許 玲，董喬娟，姜明慧，王 洋，白秀彬，趙紀(jì)文*

(1.山東扳倒井股份有限公司，山東高青 256300；2.山東好客酒業(yè)有限公司，山東成武 274200)

優(yōu)越的生態(tài)環(huán)境是中國白酒形成復(fù)合性、豐富性風(fēng)格的自然條件。山東扳倒井股份有限公司地處北緯37°黃金名酒帶和黃河“安瀾灣”濕地交匯處。北緯37°是北半球暖溫帶的中位線，這里四季分明，溫度適宜，世界上許多著名的釀酒產(chǎn)區(qū)都分布在該自然帶上。黃河是中華民族的母親河，萬里黃河在高青“安瀾”形成了獨(dú)特的濕地環(huán)境，使扳倒井所在地具有溫暖濕潤、雨熱同期的地域環(huán)境。

大曲，是釀酒風(fēng)格形成的關(guān)鍵。國井扳倒井白酒采用黃河流域的冬小麥制曲。這里的小麥歷經(jīng)寒暑，經(jīng)黃河水的灌溉，顆粒飽滿，富含淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，制備的大曲品質(zhì)優(yōu)良，釀酒一酒多味，完善發(fā)展了非物質(zhì)文化遺產(chǎn)“宋代扳倒井白酒釀造技藝”。為進(jìn)一步解析黃河麥曲的優(yōu)良性能，本研究對春季制曲過程進(jìn)行全面跟蹤，運(yùn)用高通量測序技術(shù)解析微生物多樣性，明確了大曲在不同發(fā)酵階段微生物群落結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵微生物種類，為優(yōu)化操作、提升大曲質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

曲樣：黃河麥曲（春季生產(chǎn)過程），取自國井扳倒井制曲車間2#—19#曲房。

儀器設(shè)備：Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺（生工生物工程上海股份有限公司）；大曲酶系測定相關(guān)儀器設(shè)備均由山東扳倒井股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大曲發(fā)酵過程取樣

根據(jù)生產(chǎn)工藝，在入房、不同翻曲時(shí)間節(jié)點(diǎn)、出房時(shí)進(jìn)行大曲樣品采集。采集時(shí)，按照四分法采樣，從曲房的四角和中間5 個(gè)位置各取3 塊長勢良好的大曲曲塊，全部粉碎后混合均勻，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大曲理化指標(biāo)及酶活力測定

測定大曲的水分、酸度、淀粉含量，糖化酶、液化酶、蛋白酶、酯化酶活力以及發(fā)酵力。按照《大曲檢測方法》（BDJ/JW-WSW-06）進(jìn)行。

1.2.3 大曲微生物類群的多樣性分析

采用高通量測序技術(shù)分別對大曲中細(xì)菌類群和真菌類群的多樣性進(jìn)行分析。

細(xì)菌的16S rRNA 定制V4 區(qū)擴(kuò)增引物為：515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），真菌擴(kuò)增引物為ITS1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。

PCR 反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCRMasterMix，3 μL BSA(2 ng/μL)，2Primer(5 μM)，2 μL 模板DNA，5 μL ddH2O。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min 終止。擴(kuò)增序列通過Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺進(jìn)行測序，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過cutadapt（去除接頭）、PEAR(序列對拼)、Prinseq(質(zhì)量剪切），去除得分低于20 分、堿基模糊、引物錯(cuò)配或測序長度小于150 bp 的序列。

經(jīng)過上述步驟后，將標(biāo)簽分組具有97 %序列相似性的高質(zhì)量的OTU 序列[14-16]，細(xì)菌得到的每個(gè)OTU 代表序列比對RDP 數(shù)據(jù)庫、silva 數(shù)據(jù)庫和NCBI 16S 數(shù)據(jù)庫，真菌得到的OTU 代表序列比對RDP 數(shù)據(jù)庫和UNITE 數(shù)據(jù)庫。最后再通過人工進(jìn)行檢查以獲得物種信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲發(fā)酵過程品溫變化

由圖1 可知，扳倒井春季制曲時(shí)曲房內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間在24 d 左右。培養(yǎng)過程經(jīng)過三次翻曲、一次合房。中挺時(shí)間7 d左右，中挺溫度60 ℃左右。

圖1 中高溫大曲發(fā)酵過程品溫變化

2.2 大曲理化指標(biāo)變化

由表1可知，一翻前曲塊主要產(chǎn)酸，酸度由0.11上升至1.21，之后隨發(fā)酵有所降低；三翻時(shí)液化酶活力達(dá)到最大，二翻和三翻之間是液化酶大量生成階段，之后有所降低；小麥自身的糖化力較高，入房后糖化力降低，隨著發(fā)酵進(jìn)行，由于微生物的作用，糖化力有所起伏，但最終出房糖化力比較高；小麥自身帶有發(fā)酵力，并且在整個(gè)發(fā)酵過程處于動態(tài)平衡；酯化力在合房到出房時(shí)是大量生成階段；酸性蛋白酶是大曲發(fā)酵過程產(chǎn)生的酶類，一翻前就大量生成，隨著發(fā)酵進(jìn)行有所起伏。

2.3 微生物多樣性

2.3.1 16S高通量分析

由表2 可知，入房時(shí)曲塊的細(xì)菌菌群多樣性最?。╯hannon 值最?。?，二翻前多樣性越來越大，二翻后有所起伏；三翻前細(xì)菌菌群的豐富度越來越高，但三翻后逐漸降低。總體來看，二翻前的培養(yǎng)階段是大曲微生物菌系生長比較活躍的時(shí)期。

表2 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表

由表3和圖2可知：

表3 屬水平下不同制曲階段的細(xì)菌相對豐度比例（%）

圖2 屬水平下不同制曲階段的細(xì)菌相對豐度柱狀圖

①制曲入房時(shí)，物料的微生物來源主要是原料和水中的微生物。因此鏈型植物占據(jù)絕對優(yōu)勢（49.12%），其次是泛菌屬；

②之后的培養(yǎng)過程，泛菌屬（Pantoea）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、片球菌屬（Pediococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）是主要的優(yōu)勢菌屬，乳桿菌屬相對豐度占到42.5%；

③一翻后至二翻，泛菌屬（Pantoea）、魏斯氏菌屬（Weissella）和芽孢桿菌屬（Bacillus）占據(jù)優(yōu)勢；

④三翻操作時(shí)，泛菌屬（Pantoea）再次占據(jù)絕對優(yōu)勢，相對豐度比例高達(dá)49.82 %。分析可能與采集樣品有關(guān)；

⑤合房階段，不動桿菌屬（Acinetobacter）和泛菌屬（Pantoea）占據(jù)優(yōu)勢，相對豐度分別是41.07 %和24.65%；

⑥出房時(shí)，未分類的腸桿菌科（unclassified_Enterobacteriaceae）占據(jù)絕對優(yōu)勢，魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）也屬優(yōu)勢菌屬。

2.3.2 ITS高通量分析

由表4 可知，入房時(shí)真菌的多樣性最?。╯hannon 值最?。?，隨著培養(yǎng)過程出現(xiàn)波動，但變化不大；真菌豐富度的變化與多樣性相似，出房時(shí)真菌豐富度最小。

表4 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表

由表5和圖3可知：

表5 屬水平下不同制曲階段的真菌相對豐度比例（%）

圖3 屬水平下不同制曲階段的真菌相對豐度柱狀圖

①入房時(shí)，物料和水?dāng)y帶的優(yōu)勢真菌為鏈格孢霉屬（Alternaria）和雙足囊菌屬（Dipodascus）；

②一翻時(shí)，優(yōu)勢真菌屬發(fā)生較大變化，生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、根霉屬（Rhizopus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）占據(jù)優(yōu)勢，尤其生絲畢赤酵母屬相對豐度高達(dá)39.97%；

③二翻時(shí)，威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、根霉屬（Rhizopus）、根毛霉屬（Rhizomucor）為優(yōu)勢菌屬；

④三翻時(shí)，根毛霉屬（Rhizomucor）、根霉屬（Rhizopus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）成為優(yōu)勢菌屬；

⑤合房時(shí)，根毛霉屬（Rhizomucor）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、根霉屬（Rhizopus）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）為優(yōu)勢菌屬；

⑥出房時(shí)，伊薩酵母屬（Issatchenkia）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、根毛霉屬（Rhizomucor）為優(yōu)勢菌屬。

2.4 綜合分析

2.4.1 溫度和水分對微生物多樣性的影響

①一翻之前，水分損耗較小，芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、根霉屬（Rhizopus）在小麥自身糖化的情況下，利用糖類迅速繁殖，占據(jù)微生物群落優(yōu)勢，曲塊品溫由30 ℃上升到48 ℃左右。

②二翻至三翻時(shí)曲塊品溫到達(dá)60 ℃左右，并且持續(xù)時(shí)間較長。這個(gè)溫度對微生物的生長繁殖已經(jīng)造成較大影響，但溫度的上升是有一個(gè)過程的，對大曲微生物形成了溫度馴化，因此，此時(shí)仍然由泛菌屬（Pantoea）、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、根霉屬（Rhizopus）、根毛霉屬（Rhizomucor）等耐高溫的菌屬占據(jù)優(yōu)勢。經(jīng)過這個(gè)高溫階段，水分散發(fā)也比較快，降到了14.8%。

③三翻后曲塊的品溫逐步降低，魏斯氏菌屬（Weissella）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）等又開始活躍成為優(yōu)勢菌屬，尤其是出房時(shí)伊薩酵母屬（Issatchenkia）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）占據(jù)真菌較大優(yōu)勢。

2.4.2 酶系與微生物菌屬的關(guān)系

①在一翻前乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）占據(jù)絕對優(yōu)勢，推測是造成大曲酸度上升和酸性蛋白酶生成的主要菌屬；

②二翻至三翻時(shí)的根霉屬（Rhizopus）和根毛霉屬（Rhizomucor）占據(jù)優(yōu)勢，推測是液化力和糖化力的主要貢獻(xiàn)者，尤其是液化力，在二翻和三翻時(shí)達(dá)到頂峰；

③合房后的后熟階段，酵母菌屬占據(jù)優(yōu)勢，推測是出房酯化力的主要貢獻(xiàn)者。

3 結(jié)論

扳倒井黃河麥春季制曲工藝經(jīng)歷三次翻曲，翻曲節(jié)點(diǎn)品溫控制為48 ℃、61 ℃、61 ℃，中挺時(shí)間控制在6～7 d，微生物菌群多樣性和酶系豐富，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）是造成大曲酸度上升和酸性蛋白酶生成的主要菌屬，根霉屬（Rhizopus）和根毛霉屬（Rhizomucor）是液化力和糖化力的主要貢獻(xiàn)者，酵母菌屬是大曲酯化力的主要貢獻(xiàn)者。下一步將進(jìn)一步挖掘可培養(yǎng)的菌屬資源，并進(jìn)一步探究其和制曲操作的對應(yīng)關(guān)系，提升大曲質(zhì)量，為白酒品質(zhì)提升奠定基礎(chǔ)。