李華北 段嘉鈺 蔣林樹 敖長金* 白 晨*
(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室,呼和浩特 010018;2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京農(nóng)學(xué)院奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室,北京 102208)
奶牛氧化應(yīng)激受到自身及外界多種因素的影響。氧化應(yīng)激能夠引起機(jī)體功能紊亂,甚至免疫系統(tǒng)損傷,從而降低機(jī)體免疫功能。奶牛氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)對奶牛機(jī)體的損傷更增加了奶牛對疾病的感染風(fēng)險,進(jìn)一步引發(fā)奶牛乳房炎及生殖障礙,嚴(yán)重地降低了高產(chǎn)奶牛的生產(chǎn)性能及利用年限[1]。盧德勛[2]系統(tǒng)地提出氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)-免疫功能失衡之間的聯(lián)系,并總結(jié)出一個問題三個互相聯(lián)動方面的理論,揭示了氧化應(yīng)激是在動物生產(chǎn)中引起炎癥反應(yīng)、免疫功能失衡的重要影響因素。隨著我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)模化進(jìn)程的不斷加快,奶牛單產(chǎn)水平不斷提高,隨之而來的是高產(chǎn)奶牛體內(nèi)代謝壓力劇增,尤其在泌乳高峰期代謝最為旺盛,更易給個體帶來氧化應(yīng)激的問題[3]。
部分植物提取物具有提高奶牛機(jī)體抗氧化、抗炎及免疫能力的顯著功效,因此被研究者廣泛研究。沙蔥是我國西北半荒漠地區(qū)特有的蔥屬植物,廣泛分布于內(nèi)蒙古、陜西、甘肅等省份。沙蔥及其提取物被證實具有調(diào)節(jié)反芻動物免疫力[4]、抗氧化能力[5]、抗炎[6]和促進(jìn)生長[7]等生物學(xué)功能,特別是其對消除羊肉的膻味具有獨特效果[8]。沙蔥常見粗提物類型包括沙蔥乙醇類提取物[9]、多糖類提取物[10]、精油類提取物[11]。有學(xué)者利用超高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn),沙蔥的乙醇提取物中富含黃酮類、有機(jī)酸類、核苷酸類等多種生物活性物質(zhì)[4]。目前,沙蔥提取物對肉羊的免疫、抗氧化能力的影響及機(jī)制研究已經(jīng)較為深入,但對奶牛的影響尚不明確。因此,本試驗旨在通過在飼糧中添加沙蔥乙醇提取物,探究其對泌乳中期奶牛血漿生化、免疫、抗氧化和激素指標(biāo)的影響,以期豐富沙蔥提取物生物活性功能的系統(tǒng)研究,并為其在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)。
鮮沙蔥購買于內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善左旗,65 ℃烘干、粉碎后備用。沙蔥乙醇提取物采用超聲波提取工藝,使用75%乙醇在真空條件下蒸發(fā)濃縮,將濃縮液制備成凍干粉末,具體提取過程參考薩茹麗[12]優(yōu)化的沙蔥乙醇提取物制備方法。沙蔥乙醇提取物的得率為28%,其主要活性成分及含量分別為:黃酮類(26.43%)、有機(jī)酸及其衍生物(18.57%)、核苷酸及其衍生物(14.43%)、氨基酸(11.14%)、羥基肉桂酰衍生物(4.43%)、氨基酸類衍化物(3.14%)、酚胺(2.35%)、維生素(1.55%)、膽堿(1.00%)、脂類(7.22%)等[4]。
試驗地點位于內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市杭錦后旗(經(jīng)度:E106°34′~107°24′,緯度:N40°26′~41°13′)。選取12頭2~3胎次、體況和泌乳量相近、處于泌乳中期的健康荷斯坦奶牛,體重(605.92±11.30) kg。采用單因素隨機(jī)試驗設(shè)計,將12頭奶牛隨機(jī)分為2組,每組6個重復(fù),每個重復(fù)1頭。對照組奶牛飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗組奶牛飼喂基礎(chǔ)飼糧+54 g/d沙蔥乙醇提取物。沙蔥乙醇提取物飼喂劑量依據(jù)課題組體外瘤胃液培養(yǎng)試驗及奶牛干物質(zhì)采食量計算得出[13]。每天采用灌服的方式飼喂沙蔥乙醇提取物,以確保奶牛完全采食規(guī)定劑量的沙蔥乙醇提取物。試驗共持續(xù)56 d,包括預(yù)試期14 d,正試期42 d。每天02:00、14:00投喂飼料,每天01:30、09:00、16:00擠奶。試驗期間奶牛自由采食、飲水和活動,同時保持牛舍潔凈。
基礎(chǔ)飼糧依據(jù)NRC(2001)[14]奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制,其組成及營養(yǎng)水平如表1所示。飼糧中干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量按照GB/T 18868—2002[15]進(jìn)行測定,中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量采用范氏(Van Soest)方法進(jìn)行測定,粗灰分、鈣、磷含量分別按照GB/T 6438—2007[16]、GB/T 6436—2018[17]、GB/T 6437—2018[18]進(jìn)行測定,泌乳凈能(NEL)依據(jù)NRC(2001)[14]數(shù)據(jù)計算獲得。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))
在正試期第42天,以頸靜脈采血的方式采集每頭奶牛血液40 mL,利用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管收集,在1 295×g條件下離心10 min,得到血漿,放入1.5 mL離心管,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.5.1 血漿生化指標(biāo)
測定血漿總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、肌酐(CR)、膽固醇(CHOL)、葡萄糖(GLU)、尿素(UREA)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性,試劑盒均購于北京樂普生物科技有限公司,測定步驟嚴(yán)格按照試劑盒產(chǎn)品說明書操作方法進(jìn)行操作,使用全自動血液生化分析儀(日立3110,Hitachi公司,日本)進(jìn)行檢測。
1.5.2 血漿抗氧化指標(biāo)
測定血漿過氧化氫酶(CAT)(鉬酸銨法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(比色法)、超氧化物歧化酶(SOD)(羥胺法)活性和谷胱甘肽(GSH)(微板法)、丙二醛(MDA)(TBA法)含量及總抗氧化能力(T-AOC)(ABTS法),試劑盒均購于南京建成生物工程研究所,測定步驟嚴(yán)格按照試劑盒產(chǎn)品說明書操作方法進(jìn)行操作,利用酶標(biāo)儀(SYNERGY-H1,BioTek公司,美國)進(jìn)行檢測。
1.5.3 血漿免疫指標(biāo)
測定血漿免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)含量,試劑盒均購于江蘇晶美生物科技有限公司,測定步驟嚴(yán)格按照試劑盒產(chǎn)品說明書操作方法進(jìn)行操作,利用酶標(biāo)儀(SYNERGY-H1,BioTek公司,美國)進(jìn)行檢測。
1.5.4 血漿激素指標(biāo)
測定血漿生長激素(GH)、催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、胰島素(INS)、皮質(zhì)醇(HYD)含量,試劑盒均購于江蘇晶美生物科技有限公司,測定步驟嚴(yán)格按照試劑盒產(chǎn)品說明書操作方法進(jìn)行操作,利用酶標(biāo)儀(SYNERGY-H1,BioTek公司,美國)進(jìn)行檢測。
試驗數(shù)據(jù)使用WPS 2022進(jìn)行初步整理統(tǒng)計后,使用SAS 9.2軟件中t檢驗進(jìn)行分析,結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)的形式表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。
據(jù)表2可知,試驗組的血漿GLU、TP、ALB、GLB、CR、CHOL含量均高于對照組,UREA含量和ALT、AST、ALP活性均低于對照組,但2組之間差異均不顯著(P>0.05)。
表2 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿生化指標(biāo)的影響
據(jù)表3可知,試驗組的血漿GSH含量和GSH-Px活性顯著高于對照組(P<0.05),且血漿SOD活性極顯著高于對照組(P<0.01)。試驗組的血漿T-AOC高于對照組,血漿CAT活性和MDA含量低于對照組,但2組之間差異均不顯著(P>0.05)。
表3 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿抗氧化指標(biāo)的影響
據(jù)表4可知,試驗組的血漿IL-2和IL-10含量顯著高于對照組(P<0.05),血漿IL-6含量極顯著低于對照組(P<0.01)。試驗組的血漿IgG、IgM、IFN-γ含量高于對照組,血漿IgA、TNF-α含量低于對照組,但2組之間差異均不顯著(P>0.05)。
表4 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿免疫指標(biāo)的影響
表5 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿激素指標(biāo)的影響
據(jù)表4可知,試驗組的血漿GH、PRL、E2含量低于對照組,血漿INS、HYD含量高于對照組,但2組之間差異均不顯著(P>0.05)。
血漿生化指標(biāo)能夠直接或間接反映機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及機(jī)體各組織器官之間功能表達(dá)[19],其中血漿GLU含量在一定程度上能夠反映機(jī)體糖代謝狀況,血漿UREA含量降低反映機(jī)體對氮的利用率提高。有研究發(fā)現(xiàn),奶牛在泌乳階段易出現(xiàn)能量負(fù)平衡現(xiàn)象,主要變化之一便是GLU含量降低(GLU含量<2.5 mmol/L)[20]。本試驗中,沙蔥乙醇提取物能夠提高泌乳中期奶牛血漿GLU含量,同時降低血漿UREA含量。其原因可能是沙蔥乙醇提取物促進(jìn)瘤胃微生物繁殖,增加原蟲數(shù)量以及促進(jìn)瘤胃微生物蛋白的合成,促進(jìn)機(jī)體對蛋白質(zhì)的吸收利用,提高機(jī)體對氮的利用率,同時促進(jìn)碳水化合物向丙酸發(fā)酵模式的轉(zhuǎn)變,為機(jī)體提供能量[21]。有研究表明,沙棘黃酮能夠提高羊血清GLU含量,降低血清尿素氮(UN)含量[22],與本試驗結(jié)果相同。
GLB是機(jī)體主要的免疫性蛋白質(zhì),包括IgG、IgM、IgA等多種免疫球蛋白,是組成機(jī)體體液免疫的重要物質(zhì),同時能夠刺激淋巴系統(tǒng)消除病原體對機(jī)體的危害[23]。本試驗結(jié)果表明,沙蔥乙醇提取物能夠提高機(jī)體血漿GLB含量,說明沙蔥乙醇提取物具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用。這與諸多關(guān)于植物提取調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的報道結(jié)果相同[24]。ALP是機(jī)體對鈣、磷吸收機(jī)能變化的敏感指標(biāo),能反映出機(jī)體骨骼的發(fā)育狀態(tài),當(dāng)其活性升高表明動物鈣離子代謝出現(xiàn)異常,機(jī)體骨骼代謝紊亂,造成骨骼疾病發(fā)生[25]。本試驗中,沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿中ALP活性無顯著影響,且ALP活性在正常范圍內(nèi)。腎臟、肝臟是機(jī)體重要的解毒器官,有著重要的解毒防御作用。CR是一種存在于血液中的外源性代謝產(chǎn)物,CR需通過腎臟排出體外,當(dāng)腎臟功能損傷,血液中CR含量升高,因此血液CR含量通常作為評判腎臟正常生理功能的重要指標(biāo)[26-27]。TP、ALB含量均能夠反映肝臟正常生理功能。ALB是維持血漿滲透壓的重要物質(zhì),在血液中與有機(jī)物或無機(jī)離子結(jié)合,幫助其在血液中的運(yùn)輸;同時,ALB可以與重金屬離子結(jié)合,消除重金屬離子對機(jī)體的毒害作用;通過TP、ALB指標(biāo)綜合判斷,肝臟蛋白質(zhì)合成的生理功能正常。
AST、ALT主要存在于心肌及肝臟細(xì)胞中,當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷時,血液中AST、ALT活性會顯著升高[28]。本試驗中,采食沙蔥乙醇提取物的奶牛血漿ALT、AST活性在數(shù)值上有一定程度的降低,這可能與沙蔥乙醇提取物調(diào)節(jié)體能量代謝有關(guān)。有研究表明,處于能量負(fù)平衡狀態(tài)下奶牛脂動員加強(qiáng),產(chǎn)生大量非酯化脂肪酸,使肝臟中產(chǎn)生大量MDA和活性氧(ROS),誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶-p53/核因子E2相關(guān)因子凋亡通路的過度激活,導(dǎo)致肝臟損傷[29]。沙蔥乙醇提取物調(diào)節(jié)肝臟脂代謝,減少氧化物質(zhì)對肝臟的損傷,對奶牛的肝臟具有一定的保護(hù)作用。根據(jù)本試驗結(jié)果顯示,沙蔥乙醇提取物對奶牛機(jī)體糖代謝、骨骼代謝及肝臟、腎臟等正常生理功能無影響。
奶牛在生產(chǎn)過程中受到多種應(yīng)激因素影響,易產(chǎn)生過量ROS,當(dāng)超過機(jī)體抗氧化系統(tǒng)清除能力時則產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過量的活性氧刺激機(jī)體代謝增強(qiáng),發(fā)生脂質(zhì)過氧化,并引起DNA、RNA、酶類、脂質(zhì)等氧化,破壞細(xì)胞完整性,對機(jī)體造成損傷[30]。有研究發(fā)現(xiàn),組織氧化自由基的產(chǎn)生量與耗氧量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系[31]。泌乳中期的奶牛處于牛奶合成的較大生理壓力條件下,伴隨著對能量和氧氣需求的增加,乳腺細(xì)胞有氧呼吸作用增強(qiáng)導(dǎo)致產(chǎn)生大量ROS[32]。體內(nèi)ROS大量積累致使抗氧化酶產(chǎn)生減少,內(nèi)源性抗氧化物減少,影響正常生理功能,從而可能導(dǎo)致奶牛的氧化應(yīng)激[33]。此外,ROS過多的積累會對機(jī)體免疫系統(tǒng)造成損傷,降低機(jī)體免疫力及生產(chǎn)性能。有研究發(fā)現(xiàn),ROS不斷積累會激活氧化還原敏感信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,誘導(dǎo)促炎因子基因的表達(dá),從而啟動炎癥反應(yīng)。而且進(jìn)一步造成免疫細(xì)胞氧化損傷,降低機(jī)體免疫力[34]。
機(jī)體內(nèi)存在抗氧化酶系統(tǒng)與抗氧化非酶系統(tǒng)共同作用,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[35-37]。目前增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的方式主要通過提高抗氧化酶活性以及提高機(jī)體內(nèi)抗氧化非酶物質(zhì)含量,來提高機(jī)體抗氧化能力。本試驗中,采食沙蔥乙醇提取物的奶牛血漿GSH-Px、SOD活性升高,血漿MDA含量降低,這可能與由于沙蔥乙醇提取物中含有多種抗氧化物質(zhì)有關(guān)。部分黃酮類物質(zhì)通過激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路,促進(jìn)內(nèi)源性抗氧化酶的表達(dá),增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[38]。同時沙蔥乙醇提取物可能改變牛瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu),促進(jìn)碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸等有機(jī)酸,降低能量負(fù)平衡。有研究表明,部分有機(jī)酸類化合物能夠參與三羧酸循環(huán)供能,降低機(jī)體脂動員,減少機(jī)體MDA的產(chǎn)生[39]。李澤青等[40]研究復(fù)合有機(jī)酸能夠提高仔豬血清SOD和GSH-Px活性,同時降低血清MDA含量,提高仔豬抗氧化能力。肖凡[41]將大豆異黃酮飼喂荷斯坦奶牛犢牛后,發(fā)現(xiàn)血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC均顯著升高,且血清MDA含量降低。Ding等[42]將沙蔥粉飼飼喂杜寒羊后,發(fā)現(xiàn)血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC均顯著升高,血清MDA含量顯著降低。同時,徐珊珊等[7]在對沙蔥精油對羊的抗氧化研究中也有相同發(fā)現(xiàn)。
免疫球蛋白與抗原的特異性結(jié)合致使抗原失去致病能力,在體液免疫過程中發(fā)揮重要作用。IgG是血液中含量最高的免疫球蛋白,在體液免疫中發(fā)揮主要作用。免疫球蛋白含量的升高表明機(jī)體對病原體的抵抗能力增強(qiáng)。木其爾等[43]在探究沙蔥黃酮對肉羊免疫能力的研究中也得到沙蔥提取物可以顯著提高血清IgG含量,從而得出沙蔥黃酮具有調(diào)節(jié)肉羊免疫功能的結(jié)論。同樣,在沙棘黃酮對肉羊免疫功能的研究中也得到相似結(jié)論[44]。IL-2是一種重要的免疫應(yīng)答調(diào)控因子,具有促進(jìn)B細(xì)胞與T細(xì)胞的增殖活化,同時能溶解遭受病毒感染的細(xì)胞。IL-6由單核巨噬細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生,屬于B細(xì)胞分化因子,是一種多功能細(xì)胞因子,可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、造血、急性期反應(yīng)和炎癥,可增進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖,激活殺傷性T淋巴細(xì)胞和參與炎癥反應(yīng),因此IL-6是一種促炎癥細(xì)胞因子[45]。有研究表明,IL-6由巨噬細(xì)胞受到刺激后,激活核因子-κB(NF-κB)信號通路而被大量釋放[46]。本試驗中,沙蔥乙醇提取物通過提高奶牛血漿中抗炎因子IL-2、IL-10含量,降低促炎因子IL-6含量,對奶牛的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。這可能是由于沙蔥乙醇提取物中含有黃酮類物質(zhì),可抑制NF-κB信號通路,降低促炎因子IL-6的mRNA表達(dá),同時調(diào)節(jié)抗炎因子的mRNA表達(dá),從而提高機(jī)體抗炎能力。
王特日格樂[47]研究發(fā)現(xiàn),沙蔥總黃酮能夠抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NF-κB信號通路,從而降低促炎因子TNF-α、IL-6、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)及炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)的mRNA表達(dá),同時能提高IL-10的mRNA表達(dá),達(dá)到降低炎癥的效果。Vizzotto等[48]研究發(fā)現(xiàn),綠茶提取物中含有兒茶素、表兒茶素等多種黃酮類物質(zhì),能夠提高奶牛血液中IgG及抗炎因子含量,降低促炎因子含量,提高奶牛免疫力及抗炎能力。王翠芳[49]采用灌胃方式給與小鼠沙蔥提取物,檢測相關(guān)炎癥因子后發(fā)現(xiàn),沙蔥提取物能夠顯著抑制IL-6的分泌,并顯著提高血液中IL-10含量,其結(jié)果與本試驗的結(jié)果一致。
前人研究發(fā)現(xiàn),植物源黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)與動物機(jī)體雌激素的結(jié)構(gòu)相似,能與機(jī)體雌激素受體結(jié)合從而發(fā)揮雌激素的生物學(xué)功能,并能夠顯著影響機(jī)體激素的分泌[50]。黃酮類化合物是沙蔥乙醇提取物的主要成分之一[51]。機(jī)體的生長發(fā)育需要多種激素的共同作用,其中GH促進(jìn)組織生長發(fā)育,PRL、E2能夠促進(jìn)乳房的發(fā)育及促進(jìn)乳腺的泌乳[52-53]。研究發(fā)現(xiàn),大豆異黃酮通過促進(jìn)雌激素受體α的表達(dá),促進(jìn)乳合成和乳腺上皮細(xì)胞的增殖[54]。本試驗結(jié)果表明,沙蔥乙醇提取物對泌乳中期奶牛激素指標(biāo)并無顯著影響。官麗輝等[55]在壩上長尾雞飼糧中添加大豆異黃酮后發(fā)現(xiàn)雌激素含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,并未受到顯著影響,這與本試驗結(jié)果類似,其原因可能是異黃酮具有雌激素生物活性,高劑量黃酮類化合物與機(jī)體內(nèi)源性雌激素爭奪受體,導(dǎo)致雌激素分泌減少[56]。有報道指出,當(dāng)飼糧營養(yǎng)水平降低時會促進(jìn)動物生長素釋放肽O-?;D(zhuǎn)移酶的表達(dá),從而促進(jìn)GH、INS等激素的分泌[57],而胰島素的分泌受到GLU含量的調(diào)控,本試驗結(jié)果中血漿GLU含量相對穩(wěn)定,這可能是INS含量沒有顯著變化的原因。
飼糧中添加54 g/d沙蔥乙醇提取物能增強(qiáng)泌乳中期奶牛的免疫、抗氧化能力,且對奶牛血漿生化指標(biāo)無不良影響。