萬(wàn)秀娟，姜宗祥，趙玉祥，陳 嶸，賀 揚(yáng)

（青島啤酒股份有限公司，啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266100）

隨著人們對(duì)酒精危害認(rèn)識(shí)的加深，以及消費(fèi)者對(duì)健康的關(guān)注越來(lái)越多，無(wú)醇啤酒漸漸走進(jìn)人們的生活，受到消費(fèi)者的青睞[1]。與傳統(tǒng)啤酒相比，無(wú)醇啤酒的生產(chǎn)工藝流程具有較大差異，從而使得其口感與傳統(tǒng)啤酒存在差異。目前，生產(chǎn)無(wú)醇啤酒主要有兩大類的經(jīng)典方法，分別是物理方法和生物方法。物理方法是在啤酒發(fā)酵結(jié)束后去除酒精，通常使用熱處理去除啤酒中的酒精（也就是脫醇），如真空蒸餾、膜過(guò)濾（透析、反滲透）等；生物方法是在發(fā)酵過(guò)程中盡量控制酒精的產(chǎn)生量，如冷接觸和限制發(fā)酵等[2]。使用特殊酵母進(jìn)行無(wú)醇啤酒的生產(chǎn)是生物方法中的一種，這種方法主要是利用酵母對(duì)糖的利用情況不同，根據(jù)需要，可配合相應(yīng)的糖化工藝，使得發(fā)酵后酒液的酒精含量較低，符合無(wú)醇啤酒的要求。與傳統(tǒng)釀造酵母相比，“特殊”酵母因無(wú)法發(fā)酵麥汁中的某些可發(fā)酵性糖，傾向于產(chǎn)生較少量的乙醇。例如已在商業(yè)上應(yīng)用多年的非釀酒酵母Saccharomycodes ludwigii[3]。

本研究以Saccharomycodes ludwigii酵母TTNA-01 為對(duì)照酵母，通過(guò)糖利用試驗(yàn)、酒花耐受試驗(yàn)、酒精度、風(fēng)味、成熟度等指標(biāo)，進(jìn)行無(wú)醇酵母的篩選，從多株酵母中篩選出1 株無(wú)醇酵母TTNA-05，通過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)，該酵母在原麥汁濃度7°P 時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生酒精濃度≤0.5 %vol，符合無(wú)醇啤酒的要求。并通過(guò)DOE 試驗(yàn)對(duì)TTNA-01、TTNA-05 酵母進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，根據(jù)優(yōu)化工藝，使用兩株酵母分別進(jìn)行無(wú)醇啤酒的生產(chǎn)，所得無(wú)醇啤酒沒(méi)有麥汁味，TTNA-01 具有果香味，TTNA-05 具有輕微4-VG味，可作為新口味的無(wú)醇啤酒的生產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料及菌種：酵母，本公司保藏；麥芽、酒花，本公司使用。

耗材：30 %異構(gòu)α-酸鉀鹽酒花浸膏，巴特哈斯；YPD 培養(yǎng)基，生工；新型微生物微量生化鑒定管，環(huán)凱生物。

儀器設(shè)備：離心機(jī)，英國(guó)SIGMA 公司；顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；渦旋振蕩器，IKA 公司；Lambda 2S 分光光度計(jì)，PERKIN ELMER 公司；培養(yǎng)箱，德國(guó)賓德；啤酒全自動(dòng)分析儀，奧地利ANTON PAAR公司；氣相色譜儀，美國(guó)GE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥汁制備

麥芽粉碎后與水按照料水比1∶4 混合，首先在50 ℃糖化40 min，同時(shí)開(kāi)始攪拌，隨后升溫至70 ℃進(jìn)行第二段糖化，用碘液檢驗(yàn)糖化程度，直到碘液與糖化液不發(fā)生藍(lán)色反應(yīng)，糖化結(jié)束。煮沸過(guò)程分三次添加酒花，添加量為0.08 %，第一次在麥汁煮沸10 min 時(shí)，加入總量10%，第二次在煮沸35 min時(shí)，加總量50 %，第三次在煮沸70 min 時(shí)，加入總量40%。一共煮90 min。

1.2.2 酵母擴(kuò)培

酵母擴(kuò)培流程：酵母活化—小試管培養(yǎng)（5 mL）—大試管培養(yǎng)（10 mL）—小三角瓶（220 mL）—大三角瓶（2200 mL）—酵母回收。

將待測(cè)酵母活化后分別接入小試管、大試管、小三角瓶、大三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)，25 ℃，36 h。將大三角瓶中培養(yǎng)好的酵母降溫至4 ℃澄清4 h，倒去上清液于4000 r/min離心10 min，進(jìn)行酵母回收。

1.2.3 酵母糖利用實(shí)驗(yàn)

將活化好的酵母取50 μL 分別加入到含有不同碳源的微生物微量生化鑒定管中，加全塞，25 ℃培養(yǎng)1～3 d 觀察顏色變化（根據(jù)顏色變化情況確定酵母是否能夠利用該種碳源）。

1.2.4 酵母酒花耐受實(shí)驗(yàn)

將活化好的酵母按照1∶100 的比例添加到不同苦味值的YPD 培養(yǎng)基中，每梯度進(jìn)行平行試驗(yàn)，25 ℃培養(yǎng)3 d，檢測(cè)OD 值（通過(guò)OD 值的變化來(lái)判斷酵母在該苦味值下的生長(zhǎng)情況），每組試驗(yàn)進(jìn)行3次平行。

1.2.5 其他檢測(cè)

發(fā)酵度、酒精度測(cè)定：啤酒全自動(dòng)分析儀檢測(cè)；雙乙酰含量的測(cè)定：氣相色譜法[4]；風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定：氣相色譜法[4]。

1.2.6 發(fā)酵試驗(yàn)

2 L 發(fā)酵瓶中裝7 °P 麥汁1.6 L，接入酵母泥，使?jié)M罐酵母數(shù)控制在10×106個(gè)/mL，20 ℃發(fā)酵。

1.2.7 無(wú)醇酵母DOE試驗(yàn)及驗(yàn)證

1.2.7.1 無(wú)醇酵母DOE試驗(yàn)

為進(jìn)一步了解TTNA-01、TTNA-05 酵母的發(fā)酵性能，確定最佳無(wú)醇啤酒生產(chǎn)工藝，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案：酵母：TTNA-01、TTNA-05，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)培；麥汁：13°P 生產(chǎn)麥汁；發(fā)酵溫度：12～20 ℃；充氧量：180 r/min，10～30 min；發(fā)酵時(shí)間：3～5 d；酵母數(shù)：3×106個(gè)/mL～10×106個(gè)/mL；規(guī)模：0.5 L。

1.2.7.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)該試驗(yàn)驗(yàn)證DOE 試驗(yàn)確定的發(fā)酵工藝的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)方案：采用DOE 試驗(yàn)確定的酵母及工藝進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母糖利用

不同酵母對(duì)糖的利用情況是不同的，利用微生物微量生化鑒定管，鑒定酵母對(duì)麥汁中不同糖是否能夠利用，可以了解該酵母對(duì)糖的利用情況，初步判定酵母是否可以用于無(wú)醇啤酒的生產(chǎn)。

根據(jù)1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法對(duì)7 株酵母的糖利用情況進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 結(jié)果可看出不同酵母糖利用存在差異，TTNA-02、TTNA-03、TTNA-04 僅能利用麥汁中的葡萄糖及果糖；TTNA-01、TTNA-05 酵母能利用麥汁中的葡萄糖、果糖和蔗糖；TTNA-06、TTNA-07 能利用麥汁中的葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖。

表1 不同酵母可利用麥汁中糖的種類

2.2 酵母酒花耐受

因?yàn)槭占慕湍?，大部分都不是釀酒酵母，所以其?duì)酒花的耐受能力是未知的，為了便于了解酵母的酒花耐受能力，更好的應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)，通過(guò)不同苦味值的（苦味質(zhì)梯度設(shè)置為0 BU、10 BU、20 BU、30 BU、50 BU、100 BU）單因子試驗(yàn)，確定7株酵母對(duì)酒花物質(zhì)的耐受能力。

根據(jù)1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法對(duì)不同酵母不同苦味值下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果取平均值減去空白后得到數(shù)據(jù)表2。

表2 酵母在不同苦味值下OD值

由表2 數(shù)據(jù)可以看出，TTNA-04 酵母在苦味值達(dá)到50 BU 時(shí)生長(zhǎng)受到明顯抑制，其他6 株酵母在苦味值達(dá)到100 BU時(shí)生長(zhǎng)情況無(wú)明顯影響。

2.3 發(fā)酵試驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定酵母的發(fā)酵性能，篩選出優(yōu)良的無(wú)醇酵母菌株，使用步驟1.2.2 回收的酵母進(jìn)行2 L 發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)中除添加酵母不同，麥汁、充氧及其他工藝控制均相同。

表3 是發(fā)酵后冷貯酒的發(fā)酵度、酒精度及成熟度指標(biāo)，由表3 數(shù)據(jù)可以看出，采用7°P 無(wú)醇麥汁，5 株酵母TTNA-01、TTNA-02、TTNA-03、TTNA-04、TTNA-05 酒精度在0.5 %vol 以下，符合無(wú)醇啤酒的要求；TTNA-06、TTNA-07 酵母酒精度在0.5%vol～2.5%vol 之間可以作為低醇酵母。酒液的發(fā)酵度、酒精度與酵母對(duì)糖的利用明顯相關(guān)。從成熟度數(shù)據(jù)來(lái)看，TTNA-01、TTNA-03、TTNA-05、TTNA-06成熟度較好。

表3 冷貯酒發(fā)酵度、酒精度及成熟度

表4 是不同酵母發(fā)酵后冷貯酒的風(fēng)味指標(biāo)，由表4數(shù)據(jù)可以看出，無(wú)醇酵母：TTNA-04酵母醇、酯產(chǎn)量非常低，經(jīng)品評(píng)冷貯酒麥汁味明顯；TTNA-03酵母酯產(chǎn)量較高，經(jīng)品評(píng)冷貯酒酯香過(guò)于突出，酒體不協(xié)調(diào)；TTNA-01、TTNA-05 酵母醇產(chǎn)量較高；低醇酵母：TTNA-06 酵母醇、酯產(chǎn)量均較高，TTNA-07醇產(chǎn)量較高。綜合發(fā)酵性能、風(fēng)味指標(biāo)及品評(píng)結(jié)果，TTNA-01、TTNA-05 較為適合生產(chǎn)無(wú)醇啤酒，TTNA-06酵母生產(chǎn)低醇啤酒較有優(yōu)勢(shì)。

表4 冷貯酒醇酯檢測(cè)

2.4 無(wú)醇酵母DOE試驗(yàn)

使用Minitab 軟件進(jìn)行5 因子2 水平分辨度為V的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表5。

表5 DOE試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表6 為DOE 試驗(yàn)發(fā)酵結(jié)果，由表6 數(shù)據(jù)可以看出，所有發(fā)酵試驗(yàn)的冷貯酒發(fā)酵度均在11%左右，當(dāng)麥汁濃度7°P 時(shí)酒精度均≤0.5%，冷貯酒的成熟度指標(biāo)可以接受。

表6 DOE試驗(yàn)發(fā)酵數(shù)據(jù)

因發(fā)酵后酒精產(chǎn)量均能滿足無(wú)醇啤酒的要求，因此進(jìn)行DOE 發(fā)酵試驗(yàn)優(yōu)化時(shí)不考慮酒精產(chǎn)量。當(dāng)不考慮酒精產(chǎn)量時(shí)，向總醇、總酯望大，乙醛、雙乙酰望小的方向進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1結(jié)果可以看出，采用TTNA-01 酵母，滿罐酵母數(shù)10×106個(gè)/mL，充氧10 min，20 ℃發(fā)酵5 d，該結(jié)果最優(yōu)。

圖1 DOE試驗(yàn)優(yōu)化圖（包含TTNA-01、TTNA-05數(shù)據(jù)）

提取TTNA-01 酵母的發(fā)酵數(shù)據(jù)，針對(duì)TTNA-01 酵母不考慮酒精產(chǎn)量，向總醇、總酯望大，乙醛、雙乙酰望小的方向進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果為滿罐酵母數(shù)10×106個(gè)/mL，充氧量10 min，20 ℃發(fā)酵5 d，與無(wú)醇酵母優(yōu)化結(jié)果一致。

圖2 DOE試驗(yàn)優(yōu)化圖（僅TTNA-01數(shù)據(jù)）

提取TTNA-05 酵母的發(fā)酵數(shù)據(jù)，針對(duì)TTNA-05 酵母不考慮酒精產(chǎn)量，向總醇、總酯望大，乙醛、雙乙酰望小的方向進(jìn)行優(yōu)化得到優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果為滿罐酵母數(shù)7.5×106個(gè)/mL，充氧量10 min，20 ℃發(fā)酵5 d。

圖3 DOE試驗(yàn)優(yōu)化圖（僅TTNA-05數(shù)據(jù)）

通過(guò)進(jìn)行菌種、酵母數(shù)、充氧量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間5因子兩水平DOE試驗(yàn)，分析數(shù)據(jù)優(yōu)化得到工藝為：采用TTNA-01 酵母，滿罐酵母數(shù)10×106個(gè)/mL，充氧10 min，20 ℃發(fā)酵5 d。

針對(duì)TTNA-05 酵母數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，優(yōu)化得到工藝為：滿罐酵母數(shù)7.5×106個(gè)/mL，充氧量10 min，20 ℃發(fā)酵5 d。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

酵母：TTNA-01、TTNA-05，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)培；麥汁：工廠麥汁；滿罐酵母數(shù)：TTNA-01 酵母10×106個(gè)/mL；TTNA-05 酵母7.5×106個(gè)/mL；工藝：充氧180 r/min，10 min，20 ℃發(fā)酵5 d。

規(guī)模：2 L。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表7、表8 所示，由表7、表8 數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)麥汁濃度7 °P 時(shí)，TTNA-01 有果香味，TTNA-05 酵母有輕微4-VG 味，酒精度≤0.5%vol，符合無(wú)醇啤酒的要求。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)冷貯酒發(fā)酵度、酒精度及成熟度

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)冷貯酒醇酯 (mg/L)

3 結(jié)論

綜合生理生化試驗(yàn)結(jié)果、酒精度、成熟度、總醇、總酯等指標(biāo)，TTNA-01、TTNA-05 酵母適合生產(chǎn)無(wú)醇啤酒。經(jīng)過(guò)發(fā)酵工藝研究充分了解菌株性能，TTNA-01、TTNA-05 酵母在滿罐酵母數(shù)3×106個(gè)/mL～10×106個(gè)/m，發(fā)酵溫度12～20 ℃，發(fā)酵時(shí)間3～5 d 時(shí)，發(fā)酵生產(chǎn)麥汁，酒精度均符合無(wú)醇啤酒的要求。

通過(guò)DOE試驗(yàn)，優(yōu)化得到結(jié)果：采用TTNA-01酵母，滿罐酵母數(shù)10×106個(gè)/mL，充氧量10 min，20 ℃發(fā)酵5 d，最佳。經(jīng)過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)麥汁濃度7°P 時(shí)，TTNA-01 有果香味，TTNA-05 酵母有輕微4-VG 味，酒精度≤0.5 %vol，符合無(wú)醇啤酒的要求。因此采用TTNA-01、TTNA-05 兩株酵母進(jìn)行無(wú)醇啤酒的生產(chǎn)是可行的。