程菊芬 張 立 袁家琪 賀真睿 翁順利 嚴(yán)加森 鄭會(huì)超*
(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,杭州 310021;2.麗水渝景農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,景寧 323500)
家兔的適宜生長(zhǎng)溫度為15~20 ℃,由于其皮膚缺乏汗腺,且體表有很厚的絨毛形成的隔熱層,導(dǎo)致其散熱能力差,對(duì)熱應(yīng)激十分敏感[1]。一般來講,氣溫高于30 ℃會(huì)導(dǎo)致家兔熱應(yīng)激,表現(xiàn)為體溫升高、呼吸頻率增加,采食量、生長(zhǎng)速度及繁殖性能下降,嚴(yán)重時(shí)抗病力下降,甚至引起死亡[2]。隨著家兔養(yǎng)殖規(guī)?;l(fā)展及全球極端氣候條件多發(fā),熱應(yīng)激已成為制約家兔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展和效益的主要因素,尤其在熱帶、亞熱帶地區(qū)。目前,一般通過調(diào)整飼料配方、配備降溫系統(tǒng)、添加抗熱應(yīng)激添加劑等方法來緩解夏季高溫對(duì)家兔的不利影響。筆者前期調(diào)研發(fā)現(xiàn),浙江省生長(zhǎng)兔夏季易發(fā)生消化功能障礙,成活率較低,剖檢發(fā)現(xiàn)多數(shù)病死兔出現(xiàn)小腸脹氣、盲腸內(nèi)容物稀薄或硬實(shí)等癥狀。
研究表明,一些天然植物藥物如辣木葉、生姜、百里香等兼有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥物的雙重作用,能夠協(xié)調(diào)畜禽夏季體熱平衡,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,緩解熱應(yīng)激[3-6]。將多種中藥混合組方添加,發(fā)揮協(xié)同作用,可明顯緩解熱應(yīng)激或亞健康狀態(tài)的多系統(tǒng)機(jī)能紊亂[7-9]。因此,本試驗(yàn)旨在研究中藥添加劑對(duì)生長(zhǎng)兔夏季生長(zhǎng)性能、屠宰性能、腸道微生態(tài)和血清生化指標(biāo)的影響,為探明其緩解家兔熱應(yīng)激的作用機(jī)制,研發(fā)有效緩解家兔熱應(yīng)激的中藥添加劑提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。
選取體重相近、健康的2月齡新西蘭白兔48只,隨機(jī)分成2組,每組24只(公母各占1/2),單籠飼養(yǎng)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,中藥組在基礎(chǔ)飼糧中添加1%中藥添加劑。中藥添加劑由大青葉、荷葉和甘草按1∶1∶1比例混合組成,中藥添加劑的干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗纖維(CF)、酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)、鈣(Ca)、磷(P)含量分別為93.7%、18.4%、29.3%、18.4%、14.0%、2.0%、9.4%、5.0%、1.5%和0.1%,有效成分靛玉紅、荷葉堿、槲皮素、甘草苷、甘草酸含量分別為188.1、282.0、87.3、1 956.8、8 885.8 μg/kg。試驗(yàn)飼糧均為顆粒料,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)兔場(chǎng)進(jìn)行,時(shí)間為2022年6月14日至2022年8月1日,預(yù)試期7 d,正試期42 d。所有試驗(yàn)兔單籠飼養(yǎng),每日2次定時(shí)飼喂,自由采食、飲水。
表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
1.2.1 試驗(yàn)兔舍溫度和相對(duì)濕度
試驗(yàn)期間每天06:30、14:00、20:00用數(shù)字式溫濕度計(jì)測(cè)量并記錄試驗(yàn)兔舍內(nèi)靠門、靠窗以及兔舍中間的溫度和相對(duì)濕度,并觀察試驗(yàn)兔行為表現(xiàn)。參照Marai等[10]計(jì)算溫濕指數(shù)(THI),并劃分熱應(yīng)激等級(jí)。THI≤27.8為無熱應(yīng)激,THI 27.8~28.9為輕度熱應(yīng)激,THI 29.0~30.0為中度熱應(yīng)激,THI>30.0為嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激。
1.2.2 飼糧營(yíng)養(yǎng)成分
參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》測(cè)定飼糧粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、粗纖維、鈣、磷和氨基酸含量;采用范氏(Van Soest)的洗滌纖維分析法測(cè)定中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素含量。
1.2.3 生長(zhǎng)性能和成活率
試驗(yàn)開始和結(jié)束當(dāng)天早上,空腹對(duì)各組試驗(yàn)兔體重稱重,剩余的飼糧稱重并記錄,統(tǒng)計(jì)全期飼喂量,計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G);記錄各組死亡情況,計(jì)算成活率。
1.2.4 屠宰試驗(yàn)
試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天,對(duì)照組和中藥組各隨機(jī)選取12只試驗(yàn)兔,進(jìn)行屠宰和采樣,記錄宰前活重、半凈膛重、盲腸長(zhǎng)度和盲腸重量,參照來寧潔等[11]方法進(jìn)行測(cè)定。半凈膛重為兔屠宰放血后去除、頭、尾、皮毛、內(nèi)臟和前腳腕關(guān)節(jié)和后腳跗關(guān)節(jié)以下部分,保留心臟、肝臟、腎臟和腹脂的胴體重。結(jié)扎盲腸部位,用軟尺測(cè)定盲腸自然長(zhǎng)度即為盲腸長(zhǎng)度,用分析天平稱量含內(nèi)容物盲腸重量。半凈膛率計(jì)算公式如下:
半凈膛率(%)=(半凈膛重/宰前活重)×100。
1.2.5 盲腸內(nèi)容物發(fā)酵參數(shù)及細(xì)菌區(qū)系
試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天,對(duì)照組和中藥組各隨機(jī)采集8只試驗(yàn)兔盲腸內(nèi)容物,放入凍存管,并迅速埋入干冰。1管用于發(fā)酵參數(shù)和細(xì)菌總數(shù)分析,另1管用于細(xì)菌區(qū)系分析。將內(nèi)容物樣品解凍后等量混勻,取樣本50 mg,加50 μL 15%磷酸,再加125 μg/mL的內(nèi)標(biāo)(異己酸)溶液100 μL和乙醚400 μL勻漿1 min,于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量。采用S40 Mutimin型pH計(jì)測(cè)定濾液pH,采用恒溫鼓風(fēng)干燥箱105 ℃烘干法測(cè)定內(nèi)容物干物質(zhì)含量,采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定內(nèi)容物尿素氮(UN)含量,采用瓊脂平板培養(yǎng)法測(cè)定內(nèi)容物細(xì)菌總數(shù)。
根據(jù)Behrendt等[12]的方法,細(xì)菌16S rRNA基因的V3~V4區(qū)域的PCR擴(kuò)增使用細(xì)菌通用引物(341F:5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’和806R:5’-GGACTACNNGGGTATC-TAAT-3’)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增子測(cè)序在北京奧維森基因科技有限公司的Illumina MiSeq PE300平臺(tái)(Illumina公司,美國(guó))上進(jìn)行。原始數(shù)據(jù)以登錄號(hào)為SRP110222的形式提交到NCBI序列讀取檔案,然后使用QIIME 1.80軟件包進(jìn)行處理。經(jīng)過質(zhì)量過濾和配對(duì)端連接后,使用Uparse算法將序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)。利用Silva 128數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU代表性序列從門到屬進(jìn)行物種注釋。在QIIME 1.80中計(jì)算alpha多樣性指數(shù)。在RStudio(http://www.rstudio.org)中進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。
1.2.6 盲腸內(nèi)容物和糞便球蟲圓小囊數(shù)
試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天,對(duì)照組和中藥組各隨機(jī)選取12只試驗(yàn)兔,采集新鮮糞便和盲腸內(nèi)容物,采用麥?zhǔn)舷x卵計(jì)數(shù)法測(cè)定球蟲圓小囊數(shù)。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物球蟲病診斷技術(shù)》(GB/T 18647—2020)[13]每克糞便卵囊數(shù)(oocysts per gramme,OPG)判斷感染程度,其中OPG>1×105個(gè)為嚴(yán)重感染,1×104個(gè)≤OPG≤1×105個(gè)為中度感染;OPG<1×104個(gè)為輕度感染。
1.2.7 血清生化指標(biāo)
試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天,對(duì)照組和中藥組各選取8只生長(zhǎng)兔進(jìn)行耳動(dòng)脈采血,室溫靜置,3 000 r/min離心10 min,取上層血清。參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書檢測(cè)血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、葡萄糖(GLU)、尿素氮、丙二醛(MDA)、免疫球蛋白A(IgA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及總抗氧化能力(T-AOC)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行初步處理,采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件的一般線性模型(GLM)進(jìn)行單因素方差分析。以P<0.05作為差異顯著依據(jù),0.05≤P<0.10作為具有差異趨勢(shì)依據(jù),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。
由圖1可見,2022年夏季高熱,最低溫度在25 ℃以上,最高溫度在30 ℃以上,35 ℃以上高溫天數(shù)達(dá)25 d。兔舍日均溫度28.6~35.5 ℃,平均值(32.2±1.6) ℃;日均THI在26.9~32.6,平均值30.2±1.3。在6周試驗(yàn)期內(nèi),觀測(cè)到有20 d在06:30或20:00的THI低于29.0,38 d在14:00的THI超出30.0。以上數(shù)據(jù)表明,試驗(yàn)兔大部分時(shí)間處于嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激狀態(tài)。
圖1 試驗(yàn)期兔舍溫度和THI變化
由表2可知,中藥組成活率較對(duì)照組有所增加,但差異不顯著(P>0.05),表明中藥添加劑可改善家兔夏季抗病力。中藥組的平均日采食量有高于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.081)。對(duì)照組和中藥組之間末重、平均日增重和料重比差異不顯著(P>0.05)。
表2 中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔生長(zhǎng)性能和成活率的影響
由表3可知,對(duì)照組和中藥組之間宰前活重、盲腸長(zhǎng)度和盲腸重量差異不顯著(P>0.05),中藥組的盲腸長(zhǎng)度和盲腸重量略低于對(duì)照組。中藥組的半凈膛重和半凈膛率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)表明,中藥添加劑可以提高熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔的屠宰性能。
表3 中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔屠宰性能的影響
由表4可知,對(duì)照組和中藥組之間盲腸內(nèi)容物pH及丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、尿素氮含量差異不顯著(P>0.05)。中藥組的盲腸內(nèi)容物干物質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),盲腸內(nèi)容物乙酸和丙酸含量有低于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.092)。
表4 中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔盲腸內(nèi)容物發(fā)酵參數(shù)的影響
由表5可知,對(duì)照組和中藥組之間盲腸內(nèi)容物細(xì)菌總數(shù)和alpha多樣性差異不顯著(P>0.05)。
表5 中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔盲腸內(nèi)容物細(xì)菌總數(shù)和alpha多樣性的影響
由表6可知,對(duì)照組和中藥組之間盲腸內(nèi)容物顫螺旋菌科NK4A214群、瘤胃球菌屬、克里斯滕森菌科R-7群、毛螺菌科NK4A3164群等主要菌屬相對(duì)豐度差異不顯著(P>0.05)。中藥組的盲腸內(nèi)容物棲糞桿菌屬、普氏棲糞桿菌相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),盲腸內(nèi)容物阿克曼菌屬和大腸桿菌相對(duì)豐度有高于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.080、P=0.088)。中藥組的盲腸內(nèi)容物有害菌產(chǎn)氣莢膜梭菌和內(nèi)臟異味桿菌相對(duì)豐度降低,但差異不顯著(P>0.05)。
由表7可知,根據(jù)《動(dòng)物球蟲病診斷技術(shù)》(GB/T 18647—2020)[13],所有試驗(yàn)兔為球蟲輕度感染。中藥組的盲腸內(nèi)容物球蟲圓小囊數(shù)較對(duì)照組減少了24.5%,但差異不顯著(P>0.05);中藥組的糞便球蟲圓小囊數(shù)較對(duì)照組減少了31.9%,有低于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.082)。這表明中藥添加劑具有降低熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔腸道球蟲數(shù)量的作用。
表7 中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔盲腸內(nèi)容物與糞便球蟲圓小囊數(shù)的影響
由表8可知,對(duì)照組和中藥組之間血清生化指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。
熱應(yīng)激是導(dǎo)致動(dòng)物健康狀況受損和對(duì)應(yīng)激源耐受性下降的重要環(huán)境因素[14]。由于熱應(yīng)激對(duì)家兔福利、健康、發(fā)育等多重負(fù)面影響,在全世界范圍內(nèi)長(zhǎng)期影響家兔養(yǎng)殖業(yè)健康高效發(fā)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)兔夏季成活率較低,與Sirotkin等[16]的研究結(jié)果一致。我們剖檢死亡兔,發(fā)現(xiàn)小腸脹氣、盲腸內(nèi)容物稀薄或硬實(shí)等癥狀,表明家兔腸道功能異常。Bai等[17]發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激顯著提高家兔血清免疫球蛋白G含量和T-AOC,增加糞便細(xì)菌厚壁菌門、變形菌門、狹窄梭菌屬相對(duì)豐度,表明腸道微生態(tài)失衡與腸道功能障礙和血液氧化應(yīng)激相關(guān)。彭津津[9]由板藍(lán)根、荷葉、甘草等制成“清熱散”,對(duì)夏季兔瘟疫熱毒尤有良效,降低了料重比,提高了飼料轉(zhuǎn)化率。林家棟等[8]在飼糧中添加1%的黃連、金銀花和茯苓中藥,可降低伊拉肉兔死亡率、腹瀉率和料重比,提高肉兔的生長(zhǎng)性能。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加中藥添加劑可提高熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔成活率,對(duì)生長(zhǎng)性能影響不顯著,可能與試驗(yàn)兔品種、環(huán)境、飼糧、中藥組方等飼養(yǎng)管理?xiàng)l件不同有關(guān)。
屠宰性能可反映肉兔不同部位的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分布情況和沉積狀態(tài),體現(xiàn)屠宰前的活體品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加中藥添加劑可提高家兔屠宰率,中藥組盲腸長(zhǎng)度和盲腸重量略低于對(duì)照組,可能與中藥組飼糧纖維水平較低有關(guān)。兔是草食性動(dòng)物,依靠盲腸中存在大量的微生物和球囊組織協(xié)同作用,發(fā)酵粗纖維,將其分解為揮發(fā)性脂肪酸,并在盲腸被吸收利用。盲腸長(zhǎng)度和盲腸重量是反映草食動(dòng)物纖維消化能力強(qiáng)弱重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),飼糧纖維水平升高導(dǎo)致肉兔胃腸道重量增加,而屠宰率略有降低[18]。此外,杜新瑜等[19]研究發(fā)現(xiàn),伊拉肉兔飼糧中適量添加沙棘黃酮可提高屠宰率,表明中藥活性成分可能與消化道發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沉積有關(guān),有待于進(jìn)一步研究。
熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致腸道菌群異常,特別是胃腸道功能紊亂時(shí)腸胃微生態(tài)系統(tǒng)受到嚴(yán)重的破壞,菌群失調(diào)又反過來影響機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,降低機(jī)體免疫力,削弱腸道的屏障功能,進(jìn)一步加重疾病[20]。本研究發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)兔盲腸內(nèi)容物細(xì)菌以厚壁菌門和擬桿菌門為主,顫螺旋菌科NK4A214群、瘤胃球菌屬、克里斯滕森菌科R-7群、毛螺菌科NK4A3164群等為優(yōu)勢(shì)菌屬,與前人研究結(jié)果[21-22]一致。中藥添加劑對(duì)熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔盲腸微生態(tài)有微調(diào)作用,盲腸內(nèi)容物棲糞桿菌屬、普氏棲糞桿菌相對(duì)豐度顯著提高,阿克曼菌屬和大腸桿菌相對(duì)豐度具有提高的趨勢(shì),產(chǎn)氣莢膜梭菌和內(nèi)臟異味桿菌相對(duì)豐度略有降低。棲糞桿菌屬是主要的丁酸產(chǎn)生菌,丁酸是后段腸道上皮生長(zhǎng)的主要能源物質(zhì),能促進(jìn)腸系膜淋巴結(jié)發(fā)育,調(diào)節(jié)抗炎信號(hào)通路,改善腸道上皮屏障功能[23]。阿克曼菌屬可以增強(qiáng)結(jié)腸屏障功能,減少血液中內(nèi)毒素的濃度[24]。內(nèi)臟異味桿菌是可轉(zhuǎn)移響應(yīng)菌的重要成員,與IgA生成有關(guān),促進(jìn)代謝和免疫細(xì)胞對(duì)結(jié)腸炎的保護(hù)[25],該菌屬還與肥胖呈負(fù)相關(guān)[26]。球蟲感染兔后,在腸道上皮細(xì)胞大量增殖并破壞腸道黏膜。本研究發(fā)現(xiàn),中藥組盲腸內(nèi)容物和糞便球蟲圓小囊數(shù)減少,表明中藥添加劑可通過改善腸道微生態(tài)和屏障功能,抑制球蟲增生。大腸桿菌通常被認(rèn)為是腸道有害菌,本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加中藥添加劑可促進(jìn)生長(zhǎng)兔盲腸內(nèi)大腸桿菌生長(zhǎng),其效應(yīng)和機(jī)理有待進(jìn)一步評(píng)估。
許多中藥因含有多酚、黃酮等天然抗氧化物質(zhì),被廣泛用于緩解家兔熱脅迫所致氧化應(yīng)激。Helal等[4]研究發(fā)現(xiàn),在熱應(yīng)激家兔飼糧中添加辣木和迷迭香葉各0.5%,可以提高血漿CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和SOD活性,降低血漿MDA含量。研究發(fā)現(xiàn),生姜、姜黃素等也具有類似的效果[5,27]。飼糧中添加百里香酚和甘草提取物,還可以提高兔肉氧化穩(wěn)定性,延長(zhǎng)貨架壽命[28]。荷葉具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血的功效,有效成分為荷葉堿和槲皮素。大青葉是一種具有抗菌、抗病毒、抗氧化作用的清熱解毒類中藥,主要含有生物堿、黃酮和酚酸類有效成分。本研究發(fā)現(xiàn),由大青葉、荷葉、甘草復(fù)方組成的中藥添加劑對(duì)家兔血清氧化代謝物、氧化應(yīng)激指標(biāo)等影響不顯著,可能與試驗(yàn)兔個(gè)體差異較大以及環(huán)境、飼糧、中藥組方、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件不同有關(guān)。除中藥或天然植物藥物外,維生素、微量元素、益生菌和益生元廣泛用于拮抗家兔熱應(yīng)激的負(fù)面效應(yīng)[29-30]。未來多種營(yíng)養(yǎng)策略聯(lián)合應(yīng)用,可能更利于緩解家兔熱應(yīng)激,提高家兔抗病免疫力,改善生長(zhǎng)性能和動(dòng)物福利。
飼糧中添加由大青葉、荷葉、甘草復(fù)方組成的中藥添加劑,能提高熱應(yīng)激生長(zhǎng)兔屠宰性能,調(diào)控腸道微生態(tài),降低腸道球蟲數(shù)量,改善夏季家兔抗病力,對(duì)生長(zhǎng)性能和血清生化指標(biāo)無顯著影響。
致謝:
感謝浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院韋強(qiáng)研究員和付媛副研究員對(duì)球蟲圓小囊數(shù)測(cè)定給予的指導(dǎo)和幫助。
動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2024年3期