張 露 熊宇明 董黎黎 梁 萍 秦志清 王 磊 江和基 黃志堅 殷光文 林建斌* 王登峰*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福州 350002;2.福建省淡水水產(chǎn)研究所,福州 350002)

海藻及加工產(chǎn)物添加于畜禽和水產(chǎn)飼料中可以改善養(yǎng)殖動物的生長性能,提高生理活性、抗病力和抗應(yīng)激能力[1-4]。海藻種類繁多,目前使用的海藻主要包括褐藻門的海帶,綠藻門的石莼、滸苔,紅藻門的紫菜、江蘺、石花菜等。其中,海帶主要是由占干重45%的水溶性線性多糖褐藻酸、3%的海帶多糖(可溶性多聚葡萄糖)、5%的硫酸化程度較低且具支鏈化的褐藻糖膠和10%的蛋白質(zhì)組成;紫菜中主要為紫菜聚糖等具有支鏈的硫酸化程度較高的多糖和海藻蛋白,分別占干重的15%和30%;石莼中支鏈化和硫酸化程度較高的水溶性凝膠多糖約占干重的15%,蛋白質(zhì)約占8%[5]。海藻中的功能性成分包括褐藻酸(膠)(alginate)、海帶多糖(laminarin)、巖藻聚糖(fucoidan)、紫菜聚糖(porphyran)、綠藻多糖(ulvan)、卡拉膠(carrageenan)、多酚物質(zhì)(polyphenols)及海藻蛋白質(zhì)降解生成的寡肽等[6]。隨著研究的深入,已逐步明確:1)通過海藻中的多樣成分可提高腸道菌群的多樣性和有益菌的豐度,產(chǎn)生對機(jī)體有益的影響(益生元樣作用)[5,7];2)腸道特定的菌群可代謝海藻中不易被吸收的糖產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)[8],促進(jìn)CD4+T細(xì)胞和固有淋巴樣細(xì)胞(innate lymphoid cells,ILCs)產(chǎn)生白細(xì)胞介素-22(IL-22),保護(hù)腸道免受炎癥損害[9];3)海藻硫化多糖作用于細(xì)胞膜Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)、細(xì)菌脂多糖的膜受體分化簇14(cluster of differentiation 14,CD14)等激活巨噬細(xì)胞,進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[10];4)海藻中的天然凝膠多糖可以鎖定水分增加糞便的體積,并具有益生元樣作用的潛力[11-12];5)海藻中蛋白質(zhì)經(jīng)消化酶作用生成多肽(短肽),增強(qiáng)腸道菌群多樣性和有益菌豐度,從而產(chǎn)生對機(jī)體形成有益的影響或直接調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞分化和影響絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路,增強(qiáng)腸道和機(jī)體健康[5,13]。

大黃魚(Larimichthyscrocea)是我國特有的重要海產(chǎn)之一,是東南沿海的主要經(jīng)濟(jì)魚種,可以進(jìn)行大規(guī)模的網(wǎng)箱養(yǎng)殖,是未來海洋牧業(yè)重點(diǎn)發(fā)展的方向之一。近兩年,我國大黃魚的產(chǎn)量均超過25萬t[14]。大黃魚是肉食性魚類,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖密度過高、養(yǎng)殖水域污染和投喂小雜魚等導(dǎo)致的各種病害問題不斷涌現(xiàn),其中變形假單胞菌導(dǎo)致的內(nèi)臟白點(diǎn)病、細(xì)菌性腸炎病、弧菌病等細(xì)菌性疾病較常見[15-16]。腸道是有害細(xì)菌入侵的主要途徑,腸道菌群是腸道健康的基礎(chǔ),其厭氧發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生的SCFAs可調(diào)節(jié)腸道和宿主健康[4-5]。對大黃魚腸道菌群的體外研究表明,大黃魚腸道菌群可以合成SCFAs,添加0.5%復(fù)合海藻酶解物可增加丁酸合成量,并提升腸道菌群的α多樣性,提高擬桿菌門(Bacteroidota)和分類未定細(xì)菌門(unidentified Bacteria)的相對豐度,預(yù)測復(fù)合海藻酶解物可促進(jìn)大黃魚腸道健康,增加存活率和改善生長性能[17]。

為驗證海藻酶解物在大黃魚生產(chǎn)中的應(yīng)用效果,本試驗在大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病逐漸發(fā)生、流行的11—12月份使用添加0.5%的不同海藻酶解物(復(fù)合海藻酶解物與海帶酶解物)飼喂大黃魚8周,觀察添加0.5%的不同海藻酶解物對大黃魚存活率和生長的影響,并對腸道菌群結(jié)構(gòu)和特定菌群的豐度進(jìn)行分析,研究不同海藻酶解物對大黃魚腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的影響以及與存活率和生長的相關(guān)性,為大黃魚腸道菌群與健康的相關(guān)性研究以及開發(fā)海藻酶解物作為大黃魚飼料添加劑提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

褐藻寡糖為商品化產(chǎn)品,來源于海帶,是由α-L-古洛糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸組成的直鏈寡糖,聚合度(degree of polymerization,DP)為2～25的寡糖含量≥90%。

從大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病病例中分離的致病變形假單胞菌Pp-01和Pp-02由福建閩東水產(chǎn)研究所徐春霞老師惠贈。

1.2 試驗設(shè)計

試驗動物為福建寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司提供的當(dāng)年繁育的體重在(109.3±2.94) g的大黃魚幼魚。飼養(yǎng)試驗在該公司海水養(yǎng)殖場進(jìn)行,使用網(wǎng)箱進(jìn)行飼養(yǎng)。將大黃魚幼魚隨機(jī)分成3組,每組3個網(wǎng)箱(網(wǎng)箱規(guī)格1.0 m×1.0 m×2 m),每個網(wǎng)箱35尾。A組飼喂在基礎(chǔ)飼料中添加0.5%復(fù)合海藻酶解物的試驗飼料;D組飼喂在基礎(chǔ)飼料中添加0.5%海帶酶解物的試驗飼料;E組為對照組,飼喂不添加海藻酶解物的基礎(chǔ)飼料。大黃魚基礎(chǔ)飼料由41.4%進(jìn)口紅魚粉、22.0%面粉、15.1%大豆粕、10.0%雞肉粉、5.0%玉米蛋白粉、2.0%啤酒酵母和4.5%添加劑(多種維生素0.5%,礦物質(zhì)1.0%,磷酸二氫鈣1.5%,誘食劑1.0%,氯化膽堿0.5%)組成。按照配方將飼料原料及海藻酶解物混合均勻后制成浮性顆粒飼料,營養(yǎng)成分測定顯示A組、D組和E組飼料水分含量分別為4.7%、4.8%和4.3%,粗蛋白質(zhì)含量分別為41.5%、41.6%和41.7%,粗脂肪含量分別為8.1%、8.3%和8.0%,粗灰分含量分別為11.6%、11.7%和10.8%。

養(yǎng)殖試驗期間每天早、晚各表觀飽食投喂1次。試驗時間在2022年11—12月,養(yǎng)殖周期共56 d。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

1.3.1 成活率和平均增重測定

分組后稱重記錄每個網(wǎng)箱魚的初始體重,飼喂試驗結(jié)束后,饑餓24 h,對每個網(wǎng)箱魚進(jìn)行計數(shù)、稱重作為終末體重。按照如下公式計算存活率和平均增重:

存活率(%)=100×終末魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù);平均增重(g)=終末平均體重-初始平均體重。

1.3.2 腸道菌群分析

飼喂試驗結(jié)束后,饑餓24 h,準(zhǔn)備消毒過的解剖盤及解剖器械,從每組的3個重復(fù)網(wǎng)箱中每箱隨機(jī)采集1～2尾魚,共5尾魚,用75%酒精擦拭活體大黃魚體表,無菌剖檢,取出消化道,收集每尾魚的小腸和直腸內(nèi)容物、混勻,液氮冷凍備用。大黃魚腸道菌群的16S rDNA擴(kuò)增子測序分析均委托歐易生物技術(shù)(中國上海)有限公司進(jìn)行,使用NovaSeq PE250方案,經(jīng)過Reads拼接過濾、擴(kuò)增子序列變體(ASVs)聚類后進(jìn)行物種注釋及豐度分析、α多樣性分析和β多樣性分析等。

1.4 變形假單胞菌的生長抑制試驗

使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(每升含有蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、氯化鈉5 g,按照說明書配制后調(diào)節(jié)至pH至7.2)對變形假單胞菌進(jìn)行培養(yǎng),試驗組培養(yǎng)基中添加0.5%(m/v)的褐藻寡糖,空白對照組培養(yǎng)基中無添加,變形假單胞菌的接種量為0.7×107CFU/mL,有氧、25 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至15、20和24 h時采樣并使用600 nm波長光進(jìn)行吸光度測定。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃魚的存活和生長

經(jīng)過8周的飼喂,A組和D組存活率顯著高于E組(P<0.05),A組與D組存活率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);A組和D組平均增重顯著高于E組(P<0.05),D組終末體重顯著高于E組(P<0.05),A組與D組無顯著差異(P>0.05),見圖1。

a:海藻酶解物對大黃魚存活的影響;b:海藻酶解物對大黃魚生長的影響。數(shù)據(jù)柱或數(shù)據(jù)點(diǎn)顯示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(n=3)。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 腸道菌群分組差異性分析

腸道菌群的改變可能是海藻酶解物提高大黃魚存活和生長的主要原因。使用16S rDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)對腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。首先基于Weighted Unifrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)來反映不同分組的β多樣性。PCoA圖(圖2)顯示,A組、D組和E組大黃魚腸道菌群差異顯著[置換多元方差分析(PerMANOVA),P=0.015],表明各組可形成各自特征的菌群。

圖中的每個點(diǎn)表示1個樣本,同一個組的樣本使用同一種顏色表示,顏色區(qū)域代表置信區(qū)間。

2.2.2 腸道菌群特征和變化

對腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),A組大黃魚腸道菌群中ASVs種類最多,達(dá)到1 353種,其次是E組(749種),D組最少(242種)。3組間共有ASVs較少,且各個組的樣本間也存在明顯的個體差異,各個樣本共有的ASVs僅7個(圖3-a、圖3-b)。各組大黃魚腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異,A組中厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門、梭桿菌門(Fusobacteriota)和放線菌門(Actinobacteriota)的相對豐度占98%以上;D組中厚壁菌門和脫硫桿菌門(Desulfobacterota)的相對豐度占90%以上,變形菌門的相對豐度較低;E組中不同樣本的差異較大,但以厚壁菌門、脫硫桿菌門和變形菌門為主,部分樣本中擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門的相對豐度較高,見圖3-c。對草魚的研究顯示,草魚腸道菌群可分為2個功能組:功能組1(G1)由變形菌門組成,功能組2(G2)由梭桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門組成,功能組2/功能組1(G2/G1)比值可以作為有效反映草魚微生物群結(jié)構(gòu)和功能特征的生物標(biāo)志物(biomarker)[18]。3個組中G2(厚壁菌門、擬桿菌門和梭桿菌門)與G1(變形菌門)比值差異不顯著(P>0.05),中位數(shù)值均約為2.5,A組和D組中多數(shù)樣本高于E組,A組與D組相當(dāng),見圖3-d。

a、b:基于ASVs的韋恩圖;c:腸道菌群優(yōu)勢菌門相對豐度分析;d:G2/G1比值分析,其中G1(功能組1)為變形菌門相對豐度,G2(功能組2)為梭桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度之和;e:各組和各樣本腸道菌群屬水平物種豐度熱圖;f:α多樣性分析。圖中*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

對相對豐度排名前15的菌屬進(jìn)行聚類分析,繪制熱圖(圖3-e),發(fā)現(xiàn)在屬水平上3組物種相對豐度差異較大,結(jié)合各個樣本的菌群豐度差異,A組中普雷沃氏菌屬(Prevotella)、Muribaculaceae、放線菌屬(Actinomyces)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、碳酸噬胞菌屬(Capnocytophaga)、奈瑟菌屬(Neisseria)、纖毛菌屬(Leptotrichia)和乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度較高,這些菌屬在D組中相對豐度最低,D組中其他屬細(xì)菌、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)和支原體屬(Mycoplasma)相對豐度較高,E組中各個樣本物種相對豐度差異較大。

腸道菌群的α多樣性指數(shù)可以直觀反映組內(nèi)物種多樣性,圖3-f顯示3個組的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)均存在差異,各指數(shù)的中位數(shù)值均表現(xiàn)A組>E組>D組。

2.2.3 差異菌群分析

為了進(jìn)一步分析各組腸道菌群組成的差異,進(jìn)行LEfSe分析尋找各組中的生物標(biāo)志物。由圖4的線性判別分析(LDA)值分布柱狀圖可知,A組大黃魚腸道菌群中發(fā)現(xiàn)35個生物標(biāo)志物,LDA值大于4的有16個,包括普雷沃氏菌屬、棲糞桿菌屬(Faecalibacterium)、梭桿菌屬、瘤胃球菌屬扭鏈群(Ruminococcus_torques_group)和P5D1-392(屬);D組大黃魚腸道菌群中發(fā)現(xiàn)8個生物標(biāo)志物,LDA值均大于4,包括支原體屬和發(fā)光桿菌屬;E組大黃魚腸道菌群中發(fā)現(xiàn)4個生物標(biāo)志物,LDA值大于4的僅有變形菌門。由進(jìn)化分支圖(圖4)可見,A組生物標(biāo)志物不僅多且存在于多個距離較遠(yuǎn)的遺傳進(jìn)化分支上。

LDA值分布柱狀圖(圖a)主要展示了LDA值大于預(yù)設(shè)值(less strict設(shè)為2;more strict設(shè)為4)的物種,即具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)志物;柱狀圖的顏色代表各自的組別,長短代表的是LDA值,即不同組間差異顯著物種的影響程度。在進(jìn)化分支圖(圖b)中,由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由界(單個圓圈)至屬(或種)的分類級別,不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類,小圓圈直徑大小與物種相對豐度大小成正比;無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色,差異顯著的物種跟隨組別進(jìn)行著色,不同顏色表示在各自組別中起到重要作用的微生物類群。生物標(biāo)志物對應(yīng)的物種名展示在右側(cè),字母編號與圖中對應(yīng)。

組間排名前10的差異菌屬(生物標(biāo)志物)的相對豐度箱體圖(圖5-a)和樣本間排名前15的差異菌屬(生物標(biāo)志物)相對豐度熱圖(圖5-b)顯示,A組中各樣本普遍存在相對豐度較高的普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬、克雷伯菌屬(Klebsiella)、異普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)和毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group),發(fā)光桿菌屬和支原體屬相對豐度較低;與E組相比,D組中發(fā)光桿菌屬較豐富,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)相對豐度稍低,其他菌屬相對豐度與E組相當(dāng);僅E組各樣本中普遍存在相對豐度較高的比齊奧氏菌屬(Bizionia)、水桿菌屬(Aquabacterium)和支原體屬。

a:組間排名前10的差異菌屬(生物標(biāo)志物)的相對豐度箱體圖;b:樣本間排名前15的差異菌屬(生物標(biāo)志物)相對豐度熱圖。

2.3 特定菌群分析

2.3.1 丁酸合成相關(guān)細(xì)菌

斑馬魚上的研究發(fā)現(xiàn)丁酸可減少中性粒細(xì)胞和M1型促炎巨噬細(xì)胞向傷口的募集而產(chǎn)生抗炎作用,且這種抗炎作用在魚類中具有普遍性[19]。我們前期的體外研究發(fā)現(xiàn),擬桿菌門的產(chǎn)酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)、單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis)、普通擬桿菌(Bacteroidesvulgatus)、腸鼠桿菌(Muribaculumintestinale)和金氏類擬桿菌(Parabacteroidesgoldsteinii)與丁酸的合成呈正相關(guān)[17]。此外,擬桿菌屬的多種細(xì)菌在代謝碳水化合物產(chǎn)生SCFAs上有重要作用[20]。對3組大黃魚腸道菌群中擬桿菌屬細(xì)菌和與丁酸合成呈正相關(guān)細(xì)菌的相對豐度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),A組樣本的中位數(shù)值均大于D組和E組,D組和E組處于相同水平,見圖6。

圖6 海藻酶解物對大黃魚腸道菌群中擬桿菌屬細(xì)菌和與丁酸合成呈正相關(guān)細(xì)菌相對豐度的影響

2.3.2 假單胞菌屬細(xì)菌

內(nèi)臟白點(diǎn)病是大黃魚養(yǎng)殖中的主要病害之一,假單胞菌屬的變形假單胞菌是大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病的主要致病原[21]。變形假單胞菌廣泛存在于土壤、淡水和海水環(huán)境中,在大黃魚腸道中較為常見,該菌在腸道中的大量繁殖可能是導(dǎo)致內(nèi)臟白點(diǎn)病的關(guān)鍵。我們在海藻酶解物對體外培養(yǎng)的大黃魚腸道菌群的研究中發(fā)現(xiàn)海帶酶解物可降低假單胞菌屬的相對豐度[17]。本次飼喂試驗發(fā)現(xiàn),飼料中添加0.5%海帶酶解物的D組樣本中假單胞菌屬細(xì)菌相對豐度和絕對豐度的中位數(shù)值小于處于相同水平A組和E組,且D組中樣本假單胞菌屬細(xì)菌相對豐度均較低,A組和E組中少量樣本的相對豐度較高,見圖7。

圖7 海藻酶解物對大黃魚腸道菌群中假單胞菌屬細(xì)菌豐度的影響

為進(jìn)一步確認(rèn)海帶酶解物對假單胞菌屬細(xì)菌生長的抑制作用,使用由海帶降解獲得并純化的褐藻寡糖進(jìn)行大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病病例中分離的致病變形假單胞菌的生長抑制試驗,結(jié)果顯示培養(yǎng)基中添加0.5%褐藻寡糖可以顯著或極顯著地抑制變形假單胞菌的生長(P<0.05或P<0.01),見圖8。

a:變形假單胞菌Pp-01;b:變形假單胞菌Pp-02。CONT:空白對照組;AOS:添加0.5%褐藻寡糖的試驗組。數(shù)據(jù)點(diǎn)顯示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(n=4)。CONT數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注“*”表示與AOS相比差異顯著(P<0.05),標(biāo)注“**”表示與AOS相比差異極顯著(P<0.01)。培養(yǎng)條件:營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,接種量0.7×107 CFU/mL,有氧、25 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)。

2.4 腸道菌群功能差異

使用PICRUSt2(2.3.0b0)基于16S序列來預(yù)測已知微生物基因功能的構(gòu)成,從而統(tǒng)計不同樣本和組別之間在功能上的差異?；贙EGG進(jìn)行第3層次水平(level3)上的功能預(yù)測表明A組、D組和E組腸道菌群在淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system)、氰基氨基酸代謝(cyanoamino acid metabolism)、亨廷頓病(Huntington’s disease)和其他糖降解(other glycan degradation)上有顯著差異(P<0.05,圖9-a),這種差異在各組中的樣本上存在個體差異(圖9-b)。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),A組腸道菌群對糖的代謝增強(qiáng)(淀粉和蔗糖代謝、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、其他糖降解),同時胰島素抵抗增強(qiáng);D組腸道菌群對糖的代謝較弱,胰島素抵抗功能也較弱;E組不同樣本的腸道菌群對糖的代謝能力差異較大,但對糖的代謝增強(qiáng)也會伴隨胰島素抵抗增強(qiáng)。D組腸道菌群在谷胱甘肽代謝和氰基氨基酸代謝上弱于A組和E組;同時,相比E組,A組和D組腸道菌群對硝基甲苯、氯環(huán)己烷和氯苯、苯乙烯等有害物質(zhì)的降解能力可能會降低。

a:Kruskal-Wallis統(tǒng)計組間差異顯著的KEGG預(yù)測結(jié)果;b:樣本間豐度有顯著差異的前15個KEGG預(yù)測結(jié)果的熱圖。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示飼料中添加0.5%復(fù)合海藻酶解物或0.5%海帶酶解物均可以顯著提高大黃魚的存活并促進(jìn)生長,但兩者調(diào)節(jié)形成的腸道菌群不同,基于16S序列的KEGG功能預(yù)測顯示兩者腸道菌群功能差異顯著。

大黃魚飼喂試驗開展于2022年11—12月,期間試驗所在海域水溫由23 ℃逐漸降至18 ℃,水體中溶解氧(DO)含量在6.1～7.9 mg/L,該條件下大黃魚采食量逐漸下降,內(nèi)臟白點(diǎn)病等腸道細(xì)菌性疾病進(jìn)入流行期,飼喂結(jié)束后發(fā)現(xiàn)對照組大黃魚的存活率僅為46.7%,0.5%復(fù)合海藻酶解物組和0.5%海帶酶解物組大黃魚的存活率提高了20%。腸道菌群與動物的健康密切相關(guān)[22-23],其中關(guān)鍵的連接紐帶可能是腸道菌群合成的SCFAs,尤其是丁酸[9,19]。草魚腸道菌群可分為2個功能組:功能組1(G1)由變形菌門組成,該功能組細(xì)菌攜帶更多的毒力因子基因(VF)和抗生素抗性基因(ARG);功能組2(G2)由梭桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門組成,該功能組細(xì)菌富集了編碼降解阿拉伯木聚糖、果膠、黏蛋白、菊粉和纖維素的酶基因,可促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生,較高的G2/G1比值反映腸道菌群較為健康[18]。

本研究中,0.5%復(fù)合海藻酶解物組和0.5%海帶酶解物組G2/G1比值的中位數(shù)相當(dāng),高于對照組,且多數(shù)樣本的該比值高于對照組。我們前期的體外研究表明,添加0.5%復(fù)合海藻酶解物可顯著增加丁酸的合成量,其中擬桿菌門中以產(chǎn)酸擬桿菌、單形擬桿菌、普通擬桿菌和腸鼠桿菌等細(xì)菌與丁酸合成呈正相關(guān),而添加0.5%的海帶酶解物未顯示出這種效果[17]。0.5%復(fù)合海藻酶解物組擬桿菌屬細(xì)菌和與丁酸合成正相關(guān)細(xì)菌的相對豐度高于處于相似水平的0.5%海帶酶解物組和對照組,表明飼喂添加0.5%復(fù)合海藻酶解物的飼料可以促進(jìn)大黃魚腸道菌群合成丁酸,這和我們前期對大黃魚腸道菌群體外培養(yǎng)所得結(jié)果一致。普雷沃氏菌屬[24]、Muribaculaceae[25]、放線菌屬[26]、梭桿菌屬[27]、纖毛菌屬[28]和乳桿菌屬[29]均是具有益生功能的細(xì)菌,0.5%復(fù)合海藻酶解物還顯著提高了大黃魚腸道中這些具有益生功能的細(xì)菌的相對豐度和腸道菌群的α多樣性,這可能是其能顯著提高大黃魚存活率的原因。

大黃魚腸道菌群體外培養(yǎng)時添加0.5%海帶酶解物未增加丁酸的合成量[17],本研究中飼喂0.5%海帶酶解物也未提高大黃魚腸道中與丁酸合成相關(guān)細(xì)菌的相對豐度和普雷沃氏菌屬、Muribaculaceae等具有益生功能的細(xì)菌的相對豐度,并降低了腸道菌群的α多樣性,但也顯著提高了大黃魚的存活率,表明飼喂0.5%海帶酶解物提高大黃魚存活率的機(jī)制與飼喂0.5%復(fù)合海藻酶解物是不同的。每年11月至次年的5月是中國福建寧德市周邊海域大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病逐漸進(jìn)入高發(fā)的時期[30]。內(nèi)臟白點(diǎn)病是大黃魚養(yǎng)殖中的主要病害之一,發(fā)病后死亡率高達(dá)70%～80%,病原是變形假單胞菌屬的變形假單胞菌[21,31]。變形假單胞菌廣泛存在于土壤和海水環(huán)境中,在大黃魚腸道中較為常見,該菌為專性需氧菌,正常狀態(tài)下腸道內(nèi)厭氧環(huán)境抑制其生長。春冬季時,海水溶氧量升高,可能促進(jìn)了變形假單胞菌的生長[30],該菌達(dá)到一定豐度可引起腸道菌群紊亂,進(jìn)而破壞腸道的免疫屏障,導(dǎo)致變形假單胞菌入侵宿主引發(fā)菌血癥,在脾臟、腎臟和肝臟等器官形成感染性肉芽腫導(dǎo)致宿主死亡[32]。在大黃魚腸道菌群體外培養(yǎng)時添加0.5%海帶酶解物可以降低假單胞屬的相對豐度[17],飼喂試驗中也發(fā)現(xiàn)0.5%海帶酶解物組假單胞菌屬細(xì)菌的相對豐度和絕對豐度小于處于相同水平的0.5%復(fù)合海藻酶解物組和對照組,且其各個樣本的假單胞菌屬細(xì)菌豐度均較低。變形假單胞菌的生長抑制試驗也進(jìn)一步證實(shí)0.5%褐藻寡糖可以極顯著地抑制該菌的生長,飼喂0.5%海帶酶解物可能通過減少大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病的發(fā)生而提高其存活率。

同時,研究發(fā)現(xiàn)飼喂0.5%復(fù)合海藻酶解物或0.5%海帶酶解物可以顯著促進(jìn)大黃魚增重。海藻作為飼料原料或海藻提取物作為添加劑可以促進(jìn)生長已在多種魚上得到證實(shí)。郭斌等[3]證實(shí)江蘺、滸苔和藻渣(褐藻藻渣)作為飼料原料可以促進(jìn)大菱鲆幼魚的生長,林建斌等[33]報道飼料中添加0.6%的海帶多糖可以提高珍珠龍膽石斑魚的生長,楊晴等[34]報道飼料中添加有效濃度為0.1%的褐藻糖膠可以提高黃顙魚的增重率和特定生長率。本研究中飼喂含0.5%復(fù)合海藻酶解物或0.5%海帶酶解物的飼料均顯著促進(jìn)了大黃魚的生長,與現(xiàn)有的研究結(jié)果一致。研究已經(jīng)證明腸道菌群與生長密切相關(guān)[35-36]。大黃魚飼喂含0.5%復(fù)合海藻酶解物的飼料8周后,腸道菌群主要由厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門組成,而飼喂0.5%海帶酶解物飼料的大黃魚腸道菌群主要由厚壁菌門、脫硫桿菌門和低豐度的變形菌門組成,這與對照組以厚壁菌門、脫硫桿菌門和變形菌門為主,部分樣本中擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門相對豐度較高存在較大差異。細(xì)菌屬水平上,0.5%復(fù)合海藻酶解物組腸道菌群中存在豐富的普雷沃氏菌屬、Muribaculaceae和乳桿菌屬等益生菌,但這些細(xì)菌在0.5%海帶酶解物組和對照組中的相對豐度均較低,且相較于對照組,0.5%海帶酶解物組中多數(shù)樣本的其他屬細(xì)菌和發(fā)光桿菌屬相對豐度較高,這些表明相對于對照組魚群腸道菌群表現(xiàn)出的個體多樣性,0.5%海帶酶解物調(diào)整了魚群的腸道菌群結(jié)構(gòu),使整個魚群的腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于一致。同時,基于16S的KEGG功能預(yù)測顯示0.5%復(fù)合海藻酶解物調(diào)節(jié)形成的腸道菌群對糖的代謝和胰島素抵抗增強(qiáng),而0.5%海帶酶解物調(diào)節(jié)形成的腸道菌群對糖的代謝和胰島素抵抗最弱,在谷胱甘肽和氰基氨基酸代謝上也最弱,這些都和對照組腸道菌群的預(yù)測功能不同。大黃魚是肉食性魚類,對糖的耐受能力較差,較低的血糖濃度即抑制其生長[37]。0.5%復(fù)合海藻酶解物調(diào)節(jié)形成的腸道菌群加強(qiáng)了對各種糖的代謝,SCFAs等糖代謝產(chǎn)物可能促進(jìn)了大黃魚生長;0.5%海帶酶解物的作用則相反,可能降低了機(jī)體對糖及代謝物的攝入,并降低了對谷胱甘肽和氰基氨基酸代謝,進(jìn)而促進(jìn)了大黃魚的生長。此外,0.5%海帶酶解物組中觀察到的ASVs最少(242種),其中112種與對照組共有,α多樣性分析也顯示0.5%復(fù)合海藻酶解物組腸道菌群最為多樣,0.5%海帶酶解物組略低于對照組。這些結(jié)果表明,雖然復(fù)合海藻酶解物和海帶酶解物有47%的共同組分是海帶,但兩者引導(dǎo)發(fā)育的腸道菌群差異較大,本研究尚不能明確促進(jìn)大黃魚生長的腸道菌群組成或者具體細(xì)菌及其豐度,但可表明腸道菌群的α多樣性與促生長作用并非正相關(guān)。

本研究中發(fā)現(xiàn)大黃魚采食含0.5%復(fù)合海藻酶解物和0.5%海帶酶解物飼料后腸道菌群組成和菌群功能差異明顯。本試驗中的復(fù)合海藻酶解物由29%的條斑紫菜、24%的石莼和47%海帶組成的復(fù)合海藻酶解制成,而海帶酶解物則全部為海帶酶解制成。0.5%復(fù)合海藻酶解物組大黃魚腸道菌群的α多樣性顯著高于0.5%海帶酶解物組,0.5%海帶酶解物組和對照組差異不顯著,這和我們前期對大黃魚腸道菌群體外培養(yǎng)時添加0.5%復(fù)合海藻酶解物和0.5%海帶酶解物后所得結(jié)果一致。同時,研究顯示,在大黃魚幼魚的飼料中添加1.00%或2.00%的褐藻糖膠(fucoidan)可以改變腸道菌群的整體結(jié)構(gòu),增加擬桿菌門的相對豐度,降低機(jī)會性病原體和兼性厭氧菌的相對豐度,促進(jìn)大黃魚幼魚的生長[4]。這些結(jié)果表明支鏈化、硫酸化的海藻多糖可以增加大黃魚腸道菌群α多樣性,但可能作用劑量與支鏈化、硫酸化程度相關(guān),使用較低劑量的支鏈化、硫酸化程度較高的海藻多糖即可增加大黃魚腸道菌群的α多樣性,促進(jìn)合成丁酸的擬桿菌屬細(xì)菌的增殖。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示,飼喂含0.5%復(fù)合海藻酶解物或0.5%海帶酶解物的飼料均可以促進(jìn)大黃魚的健康生長,兩者調(diào)節(jié)大黃魚形成的腸道菌群結(jié)構(gòu)不同,表明作用機(jī)制存在差異,0.5%復(fù)合海藻酶解物提高了大黃魚腸道菌群α多樣性和合成丁酸的擬桿菌屬細(xì)菌的相對豐度,0.5%海帶酶解物降低了大黃魚腸道菌群α多樣性并抑制了假單胞菌屬細(xì)菌的生長,海藻硫化多糖和褐藻寡糖是形成這種差異的關(guān)鍵。