賴安強(qiáng) 金亞?wèn)| 陳彬龍 王中成 黃艷茹 羅浩岑 鄧開美 張 誼*

(1.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,西昌 615000;2.四川地方特色山羊?qū)嶒?yàn)室,西昌 615000;3.涼山州寧南縣農(nóng)村產(chǎn)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心,寧南 615400)

甘蔗渣是甘蔗制糖的主要副產(chǎn)物,是一種重要的可再生生物資源。中國(guó)每年甘蔗渣的產(chǎn)量在2 000萬(wàn)t左右[1],但甘蔗渣多數(shù)被作為生物燃料,未充分發(fā)揮其價(jià)值。甘蔗的收獲季節(jié)通常在每年的12月至翌年3—4月,此時(shí)是南方冬、春季節(jié)缺草期。如對(duì)甘蔗渣進(jìn)行一定的處理,提高其飼喂價(jià)值,可有效緩解南方冬、春草食動(dòng)物飼草料供應(yīng)短缺的問(wèn)題。甘蔗渣的主要成分為纖維素、半纖維素和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL),而粗蛋白質(zhì)(CP)和粗脂肪(EE)含量較低[2-4]。因甘蔗渣ADL含量較高,同時(shí)ADL與纖維素、半纖維素之間相互混雜和交聯(lián)[4-6],限制了動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用。體外瘤胃發(fā)酵甘蔗渣測(cè)定其降解率表明其48 h的干物質(zhì)(DM)降解率僅有23.90%[7]。研究表明,對(duì)甘蔗渣進(jìn)行物理、化學(xué)和微生物方法處理后可提高其飼喂價(jià)值[8-9]。3種方案中最常用的是微生物處理法。通過(guò)微生物發(fā)酵不僅可以降低劣質(zhì)粗飼料中纖維素、半纖維素和ADL的含量[9],還可以增加瘤胃纖維素降解菌的豐度[10],增加飼料的適口性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和貯存時(shí)間。生物發(fā)酵常用菌種有乳酸菌、酵母菌、黑曲霉菌、芽孢桿菌和白腐菌等,這些菌種的聯(lián)合使用可提高發(fā)酵飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[11-13]。菌酶協(xié)同發(fā)酵具有發(fā)酵效率高、發(fā)酵周期短,通過(guò)微生物及其代謝產(chǎn)物的作用可以改善動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境,增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)疾病的抵抗能力[13-14]。因此,本研究以釀酒酵母菌、乳酸桿菌、黑曲霉菌和米曲霉菌配以纖維素酶進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵的甘蔗渣為研究材料,研究發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分表觀消化率、瘤胃發(fā)酵特性和瘤胃菌群的影響,以期為甘蔗渣高效利用提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用甘蔗渣購(gòu)于四川省涼山州寧南縣榨糖廠;發(fā)酵甘蔗渣為用菌和酶協(xié)同發(fā)酵所得。將甘蔗渣用牧草切割機(jī)粉碎后過(guò)2 cm篩。按DM計(jì)算,添加0.3%菌種組合[菌種組合以釀酒酵母菌(含量≥4×108CFU/g)、黑曲霉菌(含量≥2×108CFU/g)、米曲霉菌(含量≥2×108CFU/g)和乳酸桿菌(含量≥2×108CFU/g)按2∶1∶1∶1配制]和0.1%纖維素酶(酶活性≥2×104U/g),同時(shí)以DM計(jì)算添加0.5%尿素,通過(guò)飲用水將甘蔗渣底物水分調(diào)節(jié)到(38±1)%,甘蔗渣在溫度為20～30 ℃的環(huán)境中,用200 L的發(fā)酵桶密封,依靠發(fā)酵桶內(nèi)的空氣進(jìn)行先有氧再厭氧發(fā)酵96 h,即得到發(fā)酵甘蔗渣。感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,發(fā)酵甘蔗渣具有明顯的芳香果味,無(wú)霉變,顏色與發(fā)酵前相比沒(méi)有明顯變化。甘蔗渣和發(fā)酵甘蔗渣營(yíng)養(yǎng)水平和pH見(jiàn)表1。

表1 甘蔗渣和發(fā)酵甘蔗渣營(yíng)養(yǎng)水平和pH(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)設(shè)計(jì),選用14頭體況良好、體重[(363.84±9.11) kg]相近的西門塔爾雜交公牛,隨機(jī)分成2組,每組7個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1頭牛。對(duì)照組(CON組)飼喂含20%甘蔗渣的基礎(chǔ)飼糧;發(fā)酵甘蔗渣組(FSB組)飼喂用20%發(fā)酵甘蔗渣替代甘蔗渣的飼糧。試驗(yàn)期為87 d,其中預(yù)試期7 d,正試期80 d。飼糧參照《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)設(shè)計(jì),飼糧為全混合日糧(TMR),飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表2 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2022年1月至2022年4月在西昌市黃水鎮(zhèn)陳啟紅養(yǎng)牛合作社進(jìn)行。試驗(yàn)期間,肉牛單欄飼養(yǎng),每天投料2次(08:00、17:00),自由采食和飲水,每日清晨飼喂肉牛后清掃圈舍,定期對(duì)牛舍進(jìn)行消毒。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.4.1 飼糧養(yǎng)分含量測(cè)定

飼糧DM、CP、EE、粗灰分(Ash)、鈣(Ca)和總磷(TP)含量參照AOAC (1995)[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。參考Van Soest等[16]的方法測(cè)定甘蔗渣和發(fā)酵甘蔗渣樣品的粗纖維(CF)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的含量。

1.4.2 生長(zhǎng)性能測(cè)定

在正試期開始和結(jié)束時(shí),于晨飼前采用地磅稱量每頭牛的初始體重和終末體重,以計(jì)算平均日增重(ADG)。試驗(yàn)期內(nèi),每天記錄每頭試驗(yàn)牛只采食量,試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算得出肉牛干物質(zhì)采食量(DMI)。利用ADG和DMI計(jì)算每頭牛的料重比(F/G,F/G=DMI/ADG)。

1.4.3 養(yǎng)分表觀消化率

試驗(yàn)采用酸不溶灰分(AIA)法測(cè)定飼糧養(yǎng)分表觀消化率。飼養(yǎng)結(jié)束前10 d進(jìn)行糞樣采集工作(糞樣連續(xù)采集5 d),每頭牛每天分別在09:00和14:00通過(guò)直腸各采集新鮮糞樣100 g,共計(jì)200 g新鮮糞樣,然后加入20 mL濃度為10%的硫酸進(jìn)行固氮后,-20 ℃保存待測(cè)。糞樣中DM、CP、EE、Ash、NDF和ADF含量的測(cè)定方法同1.4.1。AIA含量參照Van Keulen等[17]所述方法進(jìn)行測(cè)定。飼糧養(yǎng)分表觀消化率計(jì)算公式如下:

飼糧養(yǎng)分表觀消化率(%)=100-100×(a×B/A×b)。

式中:A為飼糧中該養(yǎng)分含量(%);a為糞樣中該養(yǎng)分含量(%);B為飼糧中AIA的含量(%);b為糞樣中AIA含量(%)。

1.4.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天,在試驗(yàn)肉牛晨飼后4 h用瘤胃液采集器經(jīng)口腔抽取瘤胃液,使用BU-7型酸度計(jì)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定瘤胃液pH。隨后用4層棉紗布過(guò)濾,分裝于10 mL的離心管中,-80 ℃保存待測(cè)。瘤胃氨態(tài)氮(NH3-N)含量參照Chaney等[18]所述方法進(jìn)行測(cè)定。菌體蛋白(MCP)含量參照Verdouw等[19]所述方法進(jìn)行測(cè)定。采用氣相色譜儀(GC-2010 Plus,日本島津)測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量,樣品前處理(全程在冰上進(jìn)行)步驟如下:吸取上清液分裝于2 mL離心管中;10 000 r/min、4 ℃離心10 min;收集上清液,每個(gè)樣品至少2 mL;吸取樣品濾液1.280 mL、內(nèi)標(biāo)液0.240 mL、偏磷酸0.480 mL至2 mL離心管中混勻,冰上靜置30 min;將樣品混合液于10 000 r/min、4 ℃離心10 min后取上清液,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾于樣品瓶中,全自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣檢測(cè)。采用外標(biāo)法進(jìn)行分析,乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸(98.00%色譜純)均購(gòu)于貴州迪大科技有限責(zé)任公司。色譜條件:色譜柱SH-Rtx-WAX(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氮?dú)?分流比為50∶1。測(cè)定條件:采用程序升溫,柱溫初始溫度為100 ℃,保持2 min;以5 ℃/min升溫至150 ℃,保持2 min,火焰氫離子檢測(cè)器(FID)溫度為240 ℃。氣化室溫度為220 ℃,進(jìn)樣量為1 μL;以巴豆酸作為內(nèi)標(biāo)物。

1.4.5 瘤胃菌群測(cè)定

瘤胃液樣品送廣州基迪奧生物科技有限公司測(cè)定瘤胃菌群。采用微生物提取DNA試劑盒提取DNA后,用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA V3～V4和V4的保守區(qū),16S rDNA V3～V4特異引物序列為341F(5′-CCTAGGGNGGCWCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′),16S rDNA V4特異引物序列為515F(5′-GTGYCAGCMGCCCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′),然后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收,用QuantiFluorTM熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合,連接測(cè)序接頭,構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),Illumina PE250上機(jī)測(cè)序。

采用Fastp軟件進(jìn)行過(guò)濾,采用Flash軟件對(duì)高通量測(cè)序的片段進(jìn)行拼接,并用QIME進(jìn)行質(zhì)控。使用UCHIME算法和Gold數(shù)據(jù)庫(kù)去除嵌合體,得到有限片段(effective reads)?；赨SEARCH(http://drive.com/uparse/)軟件,用UPARSE算法在97%的一致性水平上進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類,選出OTU中出現(xiàn)頻率最高的序列作為OTU的代表序列。得到的下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)對(duì)各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后,進(jìn)行Alpha多樣性、Beta多樣性分類和Bugbase表型分類預(yù)測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

所有結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。生長(zhǎng)性能、瘤胃發(fā)酵參數(shù)、養(yǎng)分表觀消化率、OTU數(shù)、Alpha多樣性、相對(duì)豐度大于等于0.1%的前12個(gè)門水平和前16個(gè)屬水平的相對(duì)豐度用SAS 9.2重復(fù)測(cè)量的完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法進(jìn)行分析。瘤胃發(fā)酵參數(shù)與屬水平相對(duì)豐度大于1%的前16個(gè)瘤胃細(xì)菌屬間的相關(guān)性用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析。利用LEFse軟件對(duì)線性判別(LDA)分析效應(yīng)大小進(jìn)行分析,LDA評(píng)分閾值選擇大于4。使用Tax4Fun對(duì)16S序列的SILVA注釋的2個(gè)組進(jìn)行KEGG功能預(yù)測(cè),每個(gè)組的豐度表由廣州基迪奧生物科技有限公司提供和分析。P<0.05作為判斷差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知,2組肉牛的初始體重、終末體重和DMI均無(wú)顯著差異(P>0.05)。FSB組肉牛的ADG顯著高于CON組(P<0.05)。FSB組F/G顯著低于CON組(P<0.05)。

表3 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛生長(zhǎng)性能的影響

2.2 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表4可知,FSB組肉牛的DM、有機(jī)物(OM)、CP和NDF的表觀消化率均顯著高于CON組(P<0.05)。FSB組肉牛的ADF的表觀消化率有高于CON組的趨勢(shì)(P=0.062)。

表4 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃發(fā)酵特性的影響

由表5可知,FSB組肉牛瘤胃液中NH3-N、MCP、丙酸、異丁酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量均顯著高于CON組(P<0.05)。

表5 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃發(fā)酵特性的影響

2.4 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃細(xì)菌OTU數(shù)和Alpha多樣性的影響

由表6可知,FSB組OTU數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著低于CON組(P<0.05)。2組的覆蓋率均達(dá)到98%以上,且無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃細(xì)菌OTU數(shù)和Alpha多樣性的影響

2.5 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃門水平細(xì)菌相對(duì)豐度的影響

在門水平上,2組共檢測(cè)到了12個(gè)相對(duì)豐度大于等于0.1%的菌門。由表7可知,FSB組變形菌門(Proteobacteria)相對(duì)豐度顯著低于CON組(P<0.05),纖維桿菌門(Fibrobacteres)相對(duì)豐度顯著高于CON組(P<0.05)。

2.6 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃屬水平細(xì)菌相對(duì)豐度的影響

在屬水平上,2組共檢測(cè)到了16個(gè)相對(duì)豐度大于1%的菌屬。由表8可知,FSB組理研菌科_RC9_腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)和普雷沃氏菌科_UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003)相對(duì)豐度均顯著低于CON組(P<0.05)。FSB組解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)相對(duì)豐度顯著高于CON組(P<0.05)。

表8 飼喂發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃屬水平細(xì)菌相對(duì)豐度的影響

2.7 指示物種分析

為了更好地了解CON組和FSB組之間的差異細(xì)菌,利用LEFse軟件對(duì)組間差異物種進(jìn)行分析。圖1描述了主要微生物結(jié)構(gòu)的代表性分類層級(jí),標(biāo)示了2組中有顯著差異的物種分類層級(jí)。本研究中共檢測(cè)到6個(gè)有顯著差異的物種分類層級(jí),其中CON組2個(gè),FSB組4個(gè)。CON組理研菌科(Rikenellaceae)和理研菌科_RC9_腸道群的相對(duì)豐度較高。FSB組革蘭氏陰性菌綱(Negativicutes)、月形單胞菌目(Selenomonadales)、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)和解琥珀酸菌屬的相對(duì)豐度較高。

Succiniclasticum:解琥珀酸菌屬;Acidaminococcaceae:氨基酸球菌科;Negativicutes: 革蘭氏陰性菌綱;Selenomonadales: 月形單胞菌目;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科_RC9_腸道群;Rikenellaceae:理研菌科。

2.8 瘤胃發(fā)酵參數(shù)與細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度之間的相關(guān)性

利用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)(r)分析瘤胃發(fā)酵參數(shù)與相對(duì)豐度大于1%的16種屬水平瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度間的相關(guān)性。如圖2所示,瘤胃乙酸含量與普雷沃氏菌科_UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)和普雷沃氏菌科_UCG-003相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。丙酸含量與瘤胃球菌科_UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)、普雷沃氏菌科_UCG-003和理研菌科_RC9_腸道群相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),但與解琥珀酸菌屬相對(duì)豐度呈正相關(guān)(P<0.05)。異丁酸含量與普雷沃氏菌科_UCG-003和理研菌科_RC9_腸道群相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),但與瘤胃球菌科_UCG-014相對(duì)豐度呈正相關(guān)(P<0.05)。丁酸含量與丁酸弧菌屬_2(Butyrivibrio_2)相對(duì)豐度呈正相關(guān)(P<0.05)。NH3-N含量與產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬(Saccharofermentans)相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.9 瘤胃細(xì)菌功能預(yù)測(cè)

采用Tax4Fun基因功能評(píng)估方法預(yù)測(cè)CON組和FSB組肉牛瘤胃菌群的功能。如圖3所示,Tax4Fun預(yù)測(cè)軟件在2級(jí)KEGG途徑中富集了12個(gè)存在顯著差異的代謝途徑(P<0.05)。值得引起我們關(guān)注的是,FSB組氨基酸代謝途徑、核苷酸代謝途徑和外源生物降解與代謝途徑的相對(duì)豐度顯著高于CON組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛生長(zhǎng)性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響

感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明,用菌酶協(xié)同發(fā)酵處理的甘蔗渣具有明顯的芳香果味,無(wú)霉變,顏色與發(fā)酵前相比無(wú)明顯變化,屬于一級(jí)發(fā)酵料。與發(fā)酵前相比,發(fā)酵96 h后甘蔗渣的CF、NDF、ADF和ADL的含量分別下降了24.09%、32.37%、28.25%和20.67%,這可能與米曲霉菌、黑曲霉菌以及纖維素酶的添加有關(guān),因?yàn)槔w維素酶可降解植物細(xì)胞壁中的纖維素,而米曲霉菌[20]和黑曲霉菌[21]可分泌纖維素酶,增強(qiáng)對(duì)甘蔗渣中纖維素、半纖維素和ADL的降解作用。微生物發(fā)酵過(guò)程中,結(jié)構(gòu)性碳水化合物的水解常伴隨著可溶性碳水化合物(WSC)的產(chǎn)生,它是乳酸菌和其他微生物繁殖的能量來(lái)源[22]。與甘蔗渣相比,發(fā)酵后甘蔗渣中的WSC含量提高了57.75%,這可能與甘蔗渣發(fā)酵過(guò)程中米曲霉菌、黑曲霉菌以及纖維素酶的添加增強(qiáng)了纖維素的降解有關(guān)。pH是評(píng)定青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo),pH越低(<4.2),青貯發(fā)酵品質(zhì)越好。本研究中,發(fā)酵甘蔗渣的pH為5.18,這可能與發(fā)酵時(shí)間較短、甘蔗渣緩沖能值較高和較低的WSC含量有關(guān)[23]。與發(fā)酵前相比,發(fā)酵后甘蔗渣的CP含量提高了21.16%,這可能與添加了一定的尿素有關(guān)[24]。

甘蔗渣具有高纖維、高ADL的特點(diǎn),在瘤胃內(nèi)的降解效率較低。直接飼喂反芻動(dòng)物會(huì)因大量纖維素和ADL在瘤胃內(nèi)不能被快速消化而堆積,侵占反芻動(dòng)物瘤胃的物理空間,導(dǎo)致動(dòng)物飼料DM攝入量減少,最終導(dǎo)致其生長(zhǎng)性能下降[25]。De Almeida等[25]研究表明,隨著甘蔗渣添加量的增加,Girolando奶牛DMI、OM和總可消化養(yǎng)分?jǐn)z入量呈線性降低。本研究也發(fā)現(xiàn),與FSB組相比,飼喂未經(jīng)處理的甘蔗渣會(huì)降低肉牛DMI、ADG,并提高F/G。

研究表明,使用酶菌協(xié)同發(fā)酵可以改善反芻動(dòng)物粗飼料的質(zhì)量,提高其適口性和消化率[9]。本研究發(fā)現(xiàn),與未經(jīng)處理的甘蔗渣相比,經(jīng)混合益生菌和纖維素酶處理的發(fā)酵甘蔗渣的NDF、ADF和ADL的含量分別下降了24.09%、28.25%和20.67%,并且飼喂發(fā)酵甘蔗渣可顯著提高肉牛DMI,降低F/G,ADG也顯著提高。So等[14]的研究也表明,與未經(jīng)處理的稻草相比,飼喂經(jīng)乳桿菌TH14、纖維素酶和糖蜜處理的甘蔗渣發(fā)酵料可以顯著提高泰國(guó)本土牛的DMI、ADG、飼料轉(zhuǎn)化效率及養(yǎng)分表觀消化率。ADL含量過(guò)高會(huì)降低飼料的適口性和瘤胃微生物對(duì)飼料的降解效率。纖維素酶可破壞甘蔗渣細(xì)胞壁與ADL的交聯(lián)作用[26],增強(qiáng)瘤胃細(xì)菌對(duì)甘蔗渣的降解作用。本研究中,FSB組肉牛DM、OM和NDF的表觀消化率顯著高于CON組的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。養(yǎng)分表觀消化率的增加表明食糜在瘤胃內(nèi)的滯留時(shí)間減少[11],單位時(shí)間內(nèi)瘤胃可容納的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更多,這可能是FSB組肉牛DMI、ADG高于CON組,F/G低于CON組的一個(gè)重要原因。此外,混合益生菌和纖維素酶的添加可提高發(fā)酵甘蔗渣的適口性和氣味[14],這可能是引起FSB組肉牛DMI增加的另一因素。

3.2 發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃發(fā)酵特性的影響

瘤胃pH是反映瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標(biāo)之一,唾液作為瘤胃pH的緩沖液,其分泌量是影響瘤胃pH的重要因素,而咀嚼活動(dòng)與唾液的產(chǎn)生量呈正相關(guān)。Goulart等[27]的研究表明,飼喂甘蔗渣可導(dǎo)致內(nèi)洛爾牛反芻時(shí)間和咀嚼時(shí)間顯著提高。本研究中,CON組pH略高于FSB組,這可能與甘蔗渣中高含量的ADL和纖維素增加了肉牛唾液分泌量有關(guān)。甘蔗渣中ADL和纖維素等在瘤胃中難以被降解,但厭氧發(fā)酵可促進(jìn)甘蔗渣結(jié)構(gòu)性碳水化合物水解[28],添加纖維素酶可直接破壞甘蔗渣的細(xì)胞壁[10,14],增加瘤胃微生物對(duì)甘蔗渣的降解作用。瘤胃pH高于6.2是纖維分解菌發(fā)揮作用的重要條件。本研究中,2組肉牛瘤胃液pH均高于6.2,表明2組飼糧的使用未抑制瘤胃纖維降解菌的正常生長(zhǎng)。戊酸可作為評(píng)估VFA吸收情況的標(biāo)志物[29]。本研究中,2組肉牛瘤胃中戊酸的含量無(wú)顯著差異。這表明2組肉牛瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)瘤胃液中短鏈脂肪酸(SCFA)的吸收量無(wú)顯著差異。由于酶菌發(fā)酵處理破壞了甘蔗渣的細(xì)胞壁,增強(qiáng)了瘤胃微生物對(duì)進(jìn)入瘤胃的發(fā)酵甘蔗渣的附著和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解,因此,FSB組丙酸、丁酸和異丁酸的產(chǎn)生量要高于CON組[14]。最終導(dǎo)致了FSB組肉牛瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著高于CON組。

NH3-N的形成僅在蛋白質(zhì)分解的最后一步受到影響,即氨基酸的脫氨基作用。CON組較低的NH3-N含量可能與甘蔗渣中存在的高含量的纖維物質(zhì)阻擋了瘤胃微生物對(duì)蛋白質(zhì)的降解有關(guān)。NH3-N是瘤胃中MCP合成最重要的氮源。MCP合成受反芻動(dòng)物能量攝入量和氮含量的影響[30]。De Almeida等[25]研究表明,隨著甘蔗渣添加量的增加MCP合成呈線性下降。本研究也表明,CON組MCP的含量顯著低于FSB組,這與CON組DMI以及養(yǎng)分表觀消化率的變化規(guī)律一致,表明CON組瘤胃微生物因合成MCP所需要的氮和能量受阻,導(dǎo)致其MCP含量顯著低于FSB組。

3.3 發(fā)酵甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃菌群的影響

FSB組瘤胃細(xì)菌的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著低于CON組,表明菌酶協(xié)同發(fā)酵降低了瘤胃細(xì)菌的多樣性和豐度,這可能與FSB組較低的NDF含量有關(guān)[31]。門水平上,2組相對(duì)豐度最高的是厚壁菌門,擬桿菌門次之。厚壁菌門的物種在降解纖維物質(zhì)的方面起重要作用[27]。本研究中,2組較高的厚壁菌門相對(duì)豐度表明參與瘤胃纖維降解的細(xì)菌數(shù)量要高于參與淀粉降解的細(xì)菌數(shù)量[32]。變形菌門主要由革蘭氏陰性菌組成,具有高度多樣的代謝功能。本研究表明,FSB組變形菌門相對(duì)豐度顯著降低。Bi等[33]研究表明,在飼糧精粗比相同的情況下,變形菌門相對(duì)豐度在一定范圍內(nèi)隨能量水平的增加出現(xiàn)一定的降低。此外,甘蔗渣發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙醇[34],以及FSB組較高的丁酸含量也可能是導(dǎo)致該組變形菌門相對(duì)豐度顯著降低的重要原因[33]。纖維桿菌相對(duì)豐度與飼糧中的纖維含量呈正相關(guān)[35]。本研究中,FSB組纖維桿菌相對(duì)豐度顯著高于CON組,但其飼糧中纖維物質(zhì)的含量卻低于CON組。以上研究結(jié)果的差異可能與甘蔗渣纖維物質(zhì)間存在一定相互混雜和交聯(lián),變形菌門微生物對(duì)復(fù)雜纖維物質(zhì)的降解能力較弱,導(dǎo)致CON組可有效利用的纖維物質(zhì)含量低于FSB有關(guān)。

在屬水平上,CON組和FSB組存在差異的屬為理研菌科_RC9_腸道群、普雷沃氏菌科_UCG-003和解琥珀酸菌屬。理研菌科_RC9_腸道群屬于理研菌科,在對(duì)纖維的降解中起重要作用,其相對(duì)豐度與膳食纖維含量之間呈正相關(guān)[28]。有研究表明,當(dāng)飼糧NDF含量從39.7%降低到30.9%時(shí),理研菌科_RC9_腸道群在瘤胃中的相對(duì)豐度降低了69.8%[36]。因此,本研究中,CON組飼糧較高NDF含量可用來(lái)解釋該組瘤胃液中較高的理研菌科_RC9_腸道群相對(duì)豐度。普雷沃氏菌科_UCG-003參與植物細(xì)胞壁多糖的降解。Borchers等[37]研究發(fā)現(xiàn),與補(bǔ)飼的耗牛相比,放牧可增加耗牛瘤胃內(nèi)普雷沃氏菌科_UCG-003的相對(duì)豐度。這表明瘤胃中普雷沃氏菌科_UCG-003的相對(duì)豐度與飼糧纖維水平呈一定的正相關(guān),本研究中CON組較高的普雷沃氏菌科_UCG-003相對(duì)豐度也說(shuō)明了這一點(diǎn)。解琥珀酸菌屬主要參與淀粉的降解,是瘤胃中琥珀酸轉(zhuǎn)化為丙酸的主要參與者[38],在飼喂高能量和高精飼糧的反芻動(dòng)物瘤胃中有較高的豐度[33]。Ran等[38]研究表明,提高含NDF和ADL較高的高粱青貯添加量會(huì)降低泌乳奶牛瘤胃中解琥珀酸菌屬相對(duì)豐度水平。FSB組解琥珀酸菌屬相對(duì)豐度顯著高于CON組,這可能與使用纖維素酶破壞了甘蔗渣的細(xì)胞壁,導(dǎo)致甘蔗渣中的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物更易被瘤胃微生物降解有關(guān)。

3.4 指示物種分析

使用指示物種分析有助于識(shí)別不同群體中潛在的指示物種。在屬水平上,CON組樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬為理研菌科_RC9_腸道群,FSB組為解琥珀酸菌屬。解琥珀酸菌屬參與淀粉的降解,是瘤胃中琥珀酸轉(zhuǎn)化為丙酸的主要參與者[38]。理研菌科_RC9_腸道群在瘤胃纖維消化中起重要重要作用,膳食纖維含量的增加可促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖[28,36]。因此,理研菌科_RC9_腸道群可能是CON組的指示物種,解琥珀酸菌屬可能是FSB組的指示物種。

3.5 瘤胃菌群與瘤胃發(fā)酵參數(shù)之間的關(guān)系

飼糧誘導(dǎo)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的變化與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的變化有關(guān)。本研究揭示了用發(fā)酵甘蔗渣替代甘蔗渣對(duì)肉牛瘤胃菌群和瘤胃代謝表型的相互作用模式。相關(guān)分析表明,丙酸含量與解琥珀酸菌屬相對(duì)豐度呈正相關(guān)。NH3-N含量與產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)。丙酸是糖異生反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為葡萄糖的主要底物,是動(dòng)物的主要能量來(lái)源[39]。MCP是反芻動(dòng)物所需優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來(lái)源,瘤胃中MCP的合成與NH3-N的含量以及能量利用效率密切相關(guān)[25]。因此,FSB組肉牛瘤胃液中較高的解琥珀酸菌屬相對(duì)豐度和較低的產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬相對(duì)豐度可能與FSB組肉牛ADG較高有關(guān)。

3.6 瘤胃菌群功能預(yù)測(cè)

在本研究中,使用Tax4Fun來(lái)預(yù)測(cè)CON組和FSB組肉牛瘤胃菌群的功能。FSB組肉牛瘤胃中參與2級(jí)KEGG途徑中氨基酸代謝途徑、核苷酸代謝途徑和外源生物降解與代謝途徑的基因顯著加強(qiáng),可為宿主提供更多生長(zhǎng)所需的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和能量。本研究結(jié)果不能代表瘤胃菌群的實(shí)際功能,這些基因在飼喂甘蔗渣和發(fā)酵甘蔗渣的肉牛中的作用機(jī)制需要利用宏基因組分析來(lái)進(jìn)一步的確定。

4 結(jié) 論

添加20%發(fā)酵甘蔗渣替代甘蔗渣可改變瘤胃菌群結(jié)構(gòu),并通過(guò)提高瘤胃液中VFA、MCP的含量和肉牛養(yǎng)分表觀消化率來(lái)提高肉牛生長(zhǎng)性能。