安慶玲，譚鄧旭，趙亞，張彩勤，師長(zhǎng)宏

（空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032）

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，早診率低、進(jìn)展快、預(yù)后差，患者5 年生存率僅為12%[1-4]。既往首選手術(shù)治療，但僅20%患者可手術(shù)，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高[5]。 很多患者對(duì)放療不敏感，化療易產(chǎn)生耐藥，同樣收效甚微，這可能與胰腺癌致密的基質(zhì)環(huán)境和獨(dú)特的免疫浸潤(rùn)有關(guān)[6-8]。 這些基質(zhì)成分不僅阻滯化療藥物的浸潤(rùn)，還能增加腫瘤細(xì)胞的活性、塑造免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[9-12]。建立穩(wěn)定可靠且能夠模擬胰腺癌患者的腫瘤基質(zhì)與免疫微環(huán)境的藥物臨床前研究動(dòng)物模型[13-15]，對(duì)于研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，探索更加有效的治療方案至關(guān)重要。

目前胰腺癌動(dòng)物模型包括化學(xué)誘導(dǎo)模型、移植瘤模型和基因工程模型。 化學(xué)誘導(dǎo)模型個(gè)體差異大，治療窗口期較短；移植瘤模型缺乏豐富的基質(zhì)環(huán)境和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)；基因工程模型能夠模擬患者胰腺癌的遺傳改變，塑造胰腺癌復(fù)雜的基質(zhì)成分和免疫微環(huán)境，是研究胰腺癌發(fā)生、進(jìn)展，篩選治療策略的理想動(dòng)物模型[16]。LSL-KrasG12D／＋LSLTrp53R172H／＋Pdx1-Cre（KPC）轉(zhuǎn)基因小鼠是研究胰腺癌最常用的自發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其原癌基因LSLKrasG12D／＋在胰腺上特異性活化，抑癌基因LSLTrp53R172H／＋在胰腺被特異性抑制，從而誘導(dǎo)胰腺癌的發(fā)生。 但是，該小鼠模型自發(fā)腫瘤周期長(zhǎng)，腫瘤異質(zhì)性高，成瘤時(shí)間不穩(wěn)定，組內(nèi)腫瘤一致性較差[17-18]。 為了克服KPC 小鼠的缺點(diǎn)，擴(kuò)大其在胰腺癌藥物臨床前研究中的應(yīng)用，嘗試將其自發(fā)性胰腺癌腫瘤組織塊移植到C57BL／6J 小鼠胰尾，完善造模方法和評(píng)價(jià)技術(shù)，從而獲得批量、均一且穩(wěn)定生長(zhǎng)的原位模型，以模擬更加貼合臨床特征的胰腺癌微環(huán)境和穩(wěn)定的胰腺癌進(jìn)展過(guò)程，促進(jìn)胰腺癌發(fā)病機(jī)制、預(yù)防措施和治療方案的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2 只SPF 級(jí)雄性LSL-KrasG12D／＋LSL-Trp53R172H／＋（KP）小鼠、2 只SPF 級(jí)雌性Pdx1-Cre小鼠和66 只SPF 級(jí)雄性C57BL／6J 小鼠，6 ～8 周齡，18 ～22 g，均購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司【SCXK（蘇）2023-0009】，飼養(yǎng)在空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)屏障設(shè)施內(nèi)【SYXK（陜）2019-001】。 環(huán)境溫度23 ～25 ℃，相對(duì)濕度40% ～60%，12 h 晝夜交替，小鼠籠盒、墊料、飼料及飲用水等經(jīng)高溫高壓滅菌處理，動(dòng)物自由攝食和飲水。 本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IACUC-20220830）。

1.1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基、 胎牛血清（Gibco）， DMSO（Sigma，D2650），兔源Ki67 抗體（Abcam，ab16667），鼠源α-SMA 抗體（Servicebio，GB13044），兔源CD45抗體（proteintech，20103-1-AP），鼠源CD206 抗體（proteintech，60143-1-lg），Cy3 標(biāo)記山羊抗兔IgG（GB21303-100UL）， Cy3 標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG（GB21301-100UL），DAPI（Leagene，DA002），甘油明膠（Solarbio， S2150）。 彩色多普勒超聲系統(tǒng)（Mindray，ZS3 SCI），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，BX43）用于HE 染色拍攝，Image J 1.8.0 軟件進(jìn)行半定量分析，激光掃描共聚焦顯微鏡（ZEISS，LSM 900）用于免疫熒光染色拍攝和分析。

1.2 方法

1.2.1 原位模型構(gòu)建以及腫瘤組織的凍存與復(fù)蘇

將KP 小鼠與Pdx1-Cre小鼠合籠進(jìn)行交配，新生的小鼠經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因篩選得到KPC 小鼠。 選擇自發(fā)胰腺癌的KPC 小鼠作為移植供體，于狀態(tài)明顯較差、臨近仁慈終點(diǎn)的時(shí)候進(jìn)行安樂死，在無(wú)菌條件下取出胰腺原發(fā)腫瘤，該腫瘤組織為P0 代（Passage 0）。 將P0 代原發(fā)胰腺癌組織快速轉(zhuǎn)移至4 ℃的DMEM 培養(yǎng)液中，去除壞死部分，選擇質(zhì)地均勻的腫瘤部分修剪成2 mm × 2 mm× 2 mm 大小一致的組織塊，用于后續(xù)移植或凍存。將10 只6 ～8 周齡的C57BL／6J 小鼠作為移植受體，用戊巴比妥鈉按照30 mg／kg 劑量進(jìn)行麻醉，左側(cè)腹部剃毛后，采用無(wú)菌操作進(jìn)行手術(shù)，用縫合線將胰腺癌組織塊縫合到胰尾，術(shù)后將小鼠放置37 ℃保溫毯上直至蘇醒。 將剩余部分P0 代腫瘤組織塊置入含有90%胎牛血清與10% DMSO 的1.5 mL 凍存管內(nèi)，梯度降溫后液氮保存。 復(fù)蘇時(shí)，從液氮拿出凍存管迅速置于37 ℃水浴鍋中復(fù)溫，DMEM培養(yǎng)液清洗腫瘤組織去掉殘留凍存液后將組織塊移植于36 只C57BL／6J 小鼠的胰尾，驗(yàn)證腫瘤復(fù)蘇成功率。

1.2.2 超聲監(jiān)測(cè)

手術(shù)完成后，每2 ～3 d 用彩色多普勒超聲對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，于腫瘤體積800 ～1000 mm3結(jié)束觀察并對(duì)其進(jìn)行安樂死，收集胰腺腫瘤、腸、腹膜、脾、腎、肝和肺置于4%多聚甲醛中性固定液中，石蠟包埋后切片。

1.2.3 HE 染色

石蠟切片二甲苯脫蠟，100%、90%、80%、70%乙醇各5 min 覆水，蘇木精染色5 min，乙酸分化2 s，促藍(lán)液返藍(lán)1 min，伊紅染色5 min，70% ～95%梯度乙醇脫水各5 min，浸泡二甲苯后用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 免疫熒光染色

石蠟切片二甲苯脫蠟，100%、90%、80%、70%乙醇各5 min 覆水，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，2%BSA 封閉非特異性抗原表位1 h，4 ℃過(guò)夜孵育一抗，次日常溫避光孵育熒光標(biāo)記的二抗2 h，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核10 min，甘油明膠封片，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行圖片制作，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異性分析，用Tukey’s 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，生存率用Log-rank test 檢驗(yàn)比較與無(wú)癥狀小鼠的指標(biāo)差異，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KPC 小鼠自發(fā)胰腺癌情況

將KP 小鼠與Pdx1-Cre小鼠合籠進(jìn)行交配，新生的小鼠經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因篩選得到24只KPC 小鼠（圖1A）。 在飼養(yǎng)過(guò)程中密切關(guān)注KPC小鼠的狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)體重下降、行動(dòng)遲緩、精神萎靡或者腹部異常腫大時(shí)，通過(guò)體外無(wú)創(chuàng)超聲監(jiān)測(cè)技術(shù)觀察其自發(fā)胰腺癌的情況（圖1B）。 KPC 小鼠體重下降10%或者自發(fā)腫瘤體積達(dá)到800 ～1000 mm3，判斷為仁慈終點(diǎn)，通過(guò)解剖再次確認(rèn)KPC 小鼠自發(fā)胰腺癌的情況，其中4 只（16.66%）KPC 小鼠自發(fā)胰腺癌，平均壽命124.5 d；10 只（41.67%）KPC 小鼠自發(fā)皮下肉瘤，多發(fā)生在四肢，由于肉瘤發(fā)生較早，進(jìn)展迅速，腫瘤負(fù)荷比較大，這類小鼠生存期最短，平均壽命92.5 d；其余10 只（41.67%）KPC 小鼠沒有觀察到明確的自發(fā)胰腺腫瘤和皮下肉瘤，平均壽命169.9 d（圖1C ～1E）。 KPC 小鼠自發(fā)胰腺癌組織的HE 染色結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞呈無(wú)序排列，具有中等分化的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)，間質(zhì)成分豐富，富含膠原蛋白和各種免疫細(xì)胞。

2.2 組織塊原位移植瘤模型構(gòu)建

選擇C57BL／6J 小鼠作為移植受體，將KPC 小鼠自發(fā)胰腺癌組織塊移植到受體小鼠的胰尾，具體操作同方法“1.2.1”（圖2A，2B）。 移植后，觀察2～3 周，并通過(guò)體外無(wú)創(chuàng)超聲技術(shù)監(jiān)測(cè)移植腫瘤的生長(zhǎng)速度（圖2C），繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，移植術(shù)后6 d 瘤體增長(zhǎng)速度明顯加快。 KPC1 在移植17 d 時(shí)，瘤體體積在（621.4 ± 180.9）mm3，KPC2 在移植13 d 時(shí)，瘤體體積在（744.9 ± 107.1）mm3，KPC3 在移植13 d 時(shí)，瘤體體積在（800.6 ± 142.9）mm3（圖2D）。 表明這種方法構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠源性胰腺癌組織塊原位移植瘤具有穩(wěn)定增殖能力。將凍存復(fù)蘇后的腫瘤組織塊移植于36 只C57BL／6J小鼠胰尾，其中35 只小鼠成功生長(zhǎng)胰腺癌，腫瘤組織塊凍存后復(fù)蘇成功率高達(dá)97.22%。

2.3 模型評(píng)價(jià)

2.3.1 模型病理學(xué)特征穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)

腫瘤傳代的病理學(xué)穩(wěn)定性對(duì)于腫瘤研究具有重要意義，是評(píng)價(jià)腫瘤模型可靠性和可重復(fù)性的關(guān)鍵因素。 為驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因小鼠源性胰腺癌組織塊原位移植瘤的移植穩(wěn)定性，將其進(jìn)行傳代移植，在連續(xù)傳代4 次后，取正常胰腺、P0 代原發(fā)胰腺癌組織和不同傳代次數(shù)的原位移植瘤組織進(jìn)行HE 染色，結(jié)果顯示傳代4 次后，KPC 小鼠P4 代原位移植瘤組織仍能保持其導(dǎo)管樣腺體瘤形態(tài)，間質(zhì)成分豐富，與P0 代原發(fā)胰腺癌組織形態(tài)一致，說(shuō)明該模型能穩(wěn)定地保留原發(fā)胰腺癌病理學(xué)特征（圖3A）。

2.3.2 模型微環(huán)境相似性的評(píng)價(jià)

胰腺癌擁有復(fù)雜的微環(huán)境，包括致密的基質(zhì)環(huán)境和獨(dú)特的免疫浸潤(rùn)情況。 為了驗(yàn)證該模型的基質(zhì)和免疫浸潤(rùn)情況，選擇傳代4 次的P4 代原位移植瘤組織和P0 代原發(fā)胰腺癌組織及正常胰腺組織進(jìn)行對(duì)比。 首先，采用Ki67 和α-SMA 分別作為腫瘤增殖和基質(zhì)纖維化的指標(biāo)，通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)分析其基質(zhì)情況。 結(jié)果顯示，第4 代原位移植瘤組織的增殖和纖維化程度相較于正常胰腺組織均明顯升高，原位移植瘤組織的增殖和纖維化程度相較于KPC P0 代自發(fā)原位胰腺癌組織也有升高，Ki67陽(yáng)性面積分別為（2.7500 ± 0.0841）%vs.（1.2730± 0.1652）%，α-SMA 陽(yáng)性面積分別為（3.3110 ±0.3585）%vs.（2.2000 ± 0.1394）%，這說(shuō)明原位移植瘤傳代保持病理學(xué)特征的同時(shí)，還可以將其增殖能力和間質(zhì)特征擴(kuò)大（圖3B）。 免疫熒光結(jié)果表明，正常胰腺組織、P0 代原發(fā)胰腺癌組織、第4 代原位移植瘤組織，均可發(fā)現(xiàn)不同程度的CD45 陽(yáng)性免疫細(xì)胞和CD206 陽(yáng)性免疫抑制細(xì)胞浸潤(rùn)，且與正常胰腺組織相比，P0 代原發(fā)胰腺癌和第4 代原位移植瘤組織的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量更多（圖3C）。 這說(shuō)明該模型既能模擬胰腺癌的進(jìn)展過(guò)程，也能真實(shí)地反映基質(zhì)和免疫系統(tǒng)在胰腺癌進(jìn)展過(guò)程中的作用。

2.3.3 模型腫瘤轉(zhuǎn)移能力的評(píng)價(jià)

轉(zhuǎn)移的發(fā)生一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，是腫瘤治療失敗和預(yù)后惡化的主要原因之一，構(gòu)建具有腫瘤轉(zhuǎn)移能力的藥物臨床前研究的動(dòng)物模型對(duì)于揭示腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制和患者預(yù)后至關(guān)重要。 本研究構(gòu)建的模型在仁慈終點(diǎn)還發(fā)生了廣泛的侵襲轉(zhuǎn)移，可以直接在腹膜、脾和腸道觀察到腫瘤包塊（圖4A）。HE 染色及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，該原位胰腺癌模型96.67%發(fā)生腸轉(zhuǎn)移，93.33%發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，76.67%發(fā)生脾轉(zhuǎn)移，20%發(fā)生肺轉(zhuǎn)移（圖4B）。 另外，雖然腎和肝沒有發(fā)生明顯的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移病灶，但是觀察到腎小球數(shù)量增多、體積增大，少數(shù)肝細(xì)胞發(fā)生壞死，凋亡小體增多（圖4C）。 因此，該模型可以作為研究胰腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及預(yù)防治療方案的藥物臨床前研究的動(dòng)物模型。

3 討論

胰腺癌基因工程小鼠模型能夠反應(yīng)胰腺癌患者遺傳物質(zhì)變化情況，完整地模擬了胰腺癌的發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程，富含豐富的腫瘤基質(zhì)成分和免疫微環(huán)境，是研究胰腺癌最理想的動(dòng)物模型[19]。 但是其造模周期長(zhǎng)，胰腺癌自發(fā)時(shí)間不能預(yù)測(cè)，發(fā)生比例低，且不同個(gè)體自發(fā)的胰腺癌異質(zhì)性強(qiáng)，同一時(shí)期獲得足夠?qū)嶒?yàn)的動(dòng)物數(shù)量需要很多時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，從而限制了應(yīng)用[20]。

在自發(fā)胰腺癌KPC 小鼠的基礎(chǔ)上，將腫瘤組織去除壞死部分，選擇質(zhì)地均勻的腫瘤部分修剪成大小一致的組織塊，移植到野生的C57BL／6J 小鼠的胰尾，構(gòu)建了基于KPC 自發(fā)胰腺癌腫瘤的原位移植瘤模型。 選擇Ki67 作為腫瘤增殖指標(biāo)，α-SMA 作為纖維化指標(biāo)，評(píng)價(jià)胰腺癌的基質(zhì)情況；CD45 作為免疫細(xì)胞標(biāo)志物，CD206 作為免疫抑制細(xì)胞標(biāo)記物，評(píng)價(jià)胰腺癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況[21-22]。 通過(guò)免疫熒光染色分析，該模型能夠穩(wěn)定的模擬并且遺傳胰腺癌的導(dǎo)管腺瘤形態(tài)，具有良好的增殖能力，擁有與患者相似的纖維環(huán)境和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。 采用這種造模方式可以快速、大規(guī)模的進(jìn)行胰腺癌相關(guān)研究。 為防止體內(nèi)連續(xù)傳代導(dǎo)致腫瘤生物學(xué)特征發(fā)生變化，選擇將低代次（P0、P1 代）的腫瘤組織進(jìn)行冷凍保存，復(fù)蘇后原位移植成功率高達(dá)97.22%。除此之外，發(fā)現(xiàn)該模型中，胰腺癌能夠轉(zhuǎn)移到腸、腹膜等多器官，這與臨床上胰腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位和病理特征相似，所以可以作為研究胰腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的優(yōu)質(zhì)模型。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要有效的技術(shù)手段監(jiān)測(cè)原位腫瘤的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)情況。 在本研究主要用到腹部超聲動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了該模型的生長(zhǎng)情況并繪制了腫瘤生長(zhǎng)曲線。 超聲波技術(shù)是一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射的方法，可以用來(lái)檢測(cè)胰腺腫塊，并評(píng)估其性質(zhì)（囊實(shí)性、實(shí)質(zhì)性）[23]。 為了獲取清晰可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在進(jìn)行超聲檢查之前，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行隔夜禁食，以減少胃腸蠕動(dòng)對(duì)胰腺的干擾。 次日將造模小鼠呈仰臥位放置，沿腹主動(dòng)脈橫切掃查，以脾和腎的解剖位置輔助判斷胰腺的大體位置，彩色多普勒成像顯示血流，少血供、低回聲區(qū)域即為胰腺腫瘤區(qū)域，通過(guò)計(jì)算獲取胰腺腫瘤的體積大小。 盡管胰腺腫瘤超聲檢查的敏感性高度依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)和疾病進(jìn)展的程度，但其檢查結(jié)果比較準(zhǔn)確，能夠作為胰腺腫瘤原位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的影像診斷工具[24]。

構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠源性胰腺癌組織塊原位移植瘤模型的優(yōu)勢(shì)在于其易于操作、成本相對(duì)較低，且腫瘤與人胰腺癌具有較高的生物相似性。 此外，這種模型可以更好地模擬腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)和發(fā)展的過(guò)程，并為新藥物的篩選提供可靠的動(dòng)物模型[25]。然而，該模型也存在一些限制。 首先，該模型仍然是以小鼠作為宿主，而并非完全模擬人類的生理環(huán)境。 其次，這種模型對(duì)于特定基因突變類型的胰腺癌可能并不適用，因?yàn)椴煌幕蛲蛔兛赡墚a(chǎn)生不同的生物學(xué)行為和病理學(xué)特征[26-27]。

綜上所述，轉(zhuǎn)基因小鼠源性胰腺癌組織塊原位移植瘤模型是一種可行的模型，可以用于研究胰腺癌的發(fā)生機(jī)制和治療方法的評(píng)估。 通過(guò)對(duì)模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)，可以更好地了解胰腺癌的發(fā)展過(guò)程，并為治療策略的研究提供有效的平臺(tái)。