武瀚林, 楊晢銘, 王 靜, 布雨鑫, 王雅妮, 劉 丹

1.大連醫(yī)科大學(xué),遼寧 大連 116044;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016

糖尿病是一種以高血糖為特征的多因素代謝疾病,根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),到2025年,糖尿病患者的數(shù)量預(yù)計(jì)將達(dá)到3.33億[1-2]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者最重要的心血管并發(fā)癥之一[3-5]。DCM病理機(jī)制復(fù)雜,高脂和高糖刺激可通過活性氧系統(tǒng)損傷心肌細(xì)胞而誘發(fā)DCM[6]。減輕心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷對DCM的治療有著重要意義。NAD依賴性蛋白脫乙酰酶Sirtuin-3(NAD-dependent protein deacetylase Sirtuin-3,Sirt3)是線粒體中的去乙?；揎椕?主要對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn),Sirt3可抑制活性氧產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡[7-8],還會對心血管疾病和代謝控制具有深遠(yuǎn)的影響[9]。本研究旨在探討Sirt3對DCM的影響及其相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6只8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自江蘇集萃藥康公司。將小鼠分入正常組和DCM模型組,每組各3只。DCM模型組:高脂飲食(脂肪提供總熱量的60%;中國協(xié)同生物)喂養(yǎng)小鼠4周后,連續(xù)5 d腹腔注射鏈脲菌素20 mg/(kg·d),鏈脲菌素累積劑量為100 mg/kg。正常組:正常飲食(脂肪提供總熱量的10%;中國協(xié)同生物),腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液5 d。糖尿病模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)是小鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L。高脂飲食喂養(yǎng)28周為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 H9C2細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 大鼠心肌細(xì)胞系H9C2購自上海富衡生物科技有限公司。H9C2細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用300 μmol/L的棕櫚酸(palmitic acid,PA;美國Sigma-Aldrich公司)刺激H9C2細(xì)胞24 h來構(gòu)建心肌細(xì)胞脂毒性模型。將PA處理過的細(xì)胞納入PA組,未處理過則納入對照組。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行Sirt3的干擾RNA(si-Sirt3)和對照試劑(si-con)轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后給予PA刺激24 h并收集細(xì)胞。將細(xì)胞按照處理方式不同分入4組:si-con組,si-Sirt3組,si-con+PA組,si-Sirt3+PA組。

1.3 Western blot 用RIPA緩沖液裂解提取心肌組織和H9C2細(xì)胞總蛋白。等量的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE分離1 h,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與兔抗Sirt3(1∶1 000)、兔抗超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)(1∶1 000)、兔抗ac-SOD2(1∶1 000)、兔抗GAPDH(1∶1 000)在4℃下孵育過夜。孵育后,洗凈膜,用山羊抗兔IgG (1∶2 000)在室溫下孵育2 h,洗凈膜,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑曝光,分析數(shù)據(jù)。

1.4 DHE染色 在培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞上清中加入DHE工作液(10 μmol/L),37℃避光孵育30 min。孵育后,用PBS洗滌掉未被吸附的DHE。熒光顯微鏡下觀察DHE染色情況。

2 結(jié)果

2.1 正常組及DCM模型組小鼠心肌組織中Sirt3蛋白水平比較 與正常組比較,DCM模型組小鼠心肌組織中Sirt3蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 正常組和DCM模型組小鼠心肌組織中Sirt3蛋白水平比較

2.2 對照組及PA組細(xì)胞中Sirt3蛋白水平比較 與對照組比較,PA組細(xì)胞中Sirt3蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 對照組和PA組細(xì)胞中Sirt3蛋白水平比較

2.3 si-con組、si-Sirt3組、si-con+PA組、si-Sirt3+PA組細(xì)胞中SOD2乙?；奖容^ 與si-con組比較,si-con+PA組ac-SOD2/SOD2水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與si-con+PA組比較,si-Sirt3+PA組ac-SOD2/SOD2水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 si-con組、si-Sirt3組、si-con+PA組、si-Sirt3+PA組細(xì)胞中SOD2乙酰化水平比較

2.4 si-con組、si-Sirt3組、si-con+PA組、si-Sirt3+PA組細(xì)胞中活性氧水平比較 與si-con組比較,si-con+PA組活性氧水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與si-con+PA組比較,si-Sirt3+PA組活性氧水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 si-con組、si-Sirt3組、si-con+PA組、si-Sirt3+PA組細(xì)胞中活性氧水平比較

3 討論

脂肪酸代謝失調(diào)通過各種機(jī)制和信號通路使心肌細(xì)胞及其間質(zhì)纖維化,促進(jìn)心室重構(gòu)、肥大,導(dǎo)致心律失常和心力衰竭,介導(dǎo)DCM的發(fā)生和發(fā)展[10]。高脂刺激能夠引起細(xì)胞脂毒性,產(chǎn)生大量活性氧,活性氧會直接損傷心肌細(xì)胞,誘發(fā)DCM[11-12]。

Sirt3是哺乳動物Sirtuin蛋白家族的成員[13-14],表現(xiàn)出NAD依賴性脫乙酰酶活性。既往研究報(bào)道,Sirt3在心血管疾病中發(fā)揮重要作用:在心肌肥厚中,Sirt3能夠維持線粒體功能,保護(hù)心肌細(xì)胞;心力衰竭直接與Sirt3的活性受損相關(guān);心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的Sirt3活性下降可能是心肌損傷的關(guān)鍵原因;在動脈粥樣硬化中,Sirt3發(fā)揮抗氧化功能,保護(hù)心肌細(xì)胞[15-16]。本研究結(jié)果顯示:與正常組比較,DCM模型組小鼠心肌組織中Sirt3蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示,Sirt3在DCM的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果還顯示:在H9C2細(xì)胞中,PA刺激會使Sirt3蛋白水平降低、SOD2乙?；缴?在敲低Sirt3后,SOD2乙?；竭M(jìn)一步提升。這些結(jié)果說明,Sirt3是通過調(diào)控SOD2乙?；絹韰⑴c氧化應(yīng)激調(diào)控的。進(jìn)一步檢測活性氧水平發(fā)現(xiàn),在H9C2細(xì)胞中,PA刺激會使活性氧水平升高,在敲低Sirt3后,活性氧水平進(jìn)一步提升。這證明了Sirt3在調(diào)控活性氧水平中的重要作用。

綜上所述,Sirt3可通過SOD2的去乙?；募〖?xì)胞中的活性氧,減少心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,在DCM的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。