劉肖蓮,郝 爽,李 楠,宋立民,楊 峻,馬 林,戴媛媛,吳會民

( 天津市水產(chǎn)研究所,天津 300221)

引 言

鯉(Cyprinuscarpio)是我國一種重要的經(jīng)濟魚類,廣泛分布于長江、黃河、黑龍江等淡水水體中。州河鯉為僅分布于天津市薊州區(qū)于橋水庫的野生鯉,水庫特殊的地理地貌和優(yōu)越的水源環(huán)境使州河鯉形成了頭小、后緣背部無明顯隆起的獨特外形和肉質(zhì)緊實、咀嚼滑韌的口感,被稱為金翅鯉、御膳鯉[1]。由于受水域污染、過度捕撈等人類活動影響,州河鯉種群資源量持續(xù)減少;同時庫區(qū)周邊池養(yǎng)鯉魚隨洪水潛入庫內(nèi)以及違法放生活動,使州河鯉種質(zhì)純度受到一定程度破壞[2]。通過分子標記對州河鯉種質(zhì)資源進行評估,制定合理的選育計劃,可以在生產(chǎn)上指導(dǎo)州河鯉的提純復(fù)壯工作,有效的進行種質(zhì)資源的保護與利用。

微衛(wèi)星分子標記作為第二代遺傳標記,與其他標記相比,具有多態(tài)性高、共顯性、可穩(wěn)定遺傳、重復(fù)性好等優(yōu)點,目前已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的遺傳多樣性分析、增殖放流效果評估、親子鑒定、指導(dǎo)親本選配等方面[3-5]。白云等[6]對州河鯉等5種類型鯉魚線粒體D-loop區(qū)及鄰近區(qū)段進行測序發(fā)現(xiàn),州河鯉的核苷酸多樣性指數(shù)明顯小于其他4種類型鯉魚,遺傳多樣性水平較低。而目前尚未有基于核基因分子標記對州河鯉進行遺傳多樣性分析的相關(guān)報道。本研究以微衛(wèi)星標記為技術(shù)手段,對州河鯉、潮白河群體以及人工選育品種“福瑞鯉2號”進行遺傳多樣性評估,以期為鯉的種質(zhì)資源保護以及新品種創(chuàng)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

共采集2個野生鯉群體和1個選育群體,其中野生群體為州河鯉39尾,潮白河40尾,選育群體為中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心選育的福瑞鯉2號40尾。剪取尾鰭保存于100%無水乙醇中保存?zhèn)溆谩２捎煤Ｑ髣游锝M織基因組DNA提取試劑盒進行基因組提取,用Nanodrop紫外分光光度計測量DNA濃度,并稀釋至100 μg/mL作為工作液。

1.2 PCR擴增與檢測

試驗所用微衛(wèi)星標記 為文獻[7-8]報道的部分引物。微衛(wèi)星引物5’端用FAM或HEX熒光染料進行修飾,并由生工生物工程(上海) 有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(總20 μL)為:2×Taq PCR Master Mix 10 μL、正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL、DNA模板100 ng、無菌水補足體積至20 μL。PCR反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸45 s,此過程循環(huán)35次;72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)有限公司進行毛細管凝膠電泳,利用GeneMapper 4.0 軟件讀取微衛(wèi)星位點的等位基因條帶大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Popgene1.32計算各個群體的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)以及Nei’s遺傳距離。利用在線軟件Genepop檢測Hardy-Weinberge平衡,并計算近交系數(shù)Fis。利用Arlequin3.1進行分子方差分析(AMOVA)并計算群體間遺傳分化指數(shù)(Fst);各位點的多態(tài)信息含量(PIC)用軟件PIC-CALC計算;根據(jù)Nei’s遺傳距離,利用軟件MEGA 5.0進行聚類樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 位點多態(tài)性

部分位點的毛細血管電泳峰圖如圖1、圖2所示,各位點的遺傳多樣性指數(shù)如表1所示,等位基因數(shù)Na在15～26之間;有效等位基因數(shù)Ne在5.094 1～10.825 4之間;期望雜合度He在0.807 2～0.911 6之間;觀測雜合度Ho在0.439 7～0.913 8之間;多態(tài)信息含量PIC在0.788 0～0.900 7之間,均大于0.5,說明12個位點的多態(tài)性處于較高水平。

表1 12個微衛(wèi)星位點在3個群體上的遺傳特性

圖1 位點CCE23在州河鯉群體中的擴增結(jié)果

圖2 位點CCE633在潮白河群體中的擴增結(jié)果

2.2 群體多態(tài)性

3個群體的遺傳多樣性指數(shù)見表2。3個群體中,平均等位基因數(shù)最大的是潮白河群體(Na=16.166 7),最小的是福瑞鯉2號(Na=3.666 7)。在所有群體中平均觀測雜合度最高的是潮白河群體(0.882 5),接下來的依次是州河鯉(0.691 1)、福瑞鯉2號(0.636 7)。3個群體的平均PIC值分別為:0.772 2(州河鯉)、0.872 7(潮白河群體)、0.573 2(福瑞鯉2號)。對3個群體所有位點進行哈迪溫伯格平衡檢測,發(fā)現(xiàn)州河鯉中有1個位點顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.05),有6個位點極顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.01);潮白河群體中有5個位點極顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.01);福瑞鯉2號有1個位點顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.05),有10個位點極顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.01),說明福瑞鯉2號群體在形成過程中受到較大的人工選擇壓力的影響?？梢钥闯?野生群體的各項遺傳學參數(shù)普遍高于選育群體。

表2 3個群體在12個位點中的遺傳多樣性指數(shù)

2.3 群體間的遺傳分化

對3個群體的Fst值分別進行分析,結(jié)果見表3。遺傳分化指數(shù)Fst<0.05表明群體間存在較小的遺傳差異;0.050.25表明群體間存在很大的遺傳差異[9]。從表3中可看出0.046 7

表3 兩兩群體間的Fst值(對角線下)和Nei′s遺傳距離(對角線上)

圖3 基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類樹

群體遺傳變異的AMOVA分析結(jié)果顯示,13.62%(P<0.01)的遺傳變異來源于群體間,86.38%(P<0.01)的變異來源于群體內(nèi),說明遺傳差異主要存在于個體間,個體間的遺傳變異遠大于群體之間的遺傳變異(表4)。

3 討論

本文選取12對微衛(wèi)星引物對3個鯉群體進行了遺傳多樣性分析。12個位點擴增出的等位基因數(shù)在15～26之間,多態(tài)信息含量在0.788 0～0.900 7之間,平均多態(tài)信息含量為0.852 4,說明本文選取的微衛(wèi)星位點的多態(tài)性較高,可用于鯉群體的遺傳多樣性分析。

群體的遺傳多樣性是育種工作的物質(zhì)基礎(chǔ)。遺傳多樣性水平越高,在生長、抗逆、抗病等方面就更有優(yōu)勢,育種過程中可獲得的遺傳進展就越大[10]。等位基因數(shù)(Na)、多態(tài)信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多態(tài)性的重要指標,州河鯉、潮白河群體和福瑞鯉2號的平均等位基因數(shù)為11.833 3、16.166 7、3.666 7,說明野生群體州河鯉和潮白河群體具有豐富的育種潛力,而選育群體福瑞鯉2號在人工選育的進程中獲得了較純的種質(zhì)。本試驗中三個群體的平均PIC值分別為0.772 2、0.872 7、0.573 2,高于黃河鯉(0.468)[11]、廣西野生鯉與建鯉(0.438 8)[12]、長江野鯉(0.528 7)[13],說明野生群體與選育群體均具有較高的遺傳多樣性。選育群體福瑞鯉2號的原始親本除了黃河鯉、建鯉之外,還引入了黑龍江野鯉,因此在獲得較純的種質(zhì)同時,也保留了較高的遺傳多樣性,這與董在杰等[14]的研究結(jié)果類似。哈迪溫伯格平衡檢驗結(jié)果顯示,州河鯉有7個位點、潮白河群體有5個位點、福瑞鯉2號有11個位點偏離哈迪溫伯格平衡。根據(jù)哈迪溫伯格定律,一個無限大的、隨機交配的群體,在沒有突變、沒有選擇和遺傳漂變等因素干擾時,各等位基因的頻率和基因型頻率在遺傳中穩(wěn)定不變,即保持遺傳平衡。本文中出現(xiàn)偏離哈迪溫伯格平衡的位點,大多為He大于Ho,說明存在雜合子缺失,野生群體可能是由于過度捕撈、環(huán)境污染導(dǎo)致了某些等位基因的丟失;而選育群體偏離哈迪溫伯格平衡則有可能是與育種過程中的定向選擇有關(guān)。同時,無效等位基因的存在也可能是引起雜合子缺失的原因。

遺傳分化指數(shù)(Fst)是衡量群體間遺傳變異程度的參數(shù)之一,本實驗中州河鯉與潮白河的Fst值為0.046 7,小于0.05,說明二者之間的遺傳分化水平較低。福瑞鯉2號與州河鯉、潮白河鯉的Fst值分別為0.210 4、0.158 8,根據(jù)Wright[9]對Fst的劃分,當0.15