劉 靜,翟 冰,徐 濤,黃小麗,劉 棟,胡發(fā)文*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 分析測試中心,山東 青島,266109;2.山東省海洋科學(xué)研究院,山東 青島 266104;3.青島市淺海底棲漁業(yè)增殖重點實驗室,山東 青島 266104)

引 言

雙殼貝類的免疫系統(tǒng)無免疫球蛋白,屬非特異性免疫,其免疫系統(tǒng)主要由血細(xì)胞免疫和體液免疫兩部分組成,其中血細(xì)胞不僅可以通過吞噬、凝集和包囊等作用清除異物,進(jìn)行傷口和外殼修復(fù)、營養(yǎng)消化和運輸,還可以向血淋巴釋放免疫因子,如溶菌酶、活性氧、抗菌肽等參與機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)[1-4]。因此,血細(xì)胞既是貝類細(xì)胞免疫的承擔(dān)者,也是體液免疫的提供者,在免疫防御中發(fā)揮著核心作用[5]。

菲律賓蛤仔隸屬于雙殼綱(Bivalvia)、簾蛤科(Veneridae)、蛤仔屬(Ruditapes),是我國海水養(yǎng)殖中較為重要的經(jīng)濟(jì)貝類。菲律賓蛤仔的細(xì)胞免疫是免疫防御的第一道防線,主要靠血細(xì)胞的吞噬作用來完成[6],因此對血細(xì)胞吞噬的研究是探討貝類免疫防御機(jī)制的必要條件和重要基礎(chǔ)。目前關(guān)于菲律賓蛤仔血細(xì)胞吞噬功能的研究還較少[5, 7-8],并且在研究貝類血細(xì)胞吞噬功能時,吞噬物選擇熒光微球[5, 8-9]和酵母菌較多[7, 10-11],尚未見有關(guān)菲律賓蛤仔對鰻弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌吞噬作用的報道,鰻弧菌是貝類的致病菌,大腸桿菌是革蘭氏陰性菌的代表,金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌的代表,故本文利用光鏡和電鏡相結(jié)合的技術(shù)研究了菲律賓蛤仔血細(xì)胞對三種菌的吞噬率、吞噬細(xì)菌的過程及血細(xì)胞吞噬菌后的超微結(jié)構(gòu)變化,同時利用掃描電鏡和透射電鏡研究了三種菌的形態(tài)結(jié)構(gòu),為分析菲律賓蛤仔對三種菌吞噬作用的差異提供理論依據(jù),研究結(jié)果將為菲律賓蛤仔細(xì)胞免疫的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菲律賓蛤仔購自青島城陽水產(chǎn)品批發(fā)市場,殼長(4±0.32)cm,殼高(2.70±0.14)cm,體質(zhì)量(10.8±2.41)g。買回的實驗蛤仔暫養(yǎng)于塑料水箱中,水溫保持在16 ℃左右,每天早晚各換新鮮海水1次,暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗菌株的準(zhǔn)備

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌來自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心。鰻弧菌用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng),大腸桿菌和金黃色葡萄球菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌體用無菌磷酸緩沖液PBS(NaCl 28 g/L、KH2PO40.2 g/L、KCl 0.2 g/L、Na2HPO412H2O 2.9 g/L,pH=7.4)從培養(yǎng)基上分離下來,并用PBS將菌懸液的濃度調(diào)整為108個/mL。一部分菌液用來研究血細(xì)胞的吞噬作用,另一部分菌液利用掃描電鏡和透射電鏡觀察三種菌的形貌結(jié)構(gòu)。

1.2.2 血細(xì)胞的抽取與制備

選取健康有活力的菲律賓蛤仔,無菌海水沖洗干凈后,用濾紙擦干菲律賓蛤仔,用1 mL的無菌注射器預(yù)先吸入一定量預(yù)冷無菌抗凝劑(葡萄糖20.8 g/L、EDTA 5.845 g/L、NaCl 20 g/L、Tris-HCl 0.05 mol/L,pH=7.4)[12],再從菲律賓蛤仔閉殼肌處1∶1抽取血淋巴,每個試驗組抽取4只菲律賓蛤仔的血淋巴,迅速混勻,采用無菌PBS緩沖液(pH = 7.4)調(diào)整血細(xì)胞濃度為106個/mL。

1.2.3 瑞士—吉姆薩染色法觀察菲律賓蛤仔血細(xì)胞的吞噬作用

將血細(xì)胞懸液與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌懸液等比例加到無菌的離心管中,置于濕盒中室溫孵育30 min,移至冰上靜止15 min,終止血細(xì)胞的吞噬作用。取50 μL菲律賓蛤仔血細(xì)胞和細(xì)菌的混合液置于載玻片上,制成血涂片,室溫干燥2 min,甲醇固定3 min,滴加瑞式—姬姆薩染液2～3滴覆蓋整個血涂片,染1 min,滴加等量的0.01 M磷酸緩沖液(pH 6.4～6.8)分色5 min,之后用中性水沖洗載玻片,待血涂片干燥后,在光學(xué)顯微鏡(Leica DM500)下隨機(jī)觀察100個血細(xì)胞,每種菌的吞噬實驗設(shè)置3個平行組,每個平行組制作2張血涂片,血細(xì)胞的吞噬率按照下列公式計算:

吞噬率(%)=吞噬細(xì)菌的血細(xì)胞/觀察的血細(xì)胞×100%

1.2.4 三種菌掃描電鏡觀察

將上述制備的菌液,3 000 r/min離心(4 ℃)10 min,棄上清液,加2.5%的戊二醛4 ℃冰箱過夜,將固定后的菌液滴到8 mm圓形載玻片上,4 ℃下自然沉淀1 h,將蓋玻片分別放置于體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中梯度脫水10 min,叔丁醇:乙醇1:1脫水10 min,純叔丁醇脫水兩次,每次10 min,然后放于-20 ℃冰箱中30 min,最后真空干燥3 h,離子濺射儀噴金后,掃描電鏡(日本電子7500F)下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.5 三種菌透射電鏡觀察

將上述制備的菌液,3 000 r/min離心(4℃)10 min,棄上清液,菌液沉淀加入2.5%的戊二醛4 ℃冰箱固定過夜,0.1 M二甲胂酸鈉緩沖液清洗6次,每次15 min,1%的鋨酸固定2 h,0.1 M的二甲胂酸鈉緩沖液清洗3次后,進(jìn)行乙醇梯度脫水,Spi-pon812環(huán)氧樹脂滲透、包埋和聚合,超薄切片機(jī)(Leica UC7)切成70 nm的薄片,經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后,透射電鏡(日立HT7700)下觀察并拍照,加速電壓80 kV。

1.2.6 透射電鏡觀察菲律賓蛤仔血細(xì)胞的吞噬作用

將血細(xì)胞懸液與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌懸液等比例加到無菌的離心管中,置于濕盒中室溫孵育30 min,3 000 r/min離心10 min,去掉上清液后,加入1 mL醛類固定液(2%多聚甲醛—2.5%戊二醛,2% NaCl,2 mmol/L CaCl2, pH=7.4),室溫下固定2 h,后續(xù)透射電鏡制樣步驟與觀察同1.2.5。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

血細(xì)胞吞噬率以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SPSS 20.0軟件,并采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計分析,以P<0.05作為顯著差異性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔血細(xì)胞對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌的吞噬作用

實驗結(jié)果表明菲律賓蛤仔血細(xì)胞對三種細(xì)菌均具有吞噬作用,其中血細(xì)胞對大腸桿菌的吞噬率最高(38.7%),其次為金黃色葡萄球菌(30%),對鰻弧菌的吞噬率最低(24.4%);并且菲律賓蛤仔血細(xì)胞對三種菌的吞噬率具有顯著性差異(P<0.05)(圖1)。

圖1 菲律賓蛤仔血細(xì)胞對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌的吞噬率

2.2 掃描電鏡和透射電鏡觀察大腸桿菌、鰻弧菌和金黃色葡萄球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)

掃描電鏡下可見大腸桿菌呈桿狀,兩端呈鈍圓形,表面不光滑,長為1.0～2.4 μm,寬0.5～0.7 μm,平均1.6×0.6 μm(圖2 a);鰻弧菌呈弧狀,有一根細(xì)長的極生單鞭毛,菌體長1.0～2.1 μm,寬0.5～1.1 μm,鞭毛直徑27.2～37.6 nm,長可達(dá)3.5～5.7 μm, 菌體平均1.3×0.7 μm,鞭毛平均4.5 μm(圖2b);金黃色葡萄球菌表面光滑、圓潤,呈球狀,直徑0.8～1.3 μm,菌體間界限分明,排列呈葡萄串狀,菌體平均1.3×1.1 μm(圖2c)。

圖2 掃描電鏡和透射電鏡下大腸桿菌、鰻弧菌和金黃色葡萄球菌形貌結(jié)構(gòu)

透射電鏡下,由于超薄切片切割角度不同,大腸桿菌呈現(xiàn)出桿狀、橢圓或圓形的切面,細(xì)胞壁厚度適中(圖2d);鰻弧菌切面呈弧狀、橢圓狀或圓狀,細(xì)胞壁較薄,擬核明顯,在超薄切片中能看到被切斷的鞭毛(圖2e),金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞壁較厚,菌體飽滿,邊緣清晰,單個或團(tuán)聚存在(圖2f)。

2.3 透射電鏡觀察菲律賓蛤仔血細(xì)胞對大腸桿菌的吞噬作用

在某些特定環(huán)境下,細(xì)胞表面會生出一些無定型細(xì)胞質(zhì)凸起,呈現(xiàn)絲狀或片狀,分別稱之為絲狀偽足和片狀偽足,細(xì)胞可隨偽足伸出的方向移動,或以偽足為觸手,接觸并粘附外源物[13]。

透射電鏡下觀察菲律賓蛤仔對大腸桿菌的吞噬作用,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞完整,細(xì)胞質(zhì)豐富,一個血細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)一個或多個被吞噬的大腸桿菌;血細(xì)胞可以伸出絲狀偽足粘附、包裹大腸桿菌(圖3a-c),血細(xì)胞伸出的一根絲狀偽足上可以粘附、包裹一個大腸桿菌(圖3a),也可以粘附、包裹多個大腸桿菌(圖3b),一個血細(xì)胞可以同時伸出多條絲狀偽足粘附大腸桿菌(圖3c);血細(xì)胞還可以伸出片狀偽足進(jìn)行粘附和包裹(圖3d-e),血細(xì)胞伸出的片狀偽足可以包裹一個大腸桿菌(圖3d),也可以同時包裹多個大腸桿菌(圖3e);圖3f顯示了大腸桿菌被細(xì)胞吞噬的過程,e4為剛被血細(xì)胞粘附的大腸桿菌,e5為被血細(xì)胞吞噬一半的大腸桿菌,e6為被血細(xì)胞完全吞噬的大腸桿菌;被吞噬的大腸桿菌可被血細(xì)胞消化,圖3a和3e中e7為被血細(xì)胞消化的大腸桿菌殘體。

圖3 透射電鏡下觀察菲律賓蛤仔血細(xì)胞對大腸桿菌的吞噬作用

2.4 透射電鏡觀察菲律賓蛤仔血細(xì)胞對金黃色葡萄球菌的吞噬作用

透射電鏡下觀察菲律賓蛤仔對金黃色葡萄球菌的吞噬作用,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞完整,細(xì)胞質(zhì)豐富,一個血細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)一個或多個被吞噬的金黃色葡萄球菌;一個細(xì)胞可以伸出多根絲狀偽足粘附、包裹金黃色葡萄球菌(圖4a),一根絲狀偽足上可以粘附、包裹多個金黃色葡萄球菌(圖4b);血細(xì)胞還可以伸出片狀偽足(圖4c,s4)或者血細(xì)胞膜直接粘附金黃色葡萄球菌(圖4c,s3);被絲狀偽足、片狀偽足粘附或直接粘附在血細(xì)胞膜上的金黃色葡萄球菌逐漸會被吞噬到細(xì)胞內(nèi),s5為尚未完全被血細(xì)胞吞噬的金黃色葡萄球菌(圖4d),s6-s8為被血細(xì)胞完全吞噬的金黃色葡萄球菌,s6為剛進(jìn)入血細(xì)胞,尚未和溶酶體結(jié)合的細(xì)菌(圖4e),s7為被溶酶體融合但尚未消化的細(xì)菌(圖4e,4f),s8為被血細(xì)胞消化的金黃色葡萄球菌殘體(圖4f)。

圖4 透射電鏡下觀察菲律賓蛤仔血細(xì)胞對金黃色葡萄球菌的吞噬作用

2.5 透射電鏡觀察菲律賓蛤仔血細(xì)胞對鰻弧菌吞噬作用

透射電鏡下觀察菲律賓蛤仔對鰻弧菌的吞噬作用,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞和鰻弧菌孵育后,血細(xì)胞變得細(xì)長,細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)丟失嚴(yán)重,細(xì)胞空白化(圖5a);血細(xì)胞可以伸出絲狀偽足粘附鰻弧菌,血細(xì)胞細(xì)胞核染色體凝集邊聚化,細(xì)胞內(nèi)形成自噬體,胞內(nèi)高爾基體部分消融,變得模糊不清(圖5b);透射電鏡下較難找到吞噬了鰻弧菌的血細(xì)胞,吞噬鰻弧菌的血細(xì)胞同樣出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)邊聚化,細(xì)胞空白化現(xiàn)象(圖5c);有的血細(xì)胞細(xì)胞膜已經(jīng)出現(xiàn)破裂(圖5d),甚至完全破裂解體(圖5e),解體的血細(xì)胞殘體中含有大量杯狀自噬體和包裹了細(xì)胞器的自噬體(圖5f)。

圖5 透射電鏡下觀察菲律賓蛤仔血細(xì)胞對鰻弧菌的吞噬作用

3 討論

3.1 菲律賓蛤仔血細(xì)胞對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌吞噬率的差異性

貝類血細(xì)胞的吞噬作用是一種重要的免疫防御機(jī)制,血細(xì)胞能吞噬入侵機(jī)體的異物和病原體,還能清除自身損傷或死亡的細(xì)胞[7],故血細(xì)胞吞噬率是衡量機(jī)體健康狀況及在環(huán)境或病原脅迫下的免疫防御能力的一個重要指標(biāo),在貝類免疫系統(tǒng)中扮演著極其重要的角色[8, 11, 14-17]。

研究發(fā)現(xiàn)不同貝類血細(xì)胞的吞噬率存在差異,同種貝類血細(xì)胞的吞噬率也不盡相同,如韓卓然等[18]發(fā)現(xiàn)毛蚶(Scapharcasubcrenata)血細(xì)胞對酵母聚糖的吞噬率跟孵育溫度有關(guān)系,李進(jìn)壽等[19]發(fā)現(xiàn)雜色鮑(Haliotisdiversicolor)血細(xì)胞的吞噬率與血細(xì)胞和吞噬物的比例有關(guān)。本文發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔血細(xì)胞對三種菌的最大吞噬率僅為38.7%,而在相同孵育條件下,菲律賓蛤仔對1 μm熒光微球的吞噬率可達(dá)45.1%[5],作者推測相同貝類血細(xì)胞吞噬率的差異可能跟吞噬物的種類、大小以及孵育條件有關(guān)。

大腸桿菌、鰻弧菌屬于革蘭氏陰性菌,金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌,本文發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔血細(xì)胞對這三種菌均有吞噬能力,說明菲律賓蛤仔血細(xì)胞對革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌均有吞噬能力,這與孫虎山等[20]發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝血細(xì)胞對革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌均有吞噬能力的結(jié)論類似。菲律賓蛤仔血細(xì)胞對三種菌的吞噬能力表現(xiàn)為大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>鰻弧菌,作者認(rèn)為可能有以下原因:1)雖然金黃色葡萄球菌和鰻弧菌的平均菌體大小小于大腸桿菌,但大腸桿菌不易聚集,一般以單個菌體出現(xiàn),而金黃色葡萄球菌往往多個菌體聚在一起呈葡萄狀,大大增加了菌體體積,而鰻弧菌有長達(dá)5.7 μm的鞭毛,導(dǎo)致血細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌和鰻弧菌相對大腸桿菌困難;2)鰻弧菌是貝類的致病菌[21-22],透射電鏡下發(fā)現(xiàn),菲律賓蛤仔血細(xì)胞吞噬大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后,超微結(jié)構(gòu)無明顯損傷,但吞噬鰻弧菌后,血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯損傷,細(xì)胞發(fā)生凋亡、細(xì)胞膜破裂或者血細(xì)胞直接解體,這導(dǎo)致血細(xì)胞的免疫功能大大下降,這也是導(dǎo)致血細(xì)胞對鰻弧菌的吞噬作用小于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的一個重要原因。

目前鰻弧菌的致病機(jī)理尚不完全清楚,但研究發(fā)現(xiàn)鰻弧菌的毒力與其外膜蛋白,胞外產(chǎn)物(如溶血素,蛋白酶)以及鞭毛上的鞭絲蛋白基因等相關(guān)[23]。鰻弧菌對貝類的致病機(jī)理研究較少,劉小莉等[24]研究發(fā)現(xiàn)鰻弧菌能引起菲律賓蛤仔組織的低滲脅迫,這也可能是本研究中鰻弧菌導(dǎo)致血細(xì)胞凋亡、膜破裂或解體的原因,其具體的損傷機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3.2 菲律賓蛤仔血細(xì)胞對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌的吞噬過程

貝類血細(xì)胞的吞噬作用涉及復(fù)雜的細(xì)胞行為及多種生化反應(yīng),血細(xì)胞吞噬過程包括趨化、粘附、內(nèi)吞和降解消化幾個重要步驟[25]。Schmid等[26]發(fā)現(xiàn)了田螺(Viviparusmalleatus)血細(xì)胞可以被金黃色葡萄球菌以及細(xì)菌胞壁物質(zhì)N-乙酰葡糖胺吸引,朱澤聞等[27]發(fā)現(xiàn)泥蚶(Tegillarcagranosa)血細(xì)胞對酵母聚糖和細(xì)菌有較強(qiáng)粘附能力,本文透射電鏡下也發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔血細(xì)胞對三種菌均具有趨化、粘附作用,血細(xì)胞主要通過伸出絲狀偽足和片狀偽足對細(xì)菌進(jìn)行包裹,血細(xì)胞可以伸出一根或多根絲狀偽足,一根絲狀偽足可以對一個或多個細(xì)菌進(jìn)行粘附、包裹,血細(xì)胞伸出的片狀偽足也可以對一個或多個細(xì)菌進(jìn)行粘附、包裹,絲狀偽足或片狀偽足相接觸后細(xì)胞膜融合,形成吞噬小體進(jìn)入細(xì)胞;血細(xì)胞除了伸出偽足外,還可以局部細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成內(nèi)吞小體,將細(xì)菌吞噬到血細(xì)胞內(nèi),Cajaraville等[28]亦發(fā)現(xiàn)貽貝(Mytilusgalloprovincialis)血細(xì)胞可以由局部細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成有衣被或無衣被的內(nèi)吞小體,從而完成內(nèi)吞。

病原體被血細(xì)胞吞噬后,一方面細(xì)胞內(nèi)的水解酶可與病原體融合,逐步將其水解消化,也可以通過伴隨吞噬作用的呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的多種活性氧中間體來殺傷病原微生物[29],作者在透射電鏡下亦觀察到菲律賓蛤仔血細(xì)胞中存在大量被吞噬的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及被消化的殘體。

4 結(jié)論

綜上所述,菲律賓蛤仔血細(xì)胞對革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌均具有吞噬能力,血細(xì)胞可以通過絲狀偽足、片狀偽足或細(xì)胞膜內(nèi)陷的方式對細(xì)菌進(jìn)行粘附、內(nèi)吞;伴隨著水解酶的參與以及活性氧的產(chǎn)生共同殺傷、消滅吞噬到血細(xì)胞中的細(xì)菌。菲律賓蛤仔血細(xì)胞對三種菌的吞噬能力的差異跟三種細(xì)菌的大小、易聚集程度、致病性有關(guān)系,關(guān)于鰻弧菌對血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷及其致凋亡、致死的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。