孔一淅，喬 梁，王蕙羽棠，劉星辰，楊寶菊

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

類受體激酶(receptor-like kinase，RLK)是植物受體最主要的組成成分，在細(xì)胞間的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)信號中起重要作用，控制植物的繁殖、生長、發(fā)育及對各種環(huán)境的適應(yīng)[1]。RLK 家族一般包含胞外結(jié)構(gòu)域(extracellular domain，ED)、跨膜區(qū)(transmembrane region，TM)和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域(Ser/Thr kinase domain，STK)[2]。在植物病原菌互作的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，RLK 作為模式識別受體 (pattern-recognition receptors，PRRs)可以識別病原菌分子模式 (pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，從而在細(xì)胞膜上響應(yīng)植物的天然免疫系統(tǒng)(pattern-triggered immunity，PTI)，激活植物的抗病能力[3-5]。當(dāng)外界信號PAMPs 分子被受體類激酶的ED 識別后，通過STK 將信號傳導(dǎo)給下游的信號通路，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，包括ROS爆發(fā)、MAPK 激活、胼胝質(zhì)沉淀、鈣離子流入、水楊酸積累等[3-5]。如油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，共受體BAK1 和受體FLS2 共同識別病原菌的鞭毛蛋白，BRI1 受體類激酶和BAK1 相互作用并經(jīng)交互磷酸化形成1 個(gè)活躍的受體復(fù)合物，從而激活油菜素內(nèi)酯抵御病原菌。越來越多的RLKs 已被證明是PRRs[3-5]。

細(xì)胞壁受體激酶(wall-associated kinases，WAK)及其類基因WAKLs(WAK like genes，WAKLs)屬于RLK 家族的亞家族[6]，合稱為WAK/WAKL 家族。WAKs和WAKLs的結(jié)構(gòu)非常相似，主要是胞外表皮生長因子結(jié)構(gòu)域(epidermal growth factor domain，EGF)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)STK，但部分WAKLs缺少一些結(jié)構(gòu)域，如WAKL7缺少跨膜域和激酶結(jié)構(gòu)域[7]。在植物防御反應(yīng)中，擁有胞外結(jié)構(gòu)域的WAKs/WAKLs基因可以作為細(xì)胞外界信號接收員，而胞內(nèi)激酶部位參與胞質(zhì)信號級聯(lián)反應(yīng)[7]，并且在生長發(fā)育和對非生物壓力的耐受性中起作用。WAKs/WAKLs基因在植物防御病原體方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如：AtWAK1編碼WAKs 蛋白，與病原菌互作，在擬南芥的防御反應(yīng)中起重要作用[8]；從玉米(Zea maysL.)中克隆的主效數(shù)量性狀基因ZmWAK可抗玉米絲黑穗病[9]；在棉花(Gossypium hirsutumL.)中鑒定到的GhWAK7A參與調(diào)節(jié)對鐮刀菌和黃萎病的反應(yīng)[10]；在山新楊(Populus davidiana×P.bolleana)中過表達(dá)克隆到PdPapWAK基因后，其抵抗非生物和生物脅迫的能力進(jìn)一步增強(qiáng)[11]。

植物WAK/WAKL家族是響應(yīng)病原菌信號的重要成員。長久以來，基因?qū)蚣僬f提供了植物抗病模式PTI 與ETI 系統(tǒng)、植物PRRs 與抗病基因(resistance gene，R)的明確界限，但這一界限面臨著大量研究的挑戰(zhàn)。WAK/WAKL家族作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要受體，可以激活植物的PTI 免疫反應(yīng)模式，檢測到病原菌的效應(yīng)蛋白，可能原因之一是其在植物R基因與病原菌無毒基因互作過程中發(fā)揮“監(jiān)測”作用[12-13]。在小麥對禾谷絲核菌的防御反應(yīng)中，鑒定到WAK7的轉(zhuǎn)錄豐度升高[14]，積極響應(yīng)了小麥禾谷絲核菌的防御反應(yīng)。小麥基因組中定位到1 個(gè)WAKL4/stb6基因，該基因識別病原菌效應(yīng)物Avr Stb6，且繞過過敏性反應(yīng)賦予小麥對枯葉病的抗性，符合基因?qū)蚣僬f[15]。當(dāng)過表達(dá)OsWAK91時(shí)，水稻激活ETI系統(tǒng)，產(chǎn)生H2O2反應(yīng)并增強(qiáng)相關(guān)R基因的表達(dá)[16]。SlWAK1通過番茄中的FLS2/FLS3 復(fù)合物參與調(diào)節(jié)PRRs 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[17]?？傊?，WAK/WAKL家族在PTI 和ETI 系統(tǒng)中的調(diào)控機(jī)制很復(fù)雜，具體情況尚不清楚。

本研究從課題組前期測定的小麥響應(yīng)條銹病侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出4 個(gè)在抗感材料中差異表達(dá)的WAKs/WAKLs基因，對其進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、蛋白基本理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化等生物信息學(xué)分析，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RTqPCR)在抗病和感病材料中分析其響應(yīng)條銹菌的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究小麥WAKs/WAKLs基因響應(yīng)條銹菌的侵染作用機(jī)制及功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種為抗條銹病品種云337 和感條銹病品種云402；小麥條銹菌(Puccinia striiformisf.sp.tritici)為CYR32。將小麥播種在人工培養(yǎng)室中，溫度控制在晝16～18 ℃、夜12～15 ℃，每天光照16 h；當(dāng)小麥生長到二葉期時(shí)，將CYR-32 與滑石粉按體積比1∶20 混合后進(jìn)行撒粉接種；分別采集條銹菌侵染后0、24、48、72、120和168 h 的葉片樣本，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序及差異基因表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄組測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。文庫質(zhì)檢合格的測序數(shù)據(jù)采用DESeq2 進(jìn)行差異基因分析，以差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥1.5 且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)＜0.01作為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，從中挖掘在抗感材料中差異表達(dá)的小麥WAKs/WAKLs基因，并對其進(jìn)行COG 分類、GO 功能富集、KEGG 注釋和KEGG 通路富集分析。

1.3 小麥WAK/WAKL 家族基因鑒定

下載擬南芥、水稻、大麥和小麥基因組數(shù)據(jù)庫文件，采用TBtools v1.108 從中比對出差異表達(dá)的小麥WAKs/WAKLs基因的同源基因組和氨基酸序列，并篩選同源性較高的基因；利用NCBI 的Batch CD-Search 在線軟件(https//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對篩選得到的候選基因編碼蛋白進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。

1.4 小麥WAK/WAKL 家族成員生物信息學(xué)分析

利用GSDS 在線軟件(http//gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析和繪制小麥WAKs/WAKLs基因結(jié)構(gòu)；利用ExPASyProtParam Tool (http//web.expasy.org/protparam)預(yù)測蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量；利用ExPASy (http//web.expasy.org/protscale)預(yù)測蛋白質(zhì)的親水性和疏水性；利用MEME 在線軟件(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)預(yù)測蛋白基序。為了研究小麥WAKs/WAKLs 蛋白與其他物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對小麥、大麥、擬南芥和水稻4 個(gè)物種中同源性較高的WAKs/WAKLs 蛋白全長序列進(jìn)行比對，采用DNAMAN V6 比對蛋白質(zhì)多序列，采用MEGA 7.0 的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用 TBtools 繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹與基序預(yù)測圖。

1.5 小麥WAKs/WAKLs 基因的表達(dá)模式分析

根據(jù)從轉(zhuǎn)錄組篩選出的小麥WAKs/WAKLs基因序列，使用Beacon Designer 8 設(shè)計(jì)RT-qPCR 引物序列(表1)，引物由北京擎科生物股份有限公司合成。采用RNA Easy Fast 植物組織 RNA 快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取小麥葉片的總RNA，再采用Aid lab 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TURE script 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以小麥GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，使用2×SYBR?Green 預(yù)混液(中國DF)試劑盒在Analytikjena-qTOWER2.2 型熒光定量PCR 儀(德國)上進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積10.0 μL，包括cDNA 模板1.0 μL，SYBR Green 1 Master 5.0 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，39 個(gè)循環(huán)，溶解曲線(60～95 ℃，每個(gè)循環(huán)增加1 ℃，每次循環(huán)時(shí)間為4 s)設(shè)置2 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并使用2-ΔΔCt[18]計(jì)算各個(gè)樣品及各組中的基因相對表達(dá)量。采用Excel 2010 處理數(shù)據(jù)；采用GraphPad Prism 8.4.2 作圖。

表1 供試引物Tab.1 Primers for test

2 結(jié)果與分析

2.1 4 個(gè)WAKs/WAKLs 基因的結(jié)構(gòu)

經(jīng)轉(zhuǎn)錄組篩選出4 個(gè)小麥WAKs/WAKLs基因，分別為TraesCS1B02G004100、TraesCS6B02-G459100、TraesCSU02G079300和TraesCS3A02G-122300基因(圖1)。其中，基因組序列最長的是TraesCS6B02G459100，長度為5 117 kb，包含4個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子；序列最短的是TraesCS3-A02G122300，長度為2 934 kb，包含3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子；TraesCSU02G079300和TraesCS1B-02G004100 的長度相近，分別為3 208 和3 194 bp，均包含3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子。

圖1 4 個(gè)小麥WAKs/WAKLs 基因的結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of four wheat WAKs/WAKLs genes

2.2 WAKs/WAKLs 蛋白的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位

由表2 可知：TraesCS1B02G004100、Traes-CS6B02G459100、TraesCSU02G079300和Traes-CS3A02G122300編碼的氨基酸序列長度分別為714、960、737 和652 aa；蛋白分子質(zhì)量分別為78.68、106.29、81.86 和69.67 ku；理論等電點(diǎn)分別為8.50、5.98、5.65 和6.25；脂肪族氨基酸指數(shù)分別為89.59、85.33、81.38 和90.49；4 個(gè)基因的蛋白親疏水性值均為負(fù)值，為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示：4 個(gè)基因均定位于細(xì)胞膜上，為膜蛋白。

表2 4 個(gè)WAKs/WAKLs 基因理化性質(zhì)Tab.2 Physicochemical properties of four WAKs/WAKLs genes

2.3 WAKs/WAKLs 的系統(tǒng)進(jìn)化以及基序和功能結(jié)構(gòu)域

小麥、大麥、擬南芥和水稻中同源性較高的43 個(gè)WAKs/WAKLs 蛋白質(zhì)序列按照親緣關(guān)系被分為4 個(gè)分支，TraesCS6B02G459100和來自水稻、大麥、擬南芥的成員聚為一類，處于分支Ⅰ，且與水稻Os05g04460親緣關(guān)系最近；TraesCSU-02G079300和TraesCS3A02G122300處于分支Ⅱ，分別與水稻Os02g02120、擬南芥AtWAKL15親緣關(guān)系最近；TraesCS1B02G004100處于分支Ⅲ，與大麥HORVU.MOREX.r3.5HG0503880親緣關(guān)系最近；分支Ⅳ僅包括小麥成員(圖2a)。

圖2 小麥與擬南芥、水稻、大麥 WAK/WAKLs 基因中保守蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(a)、蛋白結(jié)構(gòu)域(b)和基序結(jié)構(gòu)(c)Fig.2 Phylogenetic relationship (a),protein domain(b) and motifs structure (c) based on the amino acid sequences of WAKs/WAKLs from Triticum aestivum and Arabidopsis thaliana,Oryza sativa,and Hordeum vulgare

蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示：小麥、大麥、擬南芥和水稻W(wǎng)AKs/WAKLs 蛋白序列均包括激酶部位(圖2b)。在進(jìn)化分支Ⅰ中，小麥WAKs/WAKLs 蛋白都包括2 個(gè)GUB_WAK_bind 結(jié)構(gòu)域，1個(gè)EGF 和1 個(gè)STK，除水稻Os01g26300和擬南芥AtWAKL16編碼的蛋白質(zhì)不具有胞外結(jié)構(gòu)域外，其他成員均具有胞外結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)化分支Ⅱ中，大部分水稻成員不具備胞外結(jié)構(gòu)域，而其他成員均具備；部分小麥成員還具有跨膜TM_FGFR-like 結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)化分支Ⅲ中，除小麥TraesCS1B02G004100 和大麥HORVU.MOREX.r2.1-HG0004690、HORVU.MOREX.r3.5HG0503880編碼的蛋白質(zhì)具有完整的胞內(nèi)和胞外結(jié)構(gòu)域外，其他成員均不具備。在進(jìn)化分支Ⅳ中，只有Traes-CS3A02G049500編碼的蛋白質(zhì)具有胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。說明胞內(nèi)STK 為所有成員共有，預(yù)測WAKs/WAKLs家族基因發(fā)揮功能與激酶部位有較大關(guān)聯(lián)。

基序預(yù)測結(jié)果顯示：小麥、大麥、擬南芥和水稻的WAKs/WAKLs 蛋白序列共包括12 種基序(圖2c)。進(jìn)化分支Ⅰ包括11 種基序，TraesCS-6B02G459100與大麥HORVU.MOREX.r3.3HG04-99530編碼的蛋白質(zhì)基序相似；進(jìn)化分支Ⅱ包括10 種基序，TraesCSU02G079300與水稻Os02g0-2120、大麥HORVU.MOREX.r3.7HG0649430編碼的蛋白基序高度相似，TraesCS3A02G122300與擬南芥AtWAKL15編碼的蛋白基序高度相似；進(jìn)化分支Ⅲ包括10 種基序，TraesCS1B02G004100與大麥HORVU.MOREX.r3.5HG0503880編碼的蛋白基序高度相似；進(jìn)化分支Ⅳ包括9 種基序，均是來自小麥WAKs/WAKLs 家族的成員，且編碼的蛋白基序基本相似。此外，基序1、2、3、4、5、7、8、11 為所有成員共有，均包括STK，預(yù)測胞內(nèi)激酶部位保守性較高，是決定蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵基序；基序9、10、12 包括胞外EGF 和半乳糖醛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(galacturonic acid binding domain，GUB)，說明胞外結(jié)構(gòu)域多樣，但具有一定的保守性。

2.4 WAKs/WAKLs 蛋白激酶部位的同源性比對

為了進(jìn)一步研究激酶部位的保守性，預(yù)測其發(fā)揮功能的部位，對涉及的成員進(jìn)行激酶部位蛋白序列同源性比對分析。該部位通常有2 個(gè)與激酶發(fā)揮功能有關(guān)的重要區(qū)域，包括蛋白激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)和酪氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)(圖3)，分析結(jié)果顯示：胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域同源性達(dá)73.34%，蛋白激酶ATP 結(jié)合位點(diǎn)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)和酪氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)保守性強(qiáng)，均符合這2 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)序列構(gòu)成特征。根據(jù)蛋白激酶ATP 結(jié)合位點(diǎn)中不變的天冬氨酸(D)附近是否存在保守精氨酸(R)，將激酶分為RD 型激酶和非RD 型激酶，由圖4 可知：TraesCS6B02G459100和TraesCS3A-02G122300為RD 型激酶，TraesCS1B02G004100和TraesCSU02G079300為非RD 型激酶。

圖3 WAKs/WAKLs 蛋白激酶催化域中的保守結(jié)構(gòu)域基序Fig.3 Conserved domain motifs in the catalytic domain of WAKs/WAKLs protein kinases

圖4 小麥與擬南芥、水稻、大麥 WAK/WAKLs 基因氨基酸多序列同源比對Fig.4 Homology alignment of amino acid sequences of WAKs/WAKLs genes in T.aestivum and A.thaliana,O.sativa,and H.vulgare

2.5 小麥 WAKs/WAKLs 基因響應(yīng)條銹病的表達(dá)

由圖5 可知：4 個(gè)基因在小麥接種條銹菌親和互作和非親和互作過程中差異表達(dá)。侵染0 h，TraesCS1B02G004100和TraesCS6B02G459100在小麥與條銹菌非親和互作中被短暫誘導(dǎo)表達(dá)后下調(diào)，隨后在侵染早期(24～48 h)上調(diào)表達(dá)，而TraesCS3A02G122300則表達(dá)相反；TraesCSU02G-079300在早期表達(dá)量無顯著差異。接種48 h 后，TraesCS1B02G004100和TraesCSU02G079300表達(dá)受到抑制而下調(diào)直至接種168 h；TraesCS6B02-G459100表達(dá)則呈上調(diào)直至接種120 h。綜上所述，親和互作過程中，TraesCS1B02G004100和TraesCS6B02G459100幾乎不表達(dá)，TraesCS3A0-2G122300早期表達(dá)趨勢和非親和互作一致，TraesCSU02G079300在早期表達(dá)量低于非親和互作。

圖5 4 個(gè)WAKs/WAKLs 基因在抗病品種云337 (Y337)和感病品種云402 (Y402)接種CYR32 后的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量Fig.5 Transcriptome expression level of four WAKs/WAKLs genes in resistant variety Yun337 (Y337) and susceptible variety Yun402 (Y402) post inoculation with CYR32

由圖6 可知：非親和互作過中，在條銹菌侵染小麥的24～48 h，TraesCS1B02G004100上調(diào)表達(dá)，TraesCS6B02G459100顯著上調(diào)表達(dá)，Traes-CS3A02G122300和TraesCSU02G079300表達(dá)受到抑制而下調(diào)；在接種條銹菌48 h 后，TraesCS1-B02G004100和TraesCS6B02G459100先下調(diào)后上調(diào)表達(dá)；TraesCS6B02G459100、TraesCS3A02G-122300和TraesCSU02G079300的表達(dá)量分別在接種條銹菌120、24 和168 h 后達(dá)到峰值。親和互作過程中，TraesCS1B02G004100幾乎不表達(dá)；轉(zhuǎn)錄組中幾乎未表達(dá)的TraesCS6B02G459100，在接種0～24 h 被抑制表達(dá)，24 h 后上調(diào)表達(dá)，168 h 表達(dá)量達(dá)到峰值，但由于該基因轉(zhuǎn)錄豐度較低，可能導(dǎo)致RT-qPCR 檢測結(jié)果不能有效地反映其實(shí)際表達(dá)情況；TraesCS3A02G122300和TraesCSU02G079300在接種早期下調(diào)表達(dá)，接種120 h 后表達(dá)上調(diào)。綜上所述，4 個(gè)基因在小麥和條銹菌互作過程中利用轉(zhuǎn)錄組和RT-qPCR 分析的表達(dá)模式基本一致。

圖6 RT-qPCR 驗(yàn)證4 個(gè)WAK/WAKLs 基因在抗病品種云337 (Y337)和感病品種云402 (Y402)接種CYR32 后的表達(dá)模式Fig.6 Expression patterns of four WAKs/WAKLs in resistant variety Yun337 (Y337) and susceptible variety Yun402 (Y402) post inoculation with CYR32 by RT-qPCR

3 討論

WAKs/WAKLs基因在植物中屬于大家族，目前從擬南芥中鑒定了26 個(gè)WAKs/WAKLs基因，水稻中125 個(gè)，大麥中91 個(gè)，小麥中320 個(gè)[19-21]，作為病原菌的模式識別受體，它在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。本課題組從轉(zhuǎn)錄組中篩選的4 個(gè)WAKs/WAKLs基因，其結(jié)構(gòu)域存在一定差異，暗示這4 個(gè)基因功能上存在差異；通過RTqPCR 驗(yàn)證，闡明TraesCS1B02G004100基因參與調(diào)控小麥對條銹病的抗性，研究結(jié)果為揭示W(wǎng)AKs/WAKLs基因調(diào)控抗病性的功能和機(jī)制提供了參考。

本研究的4 個(gè)WAKs/WAKLs基因具有典型的胞外富含半胱氨酸的GUB_WAK_bind 和胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。從進(jìn)化分支上看，小麥TraesCS6B02G459100與水稻OsWAK91的親緣關(guān)系最近，OsWAK91正向調(diào)控水稻抵御稻瘟病菌侵染[16]。已有研究報(bào)道：2 個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域變異的OsWAK10基因以不同的親和力結(jié)合果膠寡糖，以控制水稻次生壁的合成[22]，由此可以說明：GUB 作為首先感知到外界信號的受體，可以與果膠結(jié)合激活WAKs/WAKLs基因，以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞形態(tài)。TraesCS6B02G459100與上述2 個(gè)水稻W(wǎng)AKs基因同為RD 激酶，由此可以推測，該基因可能編碼與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、抗病相關(guān)的激酶，相較于其他3 個(gè)基因，其具有的2 個(gè)GUB結(jié)構(gòu)域在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用機(jī)制值得探索。TraesCS3A02G122300與未知功能的激酶聚為同一分支，在抗感材料中都被抑制表達(dá)，但在后期感病材料的表達(dá)量高于抗病材料，盡管屬于RD激酶，但已有報(bào)道中也出現(xiàn)能夠調(diào)控植物抗病反應(yīng)的RD 激酶，如OsWAK91、OsWAK92、OsWAK94和OsWAK14基因是水稻對稻瘟病菌數(shù)量抗性的調(diào)節(jié)因子[16]，因此TraesCS3A02G122300的具體功能機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

WAK/WAKL 家族胞內(nèi)的ATP 結(jié)合位點(diǎn)及絲氨酸/蘇氨酸結(jié)合位點(diǎn)是調(diào)節(jié)植物先天免疫的重要結(jié)構(gòu)[23]，尤其是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)中保守的天冬氨酸附近是否存在精氨酸很大程度上決定了激酶的功能。已知在先天免疫中作為PRRs 的15 個(gè)激酶中有12 個(gè)是非RD 型[24]，表明所有非RD 激酶可能都參與先天免疫。TraesCS1B-02G004100和TraesCSU02G079300為非RD 型激酶。其中，TraesCS1B02G004100在親和互作體系中幾乎不表達(dá)；而在非親和體系中，該基因早期被誘導(dǎo)，24 h 以后被抑制，這與已報(bào)道的OsWAK112d基因表達(dá)模式一致，且過表達(dá)OsWAK-112d基因及其突變體分別增加了水稻的易感性和抗性，表明其在植物感染期間是抑制基礎(chǔ)抗性的負(fù)調(diào)控因子[16]，故推測TraesCS1B02G004100可能是小麥響應(yīng)條銹菌侵染的負(fù)調(diào)控基因，并且早期可能被PAMPs 誘導(dǎo)。TraesCSU02G079300與OsWAK11處于同一進(jìn)化分支，OsWAK11通過GUB 結(jié)合果膠并監(jiān)測果膠甲基化的變化以解毒過量的銅，并且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的伸長率以適應(yīng)外界環(huán)境的變化[25]，其轉(zhuǎn)錄豐度的趨勢與TraesCS1B0-2G004100相似，并且在2 種互作體系中差異表達(dá)，該基因可能也在防御反應(yīng)中發(fā)揮作用。

本研究篩選的小麥WAK1基因TraesCS1B0-2G004100和已經(jīng)在小麥中鑒定到的Snn1基因同源性最高，達(dá)99.86%。在腐生病原菌(Parastagonospora nodorum)和小麥互作過程中，SnTox1 作為病原菌分泌的效應(yīng)蛋白與Snn1基因相互作用，引起小麥細(xì)胞程序性死亡并賦予其對葉斑病的易感性，Snn1-SnTox1是小麥和葉斑病互作的多個(gè)重要模式之一[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)：在小麥與條銹菌非親和互作過程中，TraesCS1B02G004100基因響應(yīng)條銹菌侵染且表達(dá)受到抑制，而在親和互作過程中不受條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)，說明該基因極大可能參與調(diào)控小麥對條銹病的抗性。

4 結(jié)論

4 個(gè)小麥WAKs/WAKLs基因中，TraesCS3A0-2G122300和TraesCSU02G079300在小麥與條銹菌親和及非親和互作體系中差異表達(dá)；TraesCS6-B02G459100和TraesCS1B02G004100在小麥非親和互作中特異表達(dá)。非RD 型激酶TraesCS1B02-G004100在表達(dá)過程中受到抑制，作為病原菌效應(yīng)蛋白的受體，其在參與調(diào)控小麥對條銹病的抗性功能值得進(jìn)一步研究；其他3 個(gè)WAKs/WAKLs基因在植物生長發(fā)育過程中的作用也值得探索。