白金妮 張?chǎng)┚?盧 娜 郭凱軍*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206;2.北京京瓦農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心,北京 100081)

隨著我國(guó)進(jìn)入飼料“禁抗”時(shí)代,尋求綠色安全的“替抗”飼料添加劑迫在眉睫。單寧又叫植物多酚,是一種具有多元酚結(jié)構(gòu)、含量?jī)H次于木質(zhì)素的天然植物次生代謝物,廣泛存在于蔬菜、水果、谷物等植物的根、皮、莖、葉中[1]。單寧根據(jù)結(jié)構(gòu)特征一般分為水解單寧和縮合單寧?？s合單寧是以黃烷醇為單體形成的聚合物,分子質(zhì)量為500～20 000 u,結(jié)構(gòu)組成相對(duì)復(fù)雜,在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下可水解[2]?？s合單寧在自然界中廣泛存在,但較大的分子結(jié)構(gòu)和特定的降解條件使其難以被動(dòng)物有效利用。水解單寧的生物活性相對(duì)更強(qiáng),在醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

近年來,水解單寧作為一種安全有效的飼料添加劑在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)中備受關(guān)注。水解單寧是由沒食子酸或鞣花酸與糖醇及其衍生物組成的多聚體,分子質(zhì)量在500～3 000 u,主要存在于多種喬木(栗木、橡木)的樹皮與果實(shí)中[3]。水解單寧具有抗氧化、抗炎、抗微生物等多種生物活性,能夠改善畜禽免疫水平,且不易引起動(dòng)物耐藥性的產(chǎn)生[4]。飼糧中添加適量水解單寧可以促進(jìn)反芻動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的吸收,增加有益脂肪酸的合成,減少甲烷等溫室氣體的產(chǎn)生,并提高產(chǎn)奶性能和產(chǎn)肉性能[3-4]。本文基于水解單寧的化學(xué)結(jié)構(gòu),介紹了水解單寧的生物活性,總結(jié)了水解單寧在反芻動(dòng)物生產(chǎn)應(yīng)用方面的研究進(jìn)展,以期為水解單寧的添加劑開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 水解單寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)及降解途徑

水解單寧大多是以葡萄糖基為中心的多元醇與周圍多個(gè)酚羧酸通過酯鍵連接形成(圖1)[5]。根據(jù)水解后酚羧酸的差異,將水解單寧分為棓單寧與鞣花單寧兩大類[6]。棓單寧又稱為五倍子單寧,水解后主要產(chǎn)物為沒食子酸,多存在于金縷梅、五倍子和槭樹中[7]。鞣花單寧水解后產(chǎn)生鞣花酸,主要存在于栗木、橡樹以及各種堅(jiān)果內(nèi)[8]。水解單寧降解的關(guān)鍵是由微生物(細(xì)菌、真菌和酵母菌)分泌的多種酶(單寧酶、脫羧酶和多酚氧化酶)形成的酶促體系[9]。水解單寧降解過程中,經(jīng)多酚氧化酶催化的步驟受到環(huán)境氧含量的影響[9]。在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi),多酚氧化酶被還原酶或水解酶替代,最終降解為乙酰輔酶A(acetyl-CoA)合成乙酸、丙酸等脂肪酸(圖2)。

圖1 水解單寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 水解單寧降解過程

2 水解單寧的生物活性及其作用機(jī)制

2.1 腸道收斂作用

當(dāng)pH為3.5～7.0時(shí),水解單寧可以和蛋白質(zhì)通過疏水鍵或氫鍵縮合,形成穩(wěn)定的單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物,這一特性是單寧具有腸道收斂作用的主要原因,對(duì)于維持動(dòng)物腸道健康和緩解幼齡動(dòng)物腹瀉有重要作用[11]。單寧發(fā)揮腸道收斂作用的方式包括:1)結(jié)合并凝固腸道黏膜蛋白,引起腸道黏膜表面皺縮,減少炎性內(nèi)容物滲出和腸道蠕動(dòng)頻率,并加強(qiáng)機(jī)體對(duì)水分的吸收[12-13]。2)阻斷與腹瀉有關(guān)離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道的形成,調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞代謝。Borisova等[14]研究發(fā)現(xiàn),漆樹提取物中的水解單寧可以和藻類細(xì)胞表面帶正電荷的蛋白基團(tuán)發(fā)生靜電吸附,阻斷鈣依賴性氯離子通道,降低腸腔內(nèi)滲透壓,緩解滲透性腹瀉。3)借助疏水基團(tuán)與病原微生物表面蛋白結(jié)合,阻斷致病菌滲入腸道,減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)[6]。

2.2 抗氧化機(jī)制

IκBs:核因子-κB抑制蛋白 nuclear factor-κB inhibitor proteins;NF-κB:核因子-κB nuclear factor kappa-B;MAPK:絲裂原活化蛋白激酶 mitogen-activated protein kinase;TLR-1:Toll樣受體-1 toll-like receptor-1;Caspase-1:半胱氨酸蛋白酶1 cysteinyl aspartate specific proteinase-1;NLRP3:核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3;ROS:活性氧 reactive oxygen species;IL-18:白細(xì)胞介素-18 interleukin-18;IL-1β:白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β;IKK:核因子-κB抑制蛋白激酶 nuclear factor-κB inhibitor protein kinase;JNK:c-Jun氨基末端激酶 c-Jun N-terminal kinase;ERK:細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 extracellular regulated protein kinases;SIRT1:激活沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1 silent mating type information regulation 2 homolog 1;Keap1:Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1 Kelch like ECH associated protein 1;Nrf2:核因子E2相關(guān)因子2 nuclear factor erythroid-2 related factor 2;sMaf:特異性巨噬細(xì)胞武裝因子 specific macrophage arming factor;ARE 抗氧化反應(yīng)元件 antioxidant response element;IL-6:白細(xì)胞介素-6 interleukin-6;COX-2:cyclooxygenase-2 環(huán)氧化酶-2;SOD:超氧化物歧化酶 superoxide dismutase;GSH-Px:谷胱甘肽過氧化物酶 glutathione peroxidase;Ac:乙酰化 acetylation;De:脫乙?；?deacetylation;P:磷酸化 phosphorylation;Ub:泛素化 ubiquitination。

2.3 抗炎機(jī)制

水解單寧主要依靠阻斷核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)2條與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路以及激活沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用(圖3)[17]。機(jī)體受到炎癥刺激時(shí),核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)產(chǎn)生炎癥小體,并按順序激活位于上游MAPK信號(hào)通路的三級(jí)激酶[21]。研究表明,水解單寧通過下調(diào)c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、p38和ERK5這4種MAPK亞族的磷酸化水平,阻斷MAPK信號(hào)通路的激活[22]。當(dāng)炎癥信號(hào)傳至下游,與核因子-κB抑制蛋白(nuclear factor-κB inhibitor protein,IκB)被核因子-κB抑制蛋白激酶(nuclear factor-κB inhibitor protein kinase,IKK)磷酸化修飾,NF-κB得到釋放,水解單寧阻斷NF-κB易位至細(xì)胞核內(nèi),抑制促炎因子的表達(dá),緩解機(jī)體炎癥[21-23]。

SIRT1信號(hào)通路是一種和NF-κB信號(hào)通路存在拮抗關(guān)系的信號(hào)通路,同樣位于NF-κB信號(hào)通路上游。SIRT1可以直接抑制NF-κB入核過程的關(guān)鍵步驟,即Rel A(p65)亞基上的賴氨酸-310(K310)位點(diǎn)去乙酰化,間接阻斷NF-κB信號(hào)通路[24]。Chen等[25]研究發(fā)現(xiàn),尿石素A可以通過上調(diào)SIRT1、下調(diào)p53蛋白表達(dá)水平,激活SIRT1信號(hào)通路,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。目前,有關(guān)水解單寧對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路影響的研究以檢測(cè)通路下游基因及蛋白的表達(dá)量變化為主,對(duì)于水解單寧在信號(hào)通路中發(fā)揮作用的完整機(jī)制尚不明確,今后還需更多深入研究。

2.4 抗微生物作用

水解單寧分子結(jié)構(gòu)中大量沒食子?；梢砸种聘锾m氏陰性菌脂多糖(LPS)外膜和宿主細(xì)胞表面受體識(shí)別結(jié)合引發(fā)炎癥反應(yīng)的過程[26]。研究發(fā)現(xiàn),五倍子單寧酸對(duì)金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌生長(zhǎng)繁殖的抑制作用很強(qiáng),最小抑菌濃度分別為0.39和0.09 mg/mL[27-28]。水解單寧抑菌機(jī)理主要包括以下幾種:1)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性。水解單寧可以通過去極化或者超極化作用,改變細(xì)胞膜兩側(cè)電位,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[29]。此外,水解單寧可以與鐵離子形成螯合物,破壞細(xì)胞壁完整性[30]。2)搶奪微生物代謝必需養(yǎng)分。水解單寧與細(xì)菌所需養(yǎng)分結(jié)合,抑制細(xì)菌正常代謝進(jìn)程和與生命活動(dòng)相關(guān)的酶活性[31]。水解單寧對(duì)真菌和病毒同樣存在較好的抑制效果。研究發(fā)現(xiàn),鞣花酸可以調(diào)控與真菌細(xì)胞膜麥角甾醇合成有關(guān)的信號(hào)通路,有效抑制白色念球菌繁殖[32]。沒食子酸可以阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞,預(yù)防丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染[33-34]。水解單寧對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等多種病原微生物具有抑制作用,有望作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖。

3 水解單寧在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 對(duì)反芻動(dòng)物生長(zhǎng)性能及養(yǎng)分消化率的影響

單寧對(duì)反芻動(dòng)物生長(zhǎng)性能的作用效果受到單寧的來源產(chǎn)地、成分組成、添加劑量、飼喂動(dòng)物種類等多方面因素的影響,其中,添加劑量尤為關(guān)鍵[35]。飼糧中添加低濃度單寧可以促進(jìn)反芻動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)養(yǎng)分的消化吸收,而添加高濃度單寧則表現(xiàn)為抗?fàn)I養(yǎng)作用[36]。使用水解單寧作為飼料添加劑時(shí),要考慮單寧的這種雙向作用,調(diào)整適宜的添加劑量。水解單寧有利于反芻動(dòng)物的早期生長(zhǎng)發(fā)育,張全宇等[36]研究發(fā)現(xiàn),在荷斯坦新生犢牛開食料中添加0.1%的沒食子酸,可以提高犢牛平均日增重(ADG)。近年來,有關(guān)水解單寧在反芻動(dòng)物飼糧中添加劑量的研究不斷深入[37]。Aboagye等[38]在斷奶肉牛飼糧中添加不同比例的栗木單寧,結(jié)果表明,在第10～13周的飼喂階段內(nèi),隨著飼糧中栗木單寧比例由0.25%提高到1.50%,肉牛ADG增加了0.297 kg。綜上所述,適當(dāng)提高飼糧中水解單寧比例不會(huì)對(duì)反芻動(dòng)物生長(zhǎng)性能產(chǎn)生負(fù)面影響。

3.2 對(duì)反芻動(dòng)物養(yǎng)分吸收利用的影響

3.2.1 對(duì)蛋白質(zhì)利用的影響

水解單寧主要通過2種方式促進(jìn)反芻動(dòng)物對(duì)氮的吸收利用:1)單寧和飼糧中蛋白質(zhì)結(jié)合,以單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物形式通過瘤胃,增加過瘤胃蛋白質(zhì)含量,減少瘤胃微生物對(duì)飼糧蛋白質(zhì)的分解[11]。單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)入皺胃及腸道后,在多種酶的作用下逐步降解,提高動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的利用率[39]。2)單寧能夠附著在蛋白質(zhì)分解菌表面,降低瘤胃中蛋白質(zhì)分解菌的相對(duì)豐度,減少瘤胃可降解蛋白質(zhì)比例,促進(jìn)動(dòng)物腸道對(duì)蛋白質(zhì)的吸收利用,但這種菌群抑制作用不會(huì)影響瘤胃菌群種類[40]。此外,研究表明,水解單寧可以降低泌乳中期奶牛奶中尿素氮(MUN)和尿中尿素氮(UUN)含量,影響反芻動(dòng)物氮代謝過程[41]。

3.2.2 對(duì)碳水化合物利用的影響

已有大量研究表明,水解單寧對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的碳水化合物降解具有負(fù)面影響。水解單寧分泌的胞外酶與反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)纖維降解菌的細(xì)胞壁結(jié)合,會(huì)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜完整結(jié)構(gòu),抑制細(xì)菌分泌纖維降解酶活性,減少細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的必需底物含量,降低瘤胃內(nèi)纖維分解菌的相對(duì)豐度。這種抑制作用可能在不同菌種間的作用效果存在差異,如Sharifi等[42]研究了石榴皮提取物對(duì)育肥羔羊瘤胃微生物的影響,發(fā)現(xiàn)隨著飼糧中單寧水平的升高,產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)的數(shù)量顯著減少,而黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavus)的數(shù)量不受影響。不同來源的單寧組合能夠緩解水解單寧對(duì)瘤胃降解碳水化合物菌群的抑制作用。Chen等[43]在苜蓿青貯中添加堅(jiān)木單寧和栗木單寧的混合物,提高了瘤胃嗜淀粉瘤胃桿菌(Ruminobaceramylophilus)和棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)的相對(duì)豐度。水解單寧可以調(diào)節(jié)瘤胃菌群結(jié)構(gòu),但瘤胃復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的菌群變化會(huì)影響水解單寧的作用效果。

3.2.3 對(duì)脂質(zhì)利用的影響

水解單寧可以調(diào)節(jié)瘤胃微生物群落,阻礙細(xì)菌生物氫化(BH)的過程,增加不飽和脂肪酸等有益脂肪酸的累積,減少飽和脂肪酸的產(chǎn)生,對(duì)反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能產(chǎn)生積極作用[44]。Buccioni等[45]在奶綿羊飼糧中添加2%的栗木單寧,借助變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析方法,發(fā)現(xiàn)栗木單寧可以抑制丁酸弧菌屬的產(chǎn)生,正向調(diào)節(jié)瘤胃細(xì)菌脂質(zhì)代謝,增加亞油酸(C18∶2cis-9,cis-12,LA)、亞麻酸(C18∶3cis-9,cis-12,cis-15,LNA)、異油酸(C18∶1trans-11,VA)等有益脂肪酸前體的產(chǎn)生,促進(jìn)奶綿羊乳腺組織乳脂合成。但也有研究發(fā)現(xiàn),添加4%的栗木和塔拉單寧混合提取物會(huì)對(duì)羔羊脂肪酸代謝產(chǎn)生負(fù)面影響,相比于無單寧飼糧的對(duì)照組,飼糧添加單寧顯著降低了羔羊瘤胃、肝臟及羊肉中反式油酸(C18∶1trans-10)含量[46]。此項(xiàng)結(jié)果與以往研究出入較大,這可能與幼齡反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育尚不健全有關(guān)。

3.3 對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵及甲烷產(chǎn)生的影響

反芻動(dòng)物瘤胃環(huán)境復(fù)雜,添加水解單寧后,瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的變化受到多種因素的影響(表1)。Prapaiwong等[47]在奶牛飼糧中添加3.15、6.30和9.45 g/d的栗木單寧,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充單寧不會(huì)影響正常范圍內(nèi)瘤胃pH、氨態(tài)氮(NH3-N)濃度以及乙酸/丙酸。隨著單寧添加比例的增加,總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acids,TVFA)濃度線性增加。這是由于補(bǔ)充單寧增加了奶牛精飼料攝入比例,增加了揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)的產(chǎn)生。Bhatta等[48]探究5種植物來源的水解單寧對(duì)體外瘤胃發(fā)酵和甲烷產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)高添加比例單寧會(huì)減少體外pH及TVFA、NH3-N濃度,增加丙酸濃度,但對(duì)甲烷產(chǎn)量的抑制作用沒有減弱。添加水解單寧后,瘤胃NH3-N濃度普遍降低,是由于水解單寧提高了反芻動(dòng)物氮的留存率。畜牧業(yè)的高速發(fā)展伴隨著大量溫室氣體的產(chǎn)生和排放,其中,甲烷約占溫室氣體排放總量的14%,但產(chǎn)生的溫室效應(yīng)潛能值是二氧化碳的28倍[49]。因此,解決反芻動(dòng)物甲烷排放問題刻不容緩。水解單寧對(duì)纖維分解菌生長(zhǎng)繁殖的抑制作用降低了瘤胃乙酸含量,減少了經(jīng)乙酸發(fā)酵途徑合成的甲烷產(chǎn)量。同時(shí),水解單寧可以直接降低產(chǎn)甲烷菌(主要是古細(xì)菌)的相對(duì)豐度,并且抑制與產(chǎn)甲烷菌共生的瘤胃原蟲的生長(zhǎng)繁殖,改變菌群結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié)瘤胃微生物區(qū)系。Abarghuei等[39]在奶牛飼糧中添加石榴皮提取物,發(fā)現(xiàn)隨著單寧濃度的增加,奶牛瘤胃中幾種優(yōu)勢(shì)纖毛蟲,如均毛蟲屬(Isotricha)、絨毛蟲屬(Dasytricha)和兩腰蟲屬(Diplodinium)的數(shù)量顯著降低。添加水解單寧后,反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)原蟲數(shù)量減少,產(chǎn)甲烷菌可利用的氫來源減少,達(dá)到甲烷減排的效果。

表1 水解單寧對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵的影響

3.4 對(duì)反芻動(dòng)物機(jī)體健康及生產(chǎn)性能的影響

3.4.1 免疫機(jī)能及腸道健康

水解單寧可以增加反芻動(dòng)物對(duì)ROS和炎癥的抵抗力,提高免疫機(jī)能。Liu等[53]在圍產(chǎn)期奶牛飼糧中補(bǔ)充1.97%栗木單寧,可降低肝細(xì)胞膜損傷程度,保護(hù)甲狀腺,提高三碘甲狀腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)的合成,有助于預(yù)防產(chǎn)前奶牛甲狀腺激素不足引起體脂動(dòng)員過度造成的多種產(chǎn)后代謝疾病。Mastrogiovanni等[54]研究發(fā)現(xiàn),添加石榴皮可以降低由過氧化氫或LPS誘導(dǎo)引起的胞內(nèi)ROS和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)量,證實(shí)了石榴皮提取物的抗氧化和抗炎雙重作用。此外,水解單寧的收斂作用可以保護(hù)新生反芻動(dòng)物腸道健康發(fā)育。He等[55]研究發(fā)現(xiàn),沒食子酸介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)后腸道共生菌群相對(duì)豐度,緩解腸聚集性大腸桿菌引起的犢牛腹瀉和結(jié)腸炎,有利于新生犢牛腸道免疫的迅速建立。水解單寧對(duì)腸道內(nèi)抗氧化和抗炎信號(hào)通路的局部調(diào)節(jié)有助于維持反芻動(dòng)物腸道健康。

3.4.2 產(chǎn)奶性能和產(chǎn)肉性能

單寧的抗氧化和抗炎作用能夠提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能。Argov-Argaman等[56]在母羊飼糧中添加濃縮石榴皮提取物(CPE),發(fā)現(xiàn)飼喂CPE的母羊產(chǎn)奶量以及乳中脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖含量均高于對(duì)照組;與對(duì)照組相比,CPE組的牛奶飽和脂肪酸含量更高,總多不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量更低;添加CPE提高了奶牛的抗氧化能力,這種抗氧化作用傳遞至乳中,提高了羊乳的穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Liu等[57]將不同比例栗木單寧(0.5%、1.0%)添加到熱應(yīng)激羔羊飼糧中,提高了熱應(yīng)激羔羊肉的黃度(b*)、亮度(L*)值以及血清和肝臟中抗氧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,降低熱應(yīng)激羔羊肌肉、血清和肝臟中MDA含量,改善了熱應(yīng)激羔羊的肉品質(zhì)和抗氧化能力。

4 小 結(jié)

水解單寧具有良好的抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)功能,且廣譜抗菌、來源廣泛。不同來源單寧對(duì)動(dòng)物的影響差異較大,不易引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。此外,水解單寧還可以調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系,提高養(yǎng)分吸收率,在不影響生產(chǎn)性能的前提下,減少甲烷排放,是一種很有前景的飼料添加劑。目前水解單寧在反芻動(dòng)物中的合理飼喂方案和添加劑量仍難有定論,對(duì)于水解單寧在動(dòng)物體內(nèi)代謝過程及其調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃菌群的機(jī)制仍不明晰,解決這些問題有助于水解單寧添加劑的開發(fā)和應(yīng)用。