李晶 汪巍 彭敦鈺

[摘要]?目的?旨在通過整合單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)與TCGA數(shù)據(jù)庫，探究在肺腺癌中泛素連接酶E2T（ubiquitin?binding?enzyme?EZT，?UBE2T）的作用，為揭示UBE2T在肺腺癌發(fā)生機(jī)制中的具體作用提供幫助。方法?本研究從GEO數(shù)據(jù)庫（GSE117570）下載了單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，并使用R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控和分析。同時(shí)，利用在線工具分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中與肺腺癌相關(guān)的數(shù)據(jù)。通過整合TCGA數(shù)據(jù)庫與單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，分析UBE2T的潛在作用靶點(diǎn)。結(jié)果?差異分析結(jié)果表明，UBE2T可作為肺腺癌獨(dú)立的預(yù)后因子，并與患者預(yù)后不良相關(guān)。單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的整合分析顯示，與UBE2T相關(guān)的10個(gè)基因主要分布在單核細(xì)胞和T細(xì)胞簇中。通過CancerSEA數(shù)據(jù)庫的分析，發(fā)現(xiàn)UBE2T可能與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。結(jié)論?UBE2T可能通過調(diào)控細(xì)胞周期來促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]?肺腺癌；單細(xì)胞分析；TCGA數(shù)據(jù)庫

[中圖分類號(hào)]?R734??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.08.005

Investigating?the?role?of?UBE2T?in?lung?adenocarcinoma?based?on?GEO?database

LI?Jing1，?WANG?Wei2，?PENG?Dunyu1

1.Department?of?Anesthesia，?Peoples?Hospital?of?Wuhan?University，?Wuhan?430060，?Hubei，?China;?2.?Department?of?Thoracic?Surgery，?Peoples?Hospital?of?Wuhan?University，?Wuhan?430060，?Hubei，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?role?of?ubiquitin?binding?enzyme?EZT?（UBE2T）?in?lung?adenocarcinoma?by?integrating?single-cell?sequencing?data?with?the?TCGA?database，?in?order?to?provide?insights?into?the?specific?molecular?mechanisms?of?UBE2T?in?lung?adenocarcinoma.?Methods?Single-cell?sequencing?data?was?downloaded?from?the?GEO?database?（GSE117570），?and?R?language?was?used?for?quality?control?and?analysis?of?the?data.?Additionally，?online?tools?were?employed?to?analyze?lung?adenocarcinoma-related?data?from?the?TCGA?database.?The?potential?target?genes?associated?with?UBE2T?were?identified?by?integrating?TCGA?and?single-cell?sequencing?data.?Results?Differential?analysis?using?the?TCGA?database?successfully?demonstrated?that?UBE2T?could?serve?as?an?independent?prognostic?factor?in?lung?adenocarcinoma，?and?it?was?correlated?with?poor?patient?outcomes.?Integration?of?single-cell?sequencing?data?revealed?that?UBE2T-associated?genes?were?mainly?distributed?in?mononuclear?cells?and?T?cells.?Furthermore，?analysis?using?the?CancerSEA?database?suggested?a?close?association?between?UBE2T?and?cell?cycle?regulation.?Conclusion?UBE2T?may?play?a?role?in?promoting?the?occurrence?and?development?of?lung?adenocarcinoma?through?the?regulation?of?the?cell?cycle.

[Key?words]?Lung?adenocarcinoma;?Single-cell?analysis;?TCGA?database

肺癌是全球主要致死性癌癥之一，其發(fā)病率不斷上升且年輕化趨勢(shì)明顯，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。多靶點(diǎn)治療已被廣泛研究證明在癌癥治療中優(yōu)于單一藥物治療，因此尋找肺腺癌的治療靶點(diǎn)并揭示其發(fā)生機(jī)制顯得尤為重要。腫瘤組織由多種不同的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，其特征與對(duì)治療的敏感性密切相關(guān)。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從傳統(tǒng)的總體測(cè)序到單細(xì)胞測(cè)序的轉(zhuǎn)變?yōu)檫M(jìn)一步揭示肺腺癌發(fā)病機(jī)制提供了幫助[2]。

泛素連接酶E2T（ubiquitin?binding?enzyme?EZT，?UBE2T）屬于UBE2超家族，在泛素化的第二步中起基礎(chǔ)作用。以往研究表明UBE2T參與范可尼貧血（Fanconi?anemia，?FA）DNA修復(fù)的調(diào)控，最近的研究發(fā)現(xiàn)UBE2T還參與人類癌癥患者的腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程并影響生存和預(yù)后[3-4]。癌癥組織樣本和細(xì)胞系中常見到異常的UBE2T表達(dá)[5]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，UBE2T過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而UBE2T敲低則可抑制細(xì)胞增殖[6]。然而，目前尚不清楚UBE2T是否為典型的致癌基因，也不清楚UBE2T除致癌作用外是否參與其他功能。此外，除了泛素化外，UBE2T是否還具有其他作用機(jī)制，以及其在肺腺癌中的表現(xiàn)如何仍不清楚。為了回答這些問題，需要對(duì)UBE2T進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫公開的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，選擇本研究課題組長期研究的基因UBE2T，并結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫，分析UBE2T在肺腺癌發(fā)病機(jī)制中的可能角色，以期為研究UBE2T的具體分子信號(hào)通路提供幫助。

1??資料與方法

1.1??數(shù)據(jù)收集與處理

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫下載了GSE117570的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)量控制。質(zhì)量控制的條件：①每個(gè)細(xì)胞至少表達(dá)3個(gè)基因；②每個(gè)基因至少在50個(gè)細(xì)胞中表達(dá)；③剔除線粒體基因占比超過5%的細(xì)胞；④每個(gè)細(xì)胞至少檢測(cè)到50個(gè)RNA分子。

1.2??單細(xì)胞Seurat包的使用

本研究使用R語言中的Seurat包進(jìn)行單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，并設(shè)置相關(guān)參數(shù)條件：|LogFC|>1，P<0.05[7]。在進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制后，本研究使用主成分分析（principal?component?analysis，?PCA）進(jìn)行降維分析。使用FindCluster函數(shù)對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行識(shí)別，并使用tSNE函數(shù)進(jìn)行可視化降維。然后使用Scanpy函數(shù)進(jìn)行細(xì)胞軌跡分析，并使用clusterProfiler包進(jìn)行GO富集分析，同時(shí)對(duì)相關(guān)的6個(gè)通路進(jìn)行可視化。

1.3??TCGA數(shù)據(jù)庫

本研究使用在線網(wǎng)站GEPIA（http：//gepia.cancer-?pku.cn/）對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線分析，分析UBE2T在正常組和肺腺癌組中的差異表達(dá)情況，并對(duì)生存率和分期進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示正常組與腫瘤組的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。

1.4??CancerSEA數(shù)據(jù)庫

本研究使用CancerSEA數(shù)據(jù)庫（http：//?biocc.hrb?mu.edu.cn/CancerSEA/）分析UBE2T調(diào)控的與癌癥相關(guān)的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝、炎癥等7個(gè)癌癥相關(guān)的細(xì)胞過程。通過下載相關(guān)數(shù)據(jù)并進(jìn)行進(jìn)一步分析，使用氣泡圖進(jìn)行可視化[9]。

1.5??HPA數(shù)據(jù)庫

本研究從HPA數(shù)據(jù)庫（http：//www.proteinatlas.org/）中下載了免疫熒光圖像，初步確定UBE2T在細(xì)胞中的定位。HPA數(shù)據(jù)庫中的所有圖像都可以獲得授權(quán)下載[10]。

1.6??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究使用R軟件（R*64?4.0.2?版本）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析（使用相關(guān)的R包：pheatmap、ggplot2）。本研究使用Log-rank檢驗(yàn)確定顯著性，并使用Spearman系數(shù)表示變量之間的關(guān)聯(lián)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??UBE2T生存分析與細(xì)胞定位

通過利用TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌的數(shù)據(jù)，對(duì)正常組與腫瘤組中UBE2T的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果提示在腫瘤組織中UBE2T表達(dá)水平顯著下降，進(jìn)一步根據(jù)UBE2T表達(dá)的中位值將樣本分為高低表達(dá)兩組，發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)組中患者生存期明顯縮短（P<0.001），這與腫瘤組中UBE2T表達(dá)水平下降的結(jié)果相符。同時(shí)，UBE2T對(duì)患者分期也具有顯著影響。綜合以上分析結(jié)果可以得出，UBE2T可能是一個(gè)能夠影響患者預(yù)后的靶基因。為進(jìn)一步探明UBE2T的分子功能，本研究從HPA數(shù)據(jù)庫中下載了UBE2T表達(dá)的熒光圖，綠色為靶蛋白，發(fā)現(xiàn)UBE2T大部分表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)，這提示UBE2T可能與細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)（圖1）。

2.2??UBE2T相關(guān)基因單細(xì)胞分析

為進(jìn)一步揭示UBE2T的分子功能，本研究從TCGA中下載的肺腺癌數(shù)據(jù)中，篩選出與UBE2T最顯著相關(guān)的10個(gè)基因進(jìn)行單細(xì)胞分析（CACYBP、RAN、SNRPD1、CKS2、KPNA2、CKS1B、CELF2、TGFBR2、AKAP13、DPYSL2）。圖2A展示了單細(xì)胞數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果，分別代表基因數(shù)，測(cè)序深度和線粒體含量，圖2B和圖2C展示了將細(xì)胞分為10個(gè)簇，每個(gè)簇代表的細(xì)胞種類，圖2D展示了與UBE2T最相關(guān)的10個(gè)基因的細(xì)胞分布。通過以上分析，本研究發(fā)現(xiàn)，與UBE2T最相關(guān)的基因主要分布于單核細(xì)胞與T細(xì)胞中。

2.3??細(xì)胞軌跡分析

與UBE2T相關(guān)的基因主要集中在T細(xì)胞和單核細(xì)胞中，為了進(jìn)一步明確結(jié)果，本研究做了細(xì)胞軌跡分析（圖3A），通過細(xì)胞軌跡分析，本研究得出，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞可大致有3個(gè)走向（圖3B），其中與UBE2T相關(guān)的細(xì)胞簇大致位于第2支，因此，本研究對(duì)UBE2T相關(guān)細(xì)胞簇所在的一支做了GO富集分析（圖3C）。

2.4??UBE2T與細(xì)胞周期密切調(diào)控相關(guān)

單細(xì)胞分析結(jié)果表明，與UBE2T最為密切的10個(gè)基因主要分布在單核細(xì)胞和T細(xì)胞組中，然而，由于測(cè)序深度和數(shù)據(jù)的限制，本研究無法在單細(xì)胞圖中展現(xiàn)UBE2T的具體分布，因此，本研究利用在線網(wǎng)站（CancerSEA）分析了UBE2T可能的細(xì)胞學(xué)功能（圖4）。結(jié)果顯示，UBE2T與細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)系最為密切，為進(jìn)一步量化這個(gè)結(jié)果，本研究從CancerSEA數(shù)據(jù)庫中下載了相關(guān)數(shù)據(jù)，并計(jì)算了相關(guān)系數(shù)（R=0.71），且P<0.001。

3??討論

UBE2T是一種編碼蛋白的基因，它能夠編碼催化泛素與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而影響該蛋白的表達(dá)[11]。該基因存在缺陷會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞功能異常[12]。目前的研究證實(shí)，UBE2T通過影響多種信號(hào)通路（包括p53/AMPK/mTOR信號(hào)通路）來影響肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展[13]。同時(shí)，UBE2T與患者的預(yù)后不良相關(guān)，并與患者的分期有顯著關(guān)系[14]。本研究系統(tǒng)探討了UBE2T的具體功能，并進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在多數(shù)腫瘤的正常組和腫瘤組中，UBE2T差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且與肺腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與UBE2T相關(guān)的基因主要分布在單核細(xì)胞和T細(xì)胞中，并可能調(diào)控T細(xì)胞抗原提呈過程，從而影響肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

研究結(jié)果表明，UBE2T與Th2細(xì)胞浸潤相關(guān)，且在乳腺癌中被證明可通過免疫調(diào)節(jié)來影響腫瘤細(xì)胞的浸潤[15-16]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這些研究結(jié)果相符合，進(jìn)一步驗(yàn)證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。最后，本研究進(jìn)行了泛癌分析，發(fā)現(xiàn)UBE2T與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，因此，筆者猜想，UBE2T是否能夠通過影響T細(xì)胞分化周期進(jìn)而影響其表達(dá)，這需要更多的相關(guān)研究來證明。

總之，本研究通過GEO單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)和TCGA數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析，探討了UBE2T在肺腺癌中的作用。結(jié)果表明，該基因能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期來影響肺腺癌的發(fā)生與發(fā)展，并與患者預(yù)后有關(guān)。然而，本研究仍存在一些不足之處，例如對(duì)數(shù)據(jù)的分析并不具有代表性。因此，在后續(xù)的研究中，需要對(duì)更多的患者進(jìn)行研究驗(yàn)證，以進(jìn)一步完善本研究對(duì)UBE2T在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的認(rèn)識(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–05–15）

（修回日期：2023–11–25）