相對(duì)增殖率計(jì)算公式如下:

細(xì)胞相對(duì)增殖率(%)=100×試驗(yàn)組OD450 nm/對(duì)照組OD450 nm。

1.3.4 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖

根據(jù)Zhang等[18]的方法,將BMECs接種于96孔板中(1×103個(gè)/孔),每孔200 μL,每組6個(gè)復(fù)孔,在37 ℃、5% CO2條件下,分別培養(yǎng)于0和60 μmol/L SB的DMEM/F-12(含有10% FBS,1×PSN)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d,之后PBS洗2次。50 μmol/L EdU培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h,再用PBS洗滌3次,在25 ℃條件下用4%多聚甲醛固定30 min,然后在25 ℃條件下Apollo染色反應(yīng)液和Hoechst 33342反應(yīng)液黑暗染色30 min,倒置顯微鏡獲取細(xì)胞圖像。以EdU陽(yáng)性核占總核的比例估算BMECs增殖率。

1.3.5 轉(zhuǎn)染GPR41 siRNA

牛GPR41 siRNA序列(正向5′-CCUACAACAUGUCCCACAUTT-3′,反向5′-AUGUGGGACAUGUUGUAGGTT-3′)由吉瑪基因公司合成。根據(jù)尚智援等[20]方法,在試驗(yàn)前,以GPR41非特異性siRNA作為陰性對(duì)照(NC),檢測(cè)GPR41特異性siRNA的轉(zhuǎn)染效率,發(fā)現(xiàn)GPR41非特異性siRNA對(duì)GPR41的表達(dá)沒(méi)有影響,而GPR41特異性siRNA能夠顯著下調(diào)GPR41的表達(dá),因此,可以采用GPR41特異性siRNA進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。按照張靜等[21]方法,BMECs長(zhǎng)到90%時(shí)接種于6孔板中(1×105個(gè)),當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照4 μL/孔Lipofectamine 2000加入200 μL/孔Opti-MEM Medium的體系配制Lipid液待用;按照8 μL/孔FAM-siRNA加至200 μL/孔Opti-MEM Medium的體系配制siRNA液待用。將Lipid液和siRNA液混合均勻,室溫靜置20 min,制成FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物。將FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)基的孔中搖晃孔板使其混合,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,更換成完全培養(yǎng)基。隔天再次進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染,再加處理物培養(yǎng)2 d。

1.3.6 SB對(duì)BMECs增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

將BMECs放置于12孔板(1×104個(gè)/孔)中,每組6個(gè)重復(fù)孔,分別培養(yǎng)于0和60 μmol/L 的SB中3 d。之后按照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA,再用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件為:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s[19]。內(nèi)參采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH),以qRT-PCR法測(cè)定BMECs增殖(CCNA2、CCND1和PCNA)和凋亡基因(BCL2、BAX、Caspase-3和Caspase-9)的表達(dá)。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性20 s,1個(gè)循環(huán);55 ℃退火20 s,95 ℃延伸15 s,40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.7 SB對(duì)BMECs增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

將2×104個(gè)/孔BMECs放置于6孔板中,分別培養(yǎng)于0和60 μmol/L的SB中3 d,每劑量3個(gè)重復(fù)孔。蛋白含量分析使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒。以β-actin為上樣對(duì)照,用10%或12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量蛋白(20 μg),將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,在室溫下用6%(質(zhì)量體積比)牛血清白蛋白(BSA)在Tris鹽緩沖液(TBS)加吐溫-20(TBST)中封閉膜2 h。轉(zhuǎn)移膜與CCNA1(1∶2 000)、PCNA(1∶2 000)、Akt(1∶2 000)、p-Akt(1∶2 000)、mTOR(1∶2 000)、p-mTOR(1∶2 000)、BCL2(1∶2 000)、BAX(1∶2 000)、Caspase-3(1∶2 000)、Caspase-9(1∶2 000)和β-actin(1∶10 000)的一抗用TBST稀釋孵育,在4 ℃下孵育過(guò)夜。用TBST洗滌5次,洗滌5 min,去除多余的抗體,然后與二抗在25 ℃下孵育2 h。TBST清洗,ChampChemi凝膠成像儀掃描分析,蛋白統(tǒng)計(jì)軟件(Image J)掃描灰度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[20]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SigmaPlot 12.5統(tǒng)計(jì)分析包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)不同濃度SB的處理效應(yīng)進(jìn)行線性和二次曲線分析,對(duì)其他數(shù)據(jù)以t檢驗(yàn)進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)。當(dāng)P<0.01時(shí)表示差異極顯著,當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異顯著。文中所有數(shù)據(jù)制圖均采用SigmaPlot 12.5統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 SB對(duì)BMECs增殖的影響

如圖1所示,CCK8試驗(yàn)結(jié)果表明SB對(duì)BMECs增殖呈二次曲線變化,與對(duì)照組相比,60 μmol/L的SB顯著刺激BMECs的增殖(P<0.05;圖1-A)。因此,選擇60 μmol/L的SB,并在后續(xù)試驗(yàn)中使用。同時(shí),EdU檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,60 μmol/L的SB極顯著提高了BMECs的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率(P<0.01;圖1-B、圖1-C)。與對(duì)照組相比,60 μmol/L的SB極顯著提高了BMECs增殖相關(guān)基因PCNA、CCNA2和CCND1的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.01;圖1-D),顯著提高了BMECs增殖相關(guān)蛋白PCNA和CCNA1的蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.05;圖1-E、圖1-F)。

CCNA2:細(xì)胞周期蛋白A2 cyclin A2;CCND1:細(xì)胞周期蛋白D1 cyclin D1;CCNA1:細(xì)胞周期蛋白A1 cyclin A1;PCNA:增殖細(xì)胞核抗原 proliferating cell nuclear antigen;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白;Control:對(duì)照;SB:丁酸鈉 sodium butyrate。下圖同 the same as below。

2.2 SB對(duì)BMECs凋亡的影響

由圖2可知,與對(duì)照組相比,60 μmol/L的SB極顯著提高了抑制BMECs凋亡相關(guān)基因BCL2的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.01),極顯著降低了促進(jìn)BMECs凋亡相關(guān)基因BAX的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.01),顯著降低了促進(jìn)BMECs凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05),極顯著提高了BCL2/BAX比值(P<0.01;圖2-A)。同時(shí)Western blot分析結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,60 μmol/L的SB顯著提高了BCL2的蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.05),極顯著降低BAX的蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.01),顯著降低Caspase-3和Caspase-9的蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.05),顯著提高BCL2/BAX比值(P<0.05;圖2-B、圖2-C)。

BCL2:B淋巴細(xì)胞瘤2 B-cell lymphoma 2;BAX:B淋巴細(xì)胞瘤2相關(guān)X蛋白 BCL2 associated X protein;Caspase-3:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 cysteine aspartic acid specific protease-3;Caspase-9:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 cysteine aspartic acid specific protease-9。下圖同 the same as below。

2.3 SB對(duì)BMECs Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

由圖3可知,與對(duì)照組相比,60 μmol/L的SB顯著提高了p-Akt/Akt比值(P<0.05),極顯著提高了p-mTOR/mTOR比值(P<0.01)。

Akt:蛋白激酶B protein kinase B;p-Akt:磷酸化蛋白激酶B phosphorylated protein kinase;mTOR:哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin;p-mTOR:磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 phosphorylated mammalian target of rapamycin。下圖同 the same as below。

2.4 阻斷Akt信號(hào)通路對(duì)BMECs增殖和凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

為研究SB是否通過(guò)Akt信號(hào)通路促進(jìn)BMECs增殖,我們使用AKT-IN-1進(jìn)行了阻斷試驗(yàn)。結(jié)果表明,30 nmol/L的AKT-IN-1對(duì)BMECs的增殖無(wú)顯著影響(P>0.05),且30 nmol/L的AKT-IN-1可以極顯著阻斷60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖的促進(jìn)作用(P<0.01)(圖4-A)。30 nmol/L的AKT-IN-1顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖相關(guān)基因PCNA和CCNA2 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05),極顯著逆轉(zhuǎn)了對(duì)CCND1 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.01),以及顯著逆轉(zhuǎn)了抑制BMECs凋亡相關(guān)基因BCL2 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05);30 nmol/L的AKT-IN-1顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs凋亡相關(guān)基因BAX、Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達(dá)的抑制作用(P<0.05;圖4-B)。同樣,30 nmol/L的AKT-IN-1極顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖相關(guān)蛋白PCNA和CCNA1表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.01),顯著逆轉(zhuǎn)了抑制BMECs凋亡相關(guān)蛋白BCL2表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05),也顯著逆轉(zhuǎn)了BCL2/BAX比值的升高(P<0.05);30 nmol/L的AKT-IN-1極顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs凋亡相關(guān)蛋白BAX和Caspase-3表達(dá)的抑制作用(P<0.01),顯著逆轉(zhuǎn)了Caspase-9表達(dá)的抑制作用(P<0.05),極顯著逆轉(zhuǎn)了BMECs增殖相關(guān)通路p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值的促進(jìn)作用(P<0.01;圖4-C、圖4-D)。

AKT-IN-1:蛋白激酶B阻斷劑 protein kinase B blocker。

2.5 阻斷mTOR信號(hào)通路對(duì)BMECs增殖和凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

為研究SB是否通過(guò)mTOR信號(hào)通路促進(jìn)BMECs增殖,我們使用Rap進(jìn)行了阻斷試驗(yàn)。結(jié)果表明,50 pmol/L的Rap對(duì)BMECs的增殖無(wú)顯著影響(P>0.05),且Rap可以極顯著阻斷60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖的促進(jìn)作用(P<0.01)(圖5-A)。50 pmol/L的Rap顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖相關(guān)基因PCNAmRNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05),極顯著逆轉(zhuǎn)了CCND1和CCNA2 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.01),也顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖相關(guān)蛋白PCNA和CCNA1表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05),而且顯著逆轉(zhuǎn)了BMECs增殖通路p-mTOR/mTOR比值的促進(jìn)作用(P<0.05;圖5-B、圖5-C、圖5-D)。值得注意的是,50 pmol/L的Rap抑制mTOR但對(duì)BMECs凋亡和SB激活的Akt信號(hào)通路相關(guān)的mRNA或蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05;圖5-B、圖5-C、圖5-D)。

Rap:哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白阻斷劑雷帕霉素;mammalian target of rapamycin blocker rapamycin。

2.6 SB對(duì)BMECs中GPR41基因和蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,60 μmol/L的SB極顯著提高了BMECs中SB受體GPR41的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.01,圖6-A),顯著提高了BMECs中SB受體GPR41的蛋白相對(duì)表達(dá)量(P<0.05,圖6-B)。

GPR41:G蛋白偶聯(lián)受體41 G-protein-coupled receptor 41。下圖同 the same as below。

2.7 GPR41 siRNA對(duì)促進(jìn)BMECs增殖及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為研究SB是否通過(guò)GPR41調(diào)控BMECs增殖,我們通過(guò)GPR41 siRNA進(jìn)行了沉默試驗(yàn)。GPR41 siRNA對(duì)BMECs的增殖無(wú)顯著影響(P>0.05),且GPR41 siRNA可以極顯著沉默60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖的促進(jìn)作用(P<0.01)(圖7-A)。GPR41 siRNA顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖相關(guān)基因PCNA和CCND1 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05),極顯著逆轉(zhuǎn)了CCNA2 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.01),以及顯著逆轉(zhuǎn)了抑制BMECs凋亡相關(guān)基因BCL2 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05);GPR41 siRNA顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs凋亡相關(guān)基因BAX、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)的抑制作用(P<0.05;圖7-B)。同樣,GPR41 siRNA極顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.01),顯著逆轉(zhuǎn)了CCNA1表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05),以及極顯著逆轉(zhuǎn)了抑制BMECs凋亡相關(guān)蛋白BCL2表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.01),也極顯著逆轉(zhuǎn)了BCL2/BAX比值的升高(P<0.01);GPR41 siRNA顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs凋亡相關(guān)蛋白BAX、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的抑制作用(P<0.05);GPR41 siRNA顯著逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB對(duì)BMECs增殖相關(guān)通路p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值(P<0.05),極顯著逆轉(zhuǎn)了對(duì)GPR41蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.01;圖7-C、圖7-D)。

GPR41 siRNA:G蛋白偶聯(lián)受體41小干擾RNA G-protein-coupled receptor 41 small interfering RNA。

3 討 論

在本研究中,SB促進(jìn)了BMECs的增殖相關(guān)mRNA或蛋白的表達(dá),抑制了凋亡相關(guān)mRNA或蛋白的表達(dá),這一結(jié)果支持了他人研究中SB促進(jìn)泌乳量提升的結(jié)果[3,6]。本研究測(cè)定了不同濃度SB對(duì)BMECs增殖的影響,添加15～60 μmol/L的SB線性促進(jìn)了BMECs的增殖,但75 μmol/L的SB卻抑制了BMECs的增殖,說(shuō)明SB促進(jìn)BMECs增殖呈二次曲線變化,SB適宜濃度為60 μmol/L。

刺激BMECs增殖和抑制細(xì)胞凋亡是促進(jìn)泌乳奶牛持續(xù)泌乳的關(guān)鍵控制點(diǎn)[21]。通過(guò)檢測(cè)含有PCNA和CCN的增殖標(biāo)志物CCNA2和CCND1的mRNA相對(duì)表達(dá)量,說(shuō)明SB對(duì)BMECs增殖的調(diào)控作用。CCND主要調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)變。CCNA被認(rèn)為是S期DNA合成起始和終止所必需的[18,22]。CCNA2在所有增殖細(xì)胞中普遍表達(dá),在S期和有絲分裂中均發(fā)揮作用[23]。此外,PCNA是參與DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)修復(fù)不可或缺的輔助因子[24]。還有文獻(xiàn)報(bào)道,PCNA和Cyclin D3均參與乳腺上皮細(xì)胞增殖的調(diào)控[18,25]。在本研究中,添加60 μmol/L的SB提高了CCNA2、CCND1和PCNA的mRNA相對(duì)表達(dá)量,以及CCNA1和PCNA的蛋白相對(duì)表達(dá)量,說(shuō)明60 μmol/L的SB促進(jìn)了BMECs的增殖。

細(xì)胞凋亡是由BCL2家族蛋白誘導(dǎo),經(jīng)過(guò)線粒體和死亡受體2條通路,通過(guò)高度復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)進(jìn)行的。而且,對(duì)于BCL2家族蛋白,主要包括抗凋亡蛋白(如BCL2)和促凋亡蛋白(如BAX),參與凋亡細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)[26]。由于BCL2通過(guò)抑制BAX的活性來(lái)阻止細(xì)胞凋亡,因此高BCL2/BAX比值是細(xì)胞凋亡受到抑制的提示。因此,BCL2/BAX比值可以反映細(xì)胞凋亡的狀態(tài)。線粒體和死亡受體途徑都匯聚到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)的共同途徑上,即Caspase-3和Caspase-9,這2種Caspase均作用于細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段[27],分別是細(xì)胞凋亡時(shí)的下游和上游信號(hào)傳導(dǎo)分子[28]。這些物質(zhì)的表達(dá)變化一定程度上反映了細(xì)胞凋亡的情況。為此,降低Caspase-3和Caspase-9的蛋白相對(duì)表達(dá)量說(shuō)明抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在本研究中,添加60 μmol/L的SB提高BCL2 mRNA和蛋白的表達(dá),降低了BAX、Caspase-3和Caspase-9的mRNA和蛋白的表達(dá),顯著增加BCL2/BAX和BCL2/BAX比值,說(shuō)明添加60 μmol/L的SB抑制了BMECs凋亡標(biāo)志物的表達(dá)。因此,上述結(jié)果表明60 μmol/L的SB很可能通過(guò)刺激增殖標(biāo)志物的表達(dá)和抑制凋亡標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)促進(jìn)了BMECs的增殖。

最近,有很多研究表明Akt信號(hào)通路在多種細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,例如豬乳腺上皮細(xì)胞[18]、乳腺癌細(xì)胞[29]和HC11細(xì)胞[30]。在本研究中,Akt信號(hào)通路在BMECs增殖過(guò)程中被60 μmol/L的SB激活。當(dāng)以AKT-IN-1阻斷Akt信號(hào)通路后,逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB促進(jìn)的細(xì)胞活力,以及增殖標(biāo)志物(PCNA、CCNA2和CCND1)和凋亡標(biāo)志物(BCL2、BAX、Caspase-3和Caspase-9)的mRNA和蛋白表達(dá)。而且,p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值的逆轉(zhuǎn)說(shuō)明AKT-IN-1可阻斷Akt和mTOR的磷酸化過(guò)程。結(jié)果提示Akt-mTOR信號(hào)通路可能參與了SB促進(jìn)BMECs增殖的作用。

此外,mTOR信號(hào)通路也參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖[31]。在本研究中,當(dāng)BMECs培養(yǎng)于60 μmol/L的SB中時(shí),mTOR信號(hào)通路也被激活。當(dāng)以Rap阻斷mTOR信號(hào)通路時(shí),逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB促進(jìn)的細(xì)胞活力,并改變了增殖標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá),但未逆轉(zhuǎn)凋亡標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá)。而且,p-mTOR/mTOR比值的逆轉(zhuǎn)說(shuō)明Rap可阻斷mTOR的磷酸化過(guò)程。這些結(jié)果表明mTOR信號(hào)通路可能參與了SB調(diào)控的促BMECs增殖作用。在本研究中,AKT-IN-1阻斷了p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值,同時(shí)Rap可阻斷p-mTOR/mTOR比值;然而,Rap對(duì)p-Akt/Akt比值沒(méi)有阻斷作用。因此,補(bǔ)充SB通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/mTOR信號(hào)通路刺激BMECs增殖。綜上所述,這些結(jié)果表明SB通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/mTOR信號(hào)通路刺激BMECs增殖。

研究表明,GPR41主要在脂肪組織中表達(dá),可以被短鏈脂肪酸激活[32-33],從而調(diào)控脂質(zhì)代謝[34]。還有研究表明,GPR41在BMECs中也可以高表達(dá)[35]。SB是GPR41的配體,通過(guò)結(jié)合并激活GPR41調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥[5,36]。此外,添加SB可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路減少LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞的凋亡[5]。在本研究中,添加60 μmol/L的SB提高了GPR41的mRNA和蛋白的表達(dá),說(shuō)明SB能夠激活BMECs中GPR41的表達(dá)。當(dāng)以GPR41 siRNA沉默GPR41表達(dá)后,逆轉(zhuǎn)了60 μmol/L的SB促進(jìn)的細(xì)胞活力,以及增殖標(biāo)志物和凋亡標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá)。而且,p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值的逆轉(zhuǎn)說(shuō)明GPR41 siRNA可通過(guò)干擾GPR41逆轉(zhuǎn)Akt和mTOR的磷酸化過(guò)程。這一結(jié)果說(shuō)明SB通過(guò)GPR41介導(dǎo)Akt/mTOR信號(hào)通路參與了BMECs的增殖調(diào)控。

在本研究中,添加60 μmol/L的SB培養(yǎng)泌乳前期奶牛BMECs,通過(guò)結(jié)合并激活GPR41,進(jìn)一步介導(dǎo)Akt和mTOR的磷酸化,刺激增殖標(biāo)志物的基因和蛋白表達(dá),抑制凋亡標(biāo)志物的基因和蛋白表達(dá),從而促進(jìn)了BMECs的增殖。但是SB是否會(huì)影響圍產(chǎn)期和泌乳中后期奶牛BMECs的增殖需要進(jìn)一步研究,是否會(huì)通過(guò)影響B(tài)MECs的分化刺激乳蛋白的合成也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① SB能夠促進(jìn)BMECs增殖,以60 μmol/L添加濃度較為適宜。

② SB通過(guò)GPR41介導(dǎo)的Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)BMECs增殖。