吳玉軒，汪俊卿，劉玉濤，張夢(mèng)夢(mèng)，任廣花，王文潔，崔吉鵬

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353；2.濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司技術(shù)質(zhì)量部，山東濟(jì)南 250115）

窖池固態(tài)釀造是我國(guó)濃香型白酒的獨(dú)特生產(chǎn)方式。酒醅與窖池四周的窖泥大面積直接接觸，為釀造微生物提供了良好的生存環(huán)境，也是合成己酸乙酯、丁酸、己酸等多種關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)微生物的重要來(lái)源。不同窖池生產(chǎn)的濃香型白酒存在品質(zhì)差異，這主要由于窖池中的窖泥在長(zhǎng)期的釀造過(guò)程中，窖泥的理化因素（如含水量、有效磷、腐殖質(zhì)、有效鉀、pH值、銨態(tài)氮等）會(huì)發(fā)生變化，這些變化會(huì)對(duì)窖泥中優(yōu)勢(shì)微生物的富集起到較好的促進(jìn)作用[1-4]。如窖泥的含水量可影響土壤的酸堿度和窖泥是否板結(jié)；pH 值變化不僅能夠改變窖泥性質(zhì)，影響窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)，而且能夠影響微生物的代謝和促進(jìn)酒精發(fā)酵，進(jìn)而提高優(yōu)質(zhì)白酒的得率；銨態(tài)氮可使窖泥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)直接被窖泥中的微生物吸收，能夠有效促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和代謝，對(duì)改善窖泥品質(zhì)具有重要作用等等，由此可知理化指標(biāo)可間接反映窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)及其豐度[5-7]。

梭菌屬（Clostridium）微生物是濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)形成的重要菌群之一，窖泥中梭菌綱微生物是濃香型白酒釀造過(guò)程重要的生香菌，它們能夠產(chǎn)生多種脂肪酸，對(duì)濃香型白酒典型風(fēng)格的形成發(fā)揮著重要作用。白酒發(fā)酵體系是多菌種參與的體系，梭菌之間、梭菌和其他微生物之間都會(huì)存在相互作用。如梭菌利用其他種屬微生物的代謝產(chǎn)物為底物生長(zhǎng)并代謝。C.kluyveri可以利用C.ljungdahlii產(chǎn)生的乙酸和乙醇合成丁酸和己酸。對(duì)濃香型白酒窖泥微生物追蹤發(fā)現(xiàn)，窖泥是厭氧菌的持續(xù)釋放源，厭氧菌（Clostridium、Petrimonas、Sedimentibacter和Syntrophomonas等）會(huì)不斷的遷移到酒醅當(dāng)中。Gao[11]發(fā)現(xiàn)窖泥中的Caproiciporducens、Caloramator、Sedimentibacter和Caldicoprobacter等細(xì)菌遷移到了酒醅當(dāng)中，而且這些微生物增加了酒醅微生物的多樣性，并產(chǎn)生了豐富的揮發(fā)性酸和直鏈醇，改善了白酒的風(fēng)味[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)以山東某酒廠優(yōu)質(zhì)老窖泥作為研究對(duì)象，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)結(jié)合窖泥理化性質(zhì)，探究?jī)?yōu)質(zhì)窖泥的梭菌微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度，為穩(wěn)固窖泥質(zhì)量提供了技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

窖泥采集：具體見(jiàn)1.2.1。

試劑及耗材：Gelstain 染液、Easytaq DNA 聚合酶、DNA maker，北京全式金生物科技有限公司提供；DNA 提取試劑盒、Dia Spin 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、去離子甲酰胺、丙烯酰胺，生工生物工程（上海）股份有限公司；窖泥，來(lái)自山東某酒廠濃香型白酒車間。

儀器設(shè)備：PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，美國(guó)BIO-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng)，生工生物工程（上海）股份有限公司；ST16R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥樣品采集

窖泥樣品：取10個(gè)窖泥樣品，分別為A班的A-1、A-2、A-3、A-4、A-5 號(hào)窖池和B 班的B-1、B-2、B-3、B-4、B-5 號(hào)窖池。均采集于山東某酒廠優(yōu)質(zhì)窖池的池底泥，將樣品保存在無(wú)菌自封袋中，迅速放置到-20 ℃?zhèn)溆?。取樣方法參照五點(diǎn)取樣法，如圖1 所示分別在窖池底部的五個(gè)點(diǎn)進(jìn)行取樣，在每個(gè)點(diǎn)分別取10 g 左右的窖泥樣品，然后將樣品混合均勻后置于無(wú)菌袋中，記錄樣品信息及相關(guān)理化指標(biāo)，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 窖池底部取樣示意圖

1.2.2 窖泥理化指標(biāo)的測(cè)定

含水量測(cè)定：烘干法；pH 值：電位法；氨態(tài)氮：采用比色法；腐殖質(zhì)：采用油浴法；有效磷：采用鉬酸銨比色法。具體操作方法參照白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)[1]。

1.2.3 窖泥微生物DNA提取

將窖泥樣品取出解凍，稱取0.23 g，按照生工土壤DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行窖泥總DNA 的提取。

1.2.4 窖泥梭菌的PCR擴(kuò)增

以提取到的窖泥總DNA 為模板。使用引物SJ-F（GC）和引物SJR 對(duì)窖泥微生物中的梭菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物及擴(kuò)增程序參考盧振試驗(yàn)方法[12-13]。

1.2.5 窖泥梭菌的變性梯度凝膠電泳

電泳完畢后取45 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行DGGE 分析。采用變性梯度為50%～55%、質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE 緩沖液中60 V、60 ℃條件下電泳930 min。

使用gelatain 染液染色30 min，然后用超純水脫色30 min，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照[14-17]。

1.2.6 條帶測(cè)序

用滅菌的手術(shù)刀切下待回收的DGGE 條帶，以引物SJ-F 和SJ-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接至大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和M13F/R引物PCR檢測(cè)后置于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將菌液進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)檢測(cè)

由圖2 可知，參照趙長(zhǎng)青窖泥指標(biāo)進(jìn)行比較[5]，所挑選的10 個(gè)優(yōu)質(zhì)窖泥水分含量檢測(cè)，A-1、B-1、B-4、B-5 為二級(jí)窖泥指標(biāo)，A-2、A-3、A-4、A-5、B-2、B-3 為一級(jí)窖泥指標(biāo)；pH 數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果表明，B-1、B-4 為二級(jí)窖泥指標(biāo)，其余皆為一級(jí)窖泥指標(biāo)；腐殖質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果顯示，所挑選的10 個(gè)窖泥所含有的腐殖質(zhì)含量均滿足一級(jí)窖泥質(zhì)量要求；有效磷和氨態(tài)氮檢測(cè)結(jié)果表明，除B-1 有效磷滿足一級(jí)窖泥指標(biāo)外，其余優(yōu)質(zhì)窖池的窖泥檢測(cè)數(shù)據(jù)均高于文獻(xiàn)中一級(jí)窖泥指標(biāo)。查閱文獻(xiàn)可知不同酒廠的窖泥理化指標(biāo)因培養(yǎng)環(huán)境、地理位置、測(cè)定方法等因素而沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)范圍，不同酒企要根據(jù)窖池的實(shí)際情況，依據(jù)酒廠窖泥理化指標(biāo)的長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)積累和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定窖泥的參考指標(biāo)。窖泥中絕大多數(shù)微生物以銨鹽和含氮有機(jī)物作為養(yǎng)料，氨態(tài)氮可以為窖泥中細(xì)菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，故窖泥中氨態(tài)氮含量高可以判定窖泥的質(zhì)量較好。有效磷是土壤中植物直接吸收利用的磷，是微生物生長(zhǎng)、繁殖的必需成分之一，因此，較高的有效磷含量可以作為窖泥質(zhì)量較優(yōu)的指標(biāo)。綜上所述，理化分析結(jié)果表明所選10 個(gè)窖泥在理化參數(shù)層面均符合優(yōu)質(zhì)窖泥的要求[21-22]。

圖2 窖泥理化檢測(cè)

2.2 瓊脂糖凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示，所測(cè)10 個(gè)窖池泥中擴(kuò)增到的梭菌條帶清晰明亮，且對(duì)照未擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明擴(kuò)增的結(jié)果可用于以下實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳

2.3 變性梯度凝膠電泳

2.3.1 DGGE指紋圖譜的豐度和優(yōu)勢(shì)度比較

如圖4 和圖5 所示，在優(yōu)質(zhì)窖池泥中擴(kuò)增出大量的梭菌綱微生物。條帶的數(shù)目代表了微生物種類，在B-2 號(hào)窖池泥中測(cè)出的梭菌綱微生物最多，有21 種；在B-1 號(hào)窖池泥測(cè)出的梭菌綱最少，有8種。這些優(yōu)質(zhì)窖池泥中分離出的共有微生物較多。條帶的寬度和亮度代表了微生物的含量，條帶越寬越亮，該微生物的含量就越大，在這些優(yōu)質(zhì)窖池泥中擴(kuò)增出大量的優(yōu)勢(shì)微生物，如15 號(hào)（圖5 所示的標(biāo)號(hào)）在各自的泳道中均占到了5.2 %以上的比例[18-20]。

圖4 窖池泥梭菌DGGE指紋圖譜

圖5 窖池泥梭菌群落豐度示意圖

條帶（代表菌）在各自泳道中所占的比例如表1所示（以下標(biāo)號(hào)同圖4 中的標(biāo)號(hào)），4 號(hào)、7 號(hào)、15 號(hào)、23 號(hào)均存在于所有的窖泥中。在A-3、A-4 和B-1號(hào)窖池含量最多的菌是4 號(hào)菌；A-2 號(hào)窖池含量最多的菌是12 號(hào)菌；A-4 號(hào)窖池中含量最多的菌是14 號(hào)菌；A-1 號(hào)窖池含量最多的菌是中15 號(hào)菌；B-2、B-3、B-4 及B-5 號(hào)窖池含量最多的菌是13 號(hào)菌。根據(jù)泳道中各條帶所占比例可知B 班的5 個(gè)窖池中有4 個(gè)窖池的最優(yōu)菌是相同的，優(yōu)質(zhì)窖池的優(yōu)勢(shì)功能菌集中在這幾種菌[23-25]。

表1 泳道中各條帶所占比例

2.3.2 DGGE指紋圖譜的相似性比較

根據(jù)DGGE 指紋圖譜的條帶光密度值對(duì)檢測(cè)的10 個(gè)窖池進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果如圖6 所示。泳道6單獨(dú)為一簇；#1（A-1）、#2（A-2）、#4（A-4）聚為一簇，相似度在0.66～0.71 之間；其它6 個(gè)泳道聚為一簇，相似度在0.62～0.88 之間。相似度高于0.60 的群體具有較好的相似性，可知#1（A-1）號(hào)池、#2（A-2）號(hào)池和#4（A-4）號(hào)池具有較好的相似性，#7（B-2）號(hào)池和#9（B-4）號(hào)池的相似性較好，#8（B-3）號(hào)池和#10（B-5）號(hào)池的相似度較好。由此可見(jiàn)同一班次內(nèi)的優(yōu)質(zhì)窖池的梭菌相似性較好，不同班次的梭菌相似性存在差異。

圖6 窖泥梭菌群落相似性指數(shù)樹(shù)狀圖

2.4 測(cè)序結(jié)果分析

在DGGE 指紋圖譜上選取處于不同位置且清晰明亮的條帶，剪切后進(jìn)行擴(kuò)增-連接-轉(zhuǎn)化-篩選-測(cè)序等一系列操作后獲得梭菌的16S rRNA 序列，經(jīng)分析后結(jié)果見(jiàn)表2。

在窖池泥中檢測(cè)到的梭菌在科水平上有：真細(xì)菌科、毛螺菌科、顫螺旋菌科、梭菌科、Caldicoprobacteraceae、Tissierellaceae，其中梭菌科含量最高，其次為毛螺菌科和Tissierellaceae。在屬水平上有：嗜堿菌屬、丁酸弧菌屬、梭菌屬、喜熱菌屬、瘤胃梭菌屬、糞球菌屬、Sedimentibacter、Caldicoprobacter、Tepidimicrobium、Tissierella、Sporanaerobacter、硫酸鹽還原菌屬、魯替孢菌屬和Clostridiisalibacter[26]。

Alkalibaculum sporogenes發(fā)酵的終產(chǎn)物是醋酸酯；丁酸弧菌能夠產(chǎn)生丁酸，為十個(gè)優(yōu)質(zhì)窖池泥中共有的優(yōu)勢(shì)菌，且該菌在無(wú)機(jī)和有機(jī)窖泥中也是共有的優(yōu)勢(shì)菌，由此可見(jiàn)該菌是該廠窖泥中普遍存在的優(yōu)勢(shì)菌；梭菌MT1 與己酸酯的合成相關(guān)；喜熱菌能發(fā)酵產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸及乙醇，該菌在有機(jī)窖泥中檢測(cè)出但在無(wú)機(jī)窖泥中沒(méi)有檢出；Ruminiclostridium papyrosolvens是纖維素降解梭菌，分解纖維素的活性強(qiáng)；糞球菌屬，能發(fā)酵產(chǎn)物丁酸、乙酸和氣體，該菌在有機(jī)窖泥中檢測(cè)出過(guò)；沉積微生物（Sedimentibacter）又叫產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌，能將元素硫、硫酸鹽或硫代硫酸鹽還原成硫化物(如硫化氫)，是非常重要的己酸菌；Caldicoprobacter是在五糧液、瀘州老窖等窖泥中檢測(cè)出的優(yōu)勢(shì)菌[27]；Tepidimicrobium能夠利用乳酸，是降乳酸菌群的優(yōu)勢(shì)微生物，是甲酚生產(chǎn)潛在菌；Sporanaerobacter acetigenes能利用一些糖類、多肽和氨基酸發(fā)酵產(chǎn)醋酸酯、異丁酸和異戊酸酯；硫酸鹽還原菌是一種厭氧、嗜熱、硝酸鹽和硫代硫酸鹽還原菌；魯替孢菌與纖維素降解有關(guān)。硫酸鹽還原菌、己酸菌、甲烷菌等共同組成厭氧發(fā)酵的循環(huán)通路，是優(yōu)質(zhì)窖泥的重要標(biāo)志，由菌的代謝功能可知擴(kuò)增到的細(xì)菌以己酸生成菌和硫酸鹽還原菌為主，硫酸鹽還原菌在釀酒發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，說(shuō)明所選的窖池泥里面的功能菌達(dá)到益于白酒釀造的平衡狀態(tài)。大量研究表明，Sedimentbacter、Tissierella、Caldicoprobacter、硫 酸鹽還原菌、Sporanaerobacter、喜熱菌等是優(yōu)質(zhì)窖泥的重要的指示菌[28]。

3 總結(jié)

通過(guò)對(duì)所選山東某酒廠10 個(gè)窖泥的水分、pH值、有效磷、氨態(tài)氮和腐殖質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在理化參數(shù)層面均符合優(yōu)質(zhì)窖泥標(biāo)準(zhǔn)的要求。

通過(guò)PCR-DGGE 技術(shù)分析窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)可知，在窖池泥中檢測(cè)到的梭菌在屬水平上有：嗜堿菌屬、丁酸弧菌屬、梭菌屬、喜熱菌屬、瘤胃梭菌屬、糞球菌屬、Sedimentibacter、Caldicoprobacter、Tepidimicrobium、Tissierella、Sporanaerobacter、硫酸鹽還原菌屬、魯替孢菌屬和Clostridiisalibacter，這些菌是優(yōu)質(zhì)窖泥的重要的指示菌，可知窖池泥中含有極其豐富的釀酒功能菌。

窖泥測(cè)序檢測(cè)出來(lái)的梭菌中的硫酸鹽還原菌、己酸菌、甲烷菌等共同組成厭氧發(fā)酵的循環(huán)通路，并且檢測(cè)到大量的己酸生成菌和硫酸鹽還原菌，其中以Sedimentibacter等為代表的己酸菌所占比重最大。將條帶與序列結(jié)果對(duì)應(yīng)后發(fā)現(xiàn)丁酸弧菌、Sedimentibacter、Caldicoprobacter、Sporanaerobacter acetigenes、魯替孢菌等菌均存在于所有的窖泥中。其中窖池泥的主要優(yōu)勢(shì)菌是硫酸鹽還原菌、Sporanaerobacter acetigenes、Sedimentibacter和Caldicoprobacter。

本研究通過(guò)對(duì)山東某酒廠濃香型白酒中十個(gè)窖泥的梭菌種類和豐富度進(jìn)行探究和比較，揭示了可能在白酒釀造中起關(guān)鍵作用的梭菌菌群，在分子水平上為研究濃香型白酒提供了理論依據(jù)。后續(xù)可以通過(guò)從濃香窖泥中篩選優(yōu)勢(shì)梭菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)，研究其相關(guān)特性，進(jìn)一步為濃香型白酒生產(chǎn)提供理論依據(jù)。