曾奇吳雅晨胡茂華笪小云劉楊楊欣鄧穎劉明?

（1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥、民族藥藥理作用及作用機(jī)制研究中心，貴陽(yáng) 550025）

腦卒中是嚴(yán)重危害我國(guó)國(guó)民健康的常見(jiàn)心腦血管疾病，是我國(guó)成人高致殘率及高致死率的首位病因，現(xiàn)患病人數(shù)高居世界首位[1]。 其中，缺血性腦卒中的患病人數(shù)占全部腦卒中的70% ～80%。缺血性腦卒中發(fā)病后，如果錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，70%～80%患者會(huì)遺有不同程度的認(rèn)知或運(yùn)動(dòng)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。 現(xiàn)階段針對(duì)缺血性腦卒中的有效治療為溶栓治療，快速恢復(fù)供血[3]，但在此期間由炎癥反應(yīng)引起的腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）嚴(yán)重威脅著患者的預(yù)后。

NLRP3 介導(dǎo)的炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)在缺血再灌注損傷中扮演著極為重要的調(diào)控角色。 研究指出，NLRP3 炎癥小體一經(jīng)被激活即能與效應(yīng)分子pro-Caspase-1 直接結(jié)合， 形成炎癥小體和成熟的Caspase-1，Caspase-1 在疾病進(jìn)程中起重要作用[4]；Caspase-1 蛋白的激活可促使白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白介素18（interleukin-18，IL-18）水解釋放，引起細(xì)胞焦亡，這也是一種細(xì)胞死亡，影響急性和慢性腦部疾病發(fā)生發(fā)展[5]。 因此，通過(guò)調(diào)控NLRP3 炎癥小體及其上下游通路，可能為腦缺血再灌注損傷的研究提供重要依據(jù)[6-7]。

淫羊藿，也稱仙靈脾，屬小檗科植物。 有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功，在中國(guó)有2000 多年的藥用歷史。 淫羊藿的化學(xué)成分包括黃酮、木脂素、苯酚苷等[8]。 其中，黃酮類成分如淫羊藿苷（icariin，ICA） 是其重要的活性物質(zhì)[9]。 ICA 分子式C33H40O15，相對(duì)分子質(zhì)量為676.65，研究證實(shí)ICA具有抗腦缺血損傷、改善血液流變學(xué)抗血栓形成、抗腦衰老及血管性癡呆等作用[10-13]。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ICA 可能通過(guò)調(diào)控TLR4／NF-κB 信號(hào)通路及相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3 的表達(dá)，改善大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺陷，抑制炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10，14]。 但其作用機(jī)制是否與調(diào)控NFκB 信號(hào)通路下游靶點(diǎn)NLRP3 炎癥小體有關(guān)尚不清楚。 因此，本實(shí)驗(yàn)利用線栓法模擬單側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO），MCAO 閉塞2 h 后取出線栓，造成再灌注損傷，構(gòu)建CIRI 大鼠模型，觀察ICA 對(duì)CIRI 大鼠神經(jīng)功能及病理?yè)p傷的影響，測(cè)定大腦皮層中炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 的表達(dá)，探討淫羊藿苷治療大鼠腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80 只7 周齡SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠，體重250 ～280 g，均購(gòu)于湖南天勤生物技術(shù)有限公司【SCXK（湘）2019-0014】，飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境【SYXK（黔）2021-0005】，5 只／籠， 采用12 h 晝夜間斷照明，溫度為（20 ±2） ℃，相對(duì)濕度為（55 ± 5）%，期間自由進(jìn)食飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20220102）。

1.1.2 主要試劑與儀器

淫羊藿苷（西安欣祿生物科技有限公司，批號(hào)YYH20180518，純度≥98%）；蘇木素-伊紅（HE）染液（均購(gòu)買于武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)分別為：ZH202509、CR2011064）；丁苯酞軟膠囊（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20190218）；NLRP3，ASC，Caspase-1，IL-1β、IL-18 一抗（美國(guó)Affinity 公司， 批號(hào)分別為： DF7438， AF5103，AF5418，A13615，A0208）；β-actin 內(nèi)參（abclonal，批號(hào)為AC026）；羊抗兔二抗（艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)：ab6721）。

RM2016 型病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；BMJ-A 型包埋機(jī)，常州郊區(qū)中威電子儀器廠；BX51T-PHD-J11 型顯微鏡，日本Olympus 公司；H2050R 高速低溫離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)；Image-Pro Plus 多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)，美國(guó)Media Cybernetics 公司；DYY-6C 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；IMS-25 制冰機(jī)，蘇州麥艾仕電器有限公司；Varioska 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；MCAO 栓線（250 ～280 g），北京西濃科技有限公司；4-0 帶針外科縫線，上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司淮明醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組

參照文獻(xiàn)[10，15]改良制作CIRI 大鼠模型，即：20%烏拉坦腹腔注射（0.6 mL／100 g）麻醉后，在頸部正中略向右側(cè)做1.5 cm 縱向切口，通過(guò)溫和的鈍性分離處理皮下結(jié)締組織和肌肉，精確定位右側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA），頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。 使用縫線對(duì)頸外動(dòng)脈和CCA 近心端進(jìn)行結(jié)扎，CCA 近心端的上部用動(dòng)脈夾夾閉，CCA 分叉處預(yù)留活節(jié)（不系緊）縫線固定MCAO 栓線，在動(dòng)脈夾與CCA 結(jié)扎點(diǎn)中間處剪一“V”型小口，插入MCAO 栓線，將栓線從分叉處經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢送入18 ～20 mm，縫線外科結(jié)固定栓線，阻斷大腦中動(dòng)脈血流2 h 后取出栓線，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，縫合。 假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈處理后逐層縫合。 術(shù)后24 h，參照LONGA 等[15]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，具體操作：肢體活動(dòng)無(wú)異常，計(jì)0 分；提大鼠尾部時(shí)，不能完全伸展左前爪，計(jì)1 分；伴行走時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)行為，計(jì)2 分；發(fā)生向左側(cè)跌倒的情況，計(jì)3 分；完全不能自由正?；顒?dòng)或無(wú)意識(shí)表現(xiàn)，計(jì)4 分。

選取評(píng)分為1 ～3 分的成功模型，隨機(jī)分為5組， 即模型組 （ Model group ）、 丁苯酞組（Butylphthalide group，70 mg／kg）、ICA 高劑量組（ICA-high dose group，80 mg／kg）、ICA 中劑量組（ICA-medium dose group，40 mg／kg）和ICA 低劑量組（ICA-low dose group，20 mg／kg），加上假手術(shù)組（Sham operation group）共6 組，每組12 只。 灌胃體積10 mL／kg，每天灌胃給藥1 次，連續(xù)13 d。 假手術(shù)組和模型組給予等容積的生理鹽水。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分

末次給藥1 h 后，按上述方法再次對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

1.2.3 HE 染色法進(jìn)行病理學(xué)觀察

每組隨機(jī)取5 只大鼠，麻醉處死后取大腦，4%多聚甲醛固定48 h 以上，梯度乙醇脫水，石蠟包埋冰凍后，切片4 μm，脫蠟，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行HE 染色操作，光學(xué)顯微鏡下觀察缺血周圍區(qū)大腦皮層相同部位視野病理學(xué)變化并拍照，計(jì)數(shù)神經(jīng)元和完整神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.4 免疫組化法測(cè)定IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)

取“1.2.3”項(xiàng)下大鼠大腦空白切片，在經(jīng)過(guò)脫蠟和脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)。 接著滴加5% BSA 封閉液，隨后滴加一抗：抗IL-1β（1 ∶100）、抗IL-18（1 ∶100），最后將切片放置于4 ℃冰箱過(guò)夜。 接著滴加生物素標(biāo)記的二抗，在37 ℃環(huán)境中孵育20 min。隨后進(jìn)行PBS 沖洗，滴加SABC，在25 ℃環(huán)境中孵育20 min，PBS 洗滌，使用DAB 顯色，然后經(jīng)蘇木素復(fù)染、分化、封片、晾干處理后，使用光鏡進(jìn)行觀察。在隨機(jī)選擇的5 個(gè)不重疊缺血周圍區(qū)大腦皮層視野中，利用IPP 6.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性著色細(xì)胞（胞質(zhì)及突起內(nèi)充滿棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)顆粒）進(jìn)行光密度計(jì)數(shù)，取得每個(gè)樣本的平均光密度計(jì)數(shù)平均值，用以反映大腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白的表達(dá)量。

1.2.5 Western Blot 法測(cè)定NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平

每組隨機(jī)選取5 個(gè)缺血側(cè)大腦皮層組織，勻漿離心取上清，進(jìn)行BCA 蛋白定量測(cè)定，并于SDSPAGE 凝膠里電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；分別加入一抗NLRP3、ASC、Caspase-1、β-actin（均按1 ∶1000 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌3 次后加入1 ∶5000羊抗兔二抗室溫中速搖晃1 h，再次TBST 洗滌3次，進(jìn)行顯影。 采用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 26.0 軟件，所有數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)多組間的均值進(jìn)行比較時(shí)，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果

相對(duì)于假手術(shù)組，模型組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分上升趨勢(shì)顯著（P＜0.01）。 與模型組相比，丁苯酞組、ICA 高劑量組、ICA 中劑量組和ICA 低劑量組的神經(jīng)功能呈下降趨勢(shì)，其中以ICA 高劑量組和ICA中劑量組的降低最明顯（P＜0.01，P＜0.05），這提示ICA 可能在改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能損傷方面具有顯著效果。 見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分Note. Compared with sham operation group， ??P ＜0.01.In contrast to the model group，＃ P ＜0.05，＃＃ P ＜0.01.（The same in the following figures）Figure 1 Neurological function score of rats

2.2 大鼠缺血周圍區(qū)大腦皮層病理表現(xiàn)

假手術(shù)組腦組織無(wú)缺血性征象，神經(jīng)元密集，神經(jīng)元胞漿豐富，淡染，胞核居中，核仁清楚。 模型組的缺血周圍區(qū)大腦皮層出現(xiàn)為神經(jīng)元和神經(jīng)纖維大量發(fā)生變性壞死，同時(shí)神經(jīng)元呈稀疏分布。 胞膜胞核輪廓顯示不清，胞體皺縮，胞核固縮深染，且神經(jīng)元脫失現(xiàn)象明顯。 與模型組比較，各給藥組大鼠缺血周圍區(qū)大腦皮層正常與壞死細(xì)胞相間存在，神經(jīng)元不同程度壞死或膠質(zhì)細(xì)胞增生。 其中，丁苯酞組及ICA 高劑量組、ICA 中劑量組結(jié)構(gòu)完整可辨的神經(jīng)元數(shù)量較多（P＜0.01，P＜0.05）。 見(jiàn)圖2，圖3。

圖2 大鼠缺血周圍區(qū)腦組織完整神經(jīng)元Figure 2 Intact neurons in ischemic peripheral brain tissue of rats

圖3 大鼠缺血周圍區(qū)腦組織完整神經(jīng)元Figure 3 Intact neurons in the periischemic brain tissue of rats

2.3 大鼠大腦皮層IL-1β、IL-18 陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

IL-1β、IL-18 的陰性細(xì)胞呈藍(lán)色，底物呈白色，陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為黃色或棕黃色，其陽(yáng)性產(chǎn)物主要集中分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)。 模型組和假手術(shù)組相比，大鼠大腦皮層IL-1β、IL-18 陽(yáng)性表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。 與模型組相比，丁苯酞組及ICA 高劑量組、ICA 中劑量組、ICA 低劑量組大鼠大腦皮層IL-1β 陽(yáng)性均降低，其中以丁苯酞組及ICA 高劑量組下降顯著（P＜0.01），丁苯酞組和ICA 高劑量組、ICA 中劑量組大鼠大腦皮層IL-18 陽(yáng)性表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。 見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠大腦皮層IL-1β、IL-18 含量檢測(cè)結(jié)果Figure 4 Detection results of IL-1β and IL-18 contents in cerebral cortex of rats

2.4 大鼠大腦皮層NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)量

相對(duì)于假手術(shù)組，模型組大鼠大腦皮層中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)量見(jiàn)顯著升高（P＜0.01）。 與模型組相比，丁苯酞組和ICA 高劑量組、ICA 中劑量組大鼠大腦皮層中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)均降低明顯（P＜0.01，P＜0.05）；ICA 低劑量組Caspase-1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。 見(jiàn)圖5。

圖5 大鼠大腦皮層NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 5 Results of NLRP3， ASC， Caspase-1 protein expression in cerebral cortex of rats

3 討論

根據(jù)《中國(guó)腦卒中防治報(bào)告2021》最新概要報(bào)道，我國(guó)是卒中發(fā)病大國(guó)，患病人數(shù)居世界首位，卒中是我國(guó)成人致死、致殘首要病因，嚴(yán)重影響我國(guó)居民健康[1]。 缺血性腦卒中在卒中的比例呈逐年升高趨勢(shì)，即使給與血管內(nèi)藥物溶栓和介入取栓等有效的治療，諸多患者仍會(huì)遺留相關(guān)后遺癥。 腦缺血再灌注損傷的發(fā)生是多機(jī)制共同參與的復(fù)雜過(guò)程，此過(guò)程密切相關(guān)的因素有氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥反應(yīng)激活及能量代謝異常。 最終這些復(fù)雜的生物學(xué)變化導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，不可逆的使神經(jīng)功能損傷[16-17]。

其中，一系列的炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)在缺血性腦卒中神經(jīng)損傷的起重要作用[18]。 缺血性腦卒中發(fā)生后，伴隨著能量被大量消耗，以及出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡，引發(fā)腦實(shí)質(zhì)外周循環(huán)白細(xì)胞浸潤(rùn)，腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，觸發(fā)一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重外周白細(xì)胞浸潤(rùn)和神經(jīng)細(xì)胞的損傷或死亡[19]。 藥物在腦缺血再灌注損傷中起神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制是促進(jìn)抑制炎癥因子的表達(dá)，從而產(chǎn)生抗炎作用。 國(guó)內(nèi)外以往的研究中證實(shí)了NLRP3 炎癥小體在腦缺血再灌注損傷中的介導(dǎo)作用，同時(shí)在腦缺血再灌注的炎癥反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵的角色[20-21]。 因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠CIRI 模型，探究ICA 對(duì)NLRP3 炎癥小體的調(diào)控作用，進(jìn)一步研究其對(duì)CIRI 的影響機(jī)制[22]。

炎癥小體是一種分布于細(xì)胞漿中的復(fù)合物，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)刺激的調(diào)控，以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理狀態(tài)。 目前，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)炎癥小體家族成員，主要分布在NLRs（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors） 家族和 AIM2 （ absentin melanoma 2）家族。 這些家族的成員在感應(yīng)和調(diào)控炎癥反應(yīng)以及維持免疫平衡方面發(fā)揮著重要作用。NLRP3 在NLRs 家族中扮演著關(guān)鍵角色，是當(dāng)前備受關(guān)注的炎癥小體之一。 NLRP3 炎癥小體由NLRP3、ASC 和Caspase-1 前體組合而成的多蛋白復(fù)合物[23]。 這一多蛋白復(fù)合物在炎癥反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)NLRP3 炎癥小體被激活時(shí)，能剪切并活化Caspase-1 前體，生成p20 活性片段，進(jìn)一步催化促炎因子IL-1β 和IL-18 的形成與成熟，促使排放到細(xì)胞外參與炎癥反應(yīng)[23-24]。

本研究旨在深入探討淫羊藿苷對(duì)NLRP3 炎癥小體的調(diào)控作用，以及其在治療大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。 已有研究顯示，在腦缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中，NLRP3 炎癥小體各相關(guān)蛋白以及活化產(chǎn)物的表達(dá)水平均上升[25]，此外，ICA 可以調(diào)控NLRP3 炎癥小體的激活，進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)[26]，也能較好地改善LPS 和IFN-γ 聯(lián)合誘導(dǎo)的MANF 模型細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其抑制神經(jīng)炎癥的作用效果明顯，其作用機(jī)制也與抑制NLRP3 炎癥小體及下游相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)[27]。 本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠存在較嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損，缺血側(cè)大腦皮層病理變化明顯，NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加。 經(jīng)過(guò)ICA 的治療后，大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損和缺血側(cè)大腦皮層病理?yè)p傷可顯著改善，并降低了缺血側(cè)大腦皮層NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白的表達(dá)，這表明ICA 能夠阻斷NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)，改善大鼠神經(jīng)功能缺陷，從而發(fā)揮卒中后的腦保護(hù)作用。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，腦缺血再灌注損傷時(shí)NLRP3 炎癥小體處于被激活狀態(tài)，ICA 能抑制NLRP3 炎癥小體的活化，這可能是其在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)的重要機(jī)制之一。

綜上所述，淫羊藿苷對(duì)腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損癥狀可有效改善，同時(shí)還能減輕大腦皮層神經(jīng)元病理性損傷，其機(jī)制可能與抑制缺血側(cè)大腦皮層中NLRP3 炎癥小體，發(fā)揮抗炎作用有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)炎癥切入，首次證實(shí)淫羊藿苷作用于NLRP3 炎癥小體這一新靶點(diǎn)，發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷。 需要指出的是，本研究?jī)H初步探索其對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側(cè)大腦皮層NLRP3 炎癥小體的影響，作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。 因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將深入研究淫羊藿苷抗神經(jīng)炎癥的機(jī)制，如淫羊藿苷調(diào)控SIRT1／NLRP3 信號(hào)通路減輕大鼠腦缺血再灌注炎癥損傷的機(jī)制，觀察其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞焦亡、自噬的影響。