李 揚(yáng) 李晨浩 毛靜瑞 張?chǎng)?馬真捷 韓 珣 唐聞晶劉若卓 于生元△ 劉穎璐△

（1 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)學(xué)部，北京 100853；2 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；3 南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071）

偏頭痛是全球最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。根據(jù)最近的全球疾病負(fù)擔(dān)分析，偏頭痛是第二大致失能性疾病，在50 歲以下的女性中則位居第一[1]。本團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)入戶調(diào)查顯示，中國(guó)人群偏頭痛的年患病率為9.3%，預(yù)計(jì)年損失高達(dá) 3317 億元人民幣[2]。其中，慢性偏頭痛(chronic migraine, CM)能導(dǎo)致更嚴(yán)重的失能表現(xiàn)，且多與焦慮、抑郁等精神疾病共患，部分病人治療效果欠佳，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，為家庭及社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3,4]。

有研究顯示偏頭痛是一種腦功能障礙性疾病，涉及前扣帶回(anterior cingulate cortex, ACC)、島葉、三叉神經(jīng)脊束核等多個(gè)腦區(qū)[5]。其中島葉在大腦功能中具有重要地位，參與包括神經(jīng)病理性疼痛和炎性痛在內(nèi)的多種類型疼痛的調(diào)控[6,7]，但島葉與偏頭痛發(fā)病機(jī)制的關(guān)聯(lián)研究卻很少報(bào)道。在一項(xiàng)腦功能成像研究中顯示，CM 病人的病程長(zhǎng)短與前島葉和背內(nèi)側(cè)丘腦，前島葉和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)之間的功能連接強(qiáng)度顯著相關(guān)[8]。另一項(xiàng)研究表明，在患有偏頭痛的女性病人中，其島葉皮質(zhì)厚度較同齡健康女性增厚[9]。但偏頭痛發(fā)病機(jī)制中具體通過(guò)什么途徑影響島葉結(jié)構(gòu)和（或）功能變化尚未可知。此外，島葉是參與認(rèn)知與情緒調(diào)節(jié)的重要腦區(qū)[6]。一項(xiàng)臨床研究顯示，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑和行為認(rèn)知療法可減少病人島葉和杏仁核在焦慮和抑郁發(fā)病期間的活動(dòng)，且島葉和杏仁核活動(dòng)的減少程度與焦慮癥狀的減少情況呈正相關(guān)[10]。然而，島葉在偏頭痛病理情況下是否仍能調(diào)節(jié)相關(guān)焦慮等情緒行為尚不清楚。

既往研究表明，谷氨酸受體及其相關(guān)信號(hào)分子積極參與疼痛及焦慮抑郁等情緒障礙的發(fā)生與調(diào)節(jié)[10,11]。其中，在小鼠神經(jīng)結(jié)扎的慢性疼痛模型中發(fā)現(xiàn)，α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(alphaamino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid,AMPA)受體亞基1-GluA1 上調(diào)和磷酸化改變可導(dǎo)致島葉神經(jīng)元的興奮性增強(qiáng)[12]。Mcginnis 等[13]研究表明，小鼠酒精戒斷引起的焦慮情緒與AMPA 受體介導(dǎo)的島葉-杏仁核通路相關(guān)?；诖?，我們推測(cè)島葉可能通過(guò)谷氨酸受體，尤其是AMPA 受體參與調(diào)控偏頭痛及相關(guān)焦慮行為。

環(huán)腺苷酸(cyclic AMP, cAMP)作為細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的第二信使，在學(xué)習(xí)和記憶、慢性疼痛、情緒恐懼和藥物濫用等生理功能中起重要作用[14]。腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)具有多個(gè)分類亞型，可在細(xì)胞內(nèi)將ATP 催化生成cAMP。其中，AC1主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，且與AMPA 受體存在相互調(diào)節(jié)作用[14～16]。在慢性疼痛模型動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，AMPA 受體介導(dǎo)鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，使AC1通過(guò)激活cAMP 增加蛋白激酶A (protein kinase A,PKA)的表達(dá)，激活的PKA 可進(jìn)一步影響AMPA 受體及其磷酸化的表達(dá)變化，因此，AC1 在AMPA受體相關(guān)的信號(hào)通路中具有重要作用[15～17]。據(jù)報(bào)道，同時(shí)敲除小鼠的AC1 和AC8 基因可表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛作用，緩解其炎性痛、深部肌肉疼痛和神經(jīng)病理性疼痛，而僅敲除小鼠的AC1 基因，除鎮(zhèn)痛作用外，其運(yùn)動(dòng)功能、記憶及情緒表現(xiàn)與正常小鼠相比無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AC1 的抑制劑NB001(5-[[2-(6-Amino-9H-purin-9-yl)ethyl]amino]-1-ol)

亦可在動(dòng)物模型中緩解多種疼痛表現(xiàn)[18]?；诖耍狙芯渴状螒?yīng)用CM 動(dòng)物模型，通過(guò)行為學(xué)和組織學(xué)等方法探究島葉在偏頭痛及相關(guān)焦慮行為中的作用機(jī)制，旨在為理解偏頭痛發(fā)病機(jī)制及未來(lái)新型治療方案提供科學(xué)依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠44 只，8～9 周齡，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào) SCXZ（京2019-0010）]，飼養(yǎng)在溫度22～24℃、濕度40%～60%和光照（12 h光/暗循環(huán)）控制的環(huán)境中，允許自由獲取食物和水。飼養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究通過(guò)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)規(guī)定。

主要儀器及耗材：曠場(chǎng)設(shè)備（上海欣軟）；vonFrey 纖毛機(jī)械刺激針套件(Anesthesio)；微量注射器（25 μl；10 μl；上海高鴿，平頭）；藥物注射套管套裝（瑞沃德，62001、62002、62101、62102、62201、62202、62513）；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜（麥克林，IPFL00010）。

主要試劑：5-羥色胺(Sigma-Aldrich, H9523)；前列腺素 E2（麥克林，P860711）；組胺 (Sigma-Aldrich)；緩激肽（麥克林，B860429）；磷酸鹽緩沖液 (PBS, Solarbio, P1010)。用PBS 溶液溶解配制成含有2 mM 5-羥色胺、0.2 mM 前列腺素 E2、2 mM 組胺、2 mM 緩激肽的炎癥湯(inflammatory soup, IS)溶液。NB001（HTS 09836；卓敏教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)）。免疫印跡實(shí)驗(yàn)：一抗：c-Fos (1:1000, cell signaling technology, #2250)、GluA1 (1:50000, Proteintech, 67642-1-Ig)、p-GluA1-S845 (1:2000, cell signaling technology, #8084)、AC1 (1:1000, abcam,ab69597)和β-actin (1:3000, Proteintech, HRP-66009)。抗鼠/兔二抗(1:3000, Proteintech, SA00001-1, SA00001-2)。蛋白酶抑制劑混合物（碧云天，P1049-1）；磷酸酶抑制劑混合物（碧云天，P1049-2）；RIPA 裂解液（碧云天，P0013B）；BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒（翱擎，AQ526）；SDS-PAGE 預(yù)制膠（翱擎，AQ128-01）；1 min 快速封閉液（C220701，陽(yáng)光英銳）。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）CM 大鼠模型建立：造模方式與既往實(shí)驗(yàn)相同[19]。首先將SD 雄性大鼠用戊巴比妥鈉 (50 mg/kg)腹腔麻醉，然后將大鼠固定在立體定位儀上，切開(kāi)背側(cè)皮膚，露出顱骨。在矢狀縫右側(cè)1.5 mm、前囟后方 1.5 mm 處鉆直徑 1 mm 的小孔用于置入給藥套管（直徑1 mm，長(zhǎng)1mm），手術(shù)保證硬腦膜完整。隨后用螺絲和牙科水泥固定給藥套管，縫合頭皮，僅在皮外露出給藥套管帽。所有大鼠恢復(fù)2 天后用PBS 溶液檢查給藥套管是否通暢。手術(shù)成功的大鼠單籠飼養(yǎng)恢復(fù)7 天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在大鼠清醒時(shí)，通過(guò)給藥套管向硬膜輸注10 μl IS 以刺激大鼠上矢狀竇旁硬腦膜（共14 次，每日1 次）構(gòu)建CM 大鼠模型（CM 組）。對(duì)照組（Con 組）在相同條件下向硬膜輸注等體積PBS。每日在IS 或PBS 輸注前5 min，通過(guò)vonFrey 纖維絲隨機(jī)測(cè)定大鼠一側(cè)眶周的機(jī)械閾值以驗(yàn)證造模效果。每組12 只大鼠，7 只用于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，5 只用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Flow chart of the experimental outline

（2）島葉微量注射N(xiāo)B001：在固定IS 給藥套管的同時(shí)，在雙側(cè)島葉放置直徑0.56 mm 的套管（左側(cè)和右側(cè)各 5.7 mm、距前囟 0 mm、長(zhǎng)7.7 mm）。圖2 箭頭所示為雙側(cè)島葉立體定位注射位置示意圖。在第14 天，即停止IS 刺激1 天后開(kāi)始進(jìn)行島葉立體定位注射，用微量注射器向雙側(cè)島葉分別緩慢注射1 μl 選擇性AC1 抑制劑 NB001 (10 mg/ml) 或生理鹽水 (normal saline, NS)，每日1次，連續(xù)注射3天，即NB001 組和NS 組，每組10 只大鼠，5 只用于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（其中1 只在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后行免疫熒光染色查看島葉注射位置），5 只用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。NB001 使用劑量及注射方法參考既往實(shí)驗(yàn)[16]。

圖2 島葉注射位置圖腦組織冰凍切片免疫熒光染色。藍(lán)色為DAPI 染色的細(xì)胞核；白色箭頭標(biāo)記為島葉立體定位注射位置Fig.2 Layout diagram of insula injection Immunofluorescence staining was performed on frozen sections of brain tissue.DAPI stained nuclei are shown in blue; The white arrow indicates the sites of the insular stereotaxic injection.

（3）眶周機(jī)械閾值測(cè)定：每天（第0 至第17 天）在藥物(IS/PBS/NB001/NS)輸注前5 min，用vonFrey纖維絲 (1.0～26 g) 測(cè)量眶周機(jī)械閾值。測(cè)量前將每只大鼠置于塑料盒中適應(yīng)30 min。測(cè)量時(shí)，將vonFrey 纖維絲垂直施加于眶周皮膚，直至纖維絲彎曲，并保持5 秒或直到大鼠表現(xiàn)出陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性反應(yīng)包括頭退縮、發(fā)聲和前爪撥開(kāi)纖維絲。選擇3 個(gè)不同的眶周位置（外眥、眶上和前額）刺激[20]。當(dāng)2個(gè)或3 個(gè)刺激點(diǎn)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，將纖維絲的重量作為其眶周機(jī)械閾值。重復(fù)上述過(guò)程3 次。纖維絲由低刻度 (1.0 g) 開(kāi)始向高刻度遞增，同一刻度的纖維絲每個(gè)刺激位點(diǎn)測(cè)量1 次。對(duì)于26 g 的纖維絲無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)的大鼠，將26 g 記錄為其眶周機(jī)械閾值。

（4）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)全程在黑暗條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將大鼠在黑暗的行為學(xué)分析室適應(yīng)3～4 h。每只大鼠測(cè)試前用75%酒精溶液擦拭儀器消除嗅覺(jué)線索。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)圓形的黑色底座（直徑120 cm）和周?chē)暮谏珘Ρ冢ǜ?0 cm）組成。內(nèi)腔為直徑90 cm 的圓，外空間為環(huán)形。將大鼠背向?qū)嶒?yàn)人員置于曠場(chǎng)中央，然后采用動(dòng)物行為軌跡分析系統(tǒng)記錄其活動(dòng)，包括總路程、中央路程、進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間及次數(shù)，共記錄5 min。在IS 給藥第0天和第14 天對(duì)IS 組及PBS 組進(jìn)行曠場(chǎng)行為觀察。NB001 組及NS 組的曠場(chǎng)行為觀察時(shí)間是IS 刺激第14 天及NB001 給藥3 天后，即實(shí)驗(yàn)第17 天。

（5）高架十字迷宮(elevated plus maze, EPM)實(shí)驗(yàn)：EPM 實(shí)驗(yàn)環(huán)境及動(dòng)物適應(yīng)時(shí)間與曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)相同。EPM 裝置由兩個(gè)對(duì)立開(kāi)放臂 (50 cm×10 cm)和兩個(gè)對(duì)立閉合臂 (50 cm×10 cm×40 cm) 組成。迷宮中心是一個(gè)10 cm×10 cm 的開(kāi)放區(qū)域，迷宮高出地面60 cm。在測(cè)試開(kāi)始時(shí)，將大鼠背向?qū)嶒?yàn)人員置于EPM 的中央平臺(tái)，使其面對(duì)其中一只開(kāi)放臂。采用動(dòng)物行為軌跡分析系統(tǒng)記錄大鼠的總路程和開(kāi)臂路程。各組大鼠進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的時(shí)間同曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。

（6）免疫印跡實(shí)驗(yàn)：蛋白制備和蛋白印跡分析按照之前的方法進(jìn)行[21]。簡(jiǎn)單來(lái)講，在最后1 次藥物(IS/PBS/NB001/NS)輸注24～28 h 后（第14/17天），將雙側(cè)島葉腦組織收集并放在-80℃保存直至使用。將大鼠腦組織用組織研磨儀低溫 (0℃) 研磨后，用加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制的RIPA 裂解液在冰上充分裂解后，在4℃條件下離心獲取上清。用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，將其稀釋至3 μg/μl。30 μg 蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。用快速封閉液將PVDF膜封閉1 min 后，使其與相應(yīng)一抗及二抗相結(jié)合。使用HRP ECL 系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行可視化，然后ImageJ 1.53t 軟件分析灰度值。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件（IBM Corp.，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Prism 8.3 軟件進(jìn)行畫(huà)圖。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)分布情況，采用Levene 法檢驗(yàn)方差齊性。兩組間比較采用雙尾獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或雙尾獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。眶周機(jī)械閾值采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，當(dāng)數(shù)據(jù)不符合球形假設(shè)時(shí)，用Greenhouse-Geisser 進(jìn)行校正。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示，P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CM 大鼠眶周痛覺(jué)過(guò)敏

CM 組和Con 組分析結(jié)果顯示，藥物IS 和硬膜給藥次數(shù)存在交互作用[F(14, 168) = 12.86,P＜0.001]，IS [F(1, 12) = 71.29,P＜ 0.001] 和硬膜給藥次數(shù)[F(4.46, 53.52) = 12.86,P＜ 0.001] 也分別對(duì)眶周機(jī)械閾值有影響。如圖3A 所示，在硬膜給藥前，即CM 組與Con 組（每組7 只）基線眶周機(jī)械閾值無(wú)顯著差異(t= 0.066,P＞ 0.999)。在4 次IS 注射后，CM 組的眶周機(jī)械閾值明顯比Con 組下降（第4 天：t= 4.594,P= 0.011）。從第4 天至第14 天，IS 組的眶周機(jī)械閾值始終比Con 組低（第14 天：t= 9.141,P＜ 0.001），且CM 造模完成時(shí)，CM 組大鼠眶周機(jī)械閾值已經(jīng)穩(wěn)定在低值，表示痛覺(jué)過(guò)敏。

圖3 反復(fù)IS 刺激硬腦膜對(duì)大鼠眶周機(jī)械閾值及焦慮行為的影響（n = 7 只/組，±SEM）(A) 反復(fù)IS 刺激硬腦膜對(duì)大鼠眶周機(jī)械閾值的影響；(B) 各組大鼠的曠場(chǎng)活動(dòng)軌跡代表圖；(C) 各組大鼠曠場(chǎng)總路程對(duì)比；(D) 各組大鼠曠場(chǎng)中央路程對(duì)比；(E) 各組大鼠曠場(chǎng)中央時(shí)間對(duì)比；(F) 各組大鼠進(jìn)入曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)次數(shù)對(duì)比；(G) 各組大鼠高架十字迷宮活動(dòng)軌跡代表圖；(H) 各組大鼠在高架十字迷宮的總路程對(duì)比；(I) 各組大鼠在高架十字迷宮的開(kāi)臂路程對(duì)比。#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, 與 Con 組相比；**P ＜ 0.01，與第0 天相比Fig.3 Effects of dural repeated IS stimulation on periorbital mechanical threshold and anxiety behaviors in rats (n = 7 rats/group,±SEM)(A) Effect of dural repeated IS stimulation on periorbital mechanical threshold in rats; (B) Representative open field activity tracks for each group of rats; (C) Comparison of total open field distance traveled by each group of rats; (D)Comparison of central open field distance traveled by each group of rats; (E) Comparison of time spent in the central open field by each group of rats; (F) Comparison of the number of entries into the central open field area by each group of rats; (G)Representative EPM activity tracks for each group of rats; (H) Comparison of total distance traveled by each group of rats in the EPM; (I) Comparison of the open-arm distance traveled by each group of rats in the EPM.#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, compared with the group Con；**P ＜ 0.01, compared with day 0.

2.CM 大鼠焦慮樣行為增加

Con 組和CM 組大鼠（每組7 只）的曠場(chǎng)行為學(xué)記錄顯示，在給藥前，總路程 (t= 0.564,P=0.583)、中央路程 (t= 0.509,P= 0.620)、中央?yún)^(qū)時(shí)間(Z= -0.575,P= 0.565) 及進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù) (t= 0.632,P= 0.539)均無(wú)顯著差異。但在給藥第14 天時(shí)，CM 組大鼠在曠場(chǎng)的總路程 (t= 6.610,P＜ 0.001)、中央路程 (t= 8.630,P＜ 0.001)、中央?yún)^(qū)時(shí)間 (t= 5.147,P＜ 0.001) 及進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)(t= 7.625,P＜ 0.001)均明顯比Con 組減少。此外，第14 天時(shí)CM 組大鼠在曠場(chǎng)的總路程 (t= 5.867,P＜ 0.001)、中央路程(t= 9.043,P＜ 0.001)、中央?yún)^(qū)時(shí)間 (Z= -3.130,P=0.002) 及進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù) (t= 6.411,P＜ 0.001)均明顯比基線減少（見(jiàn)圖3B-3F）。

Con 組和CM 組大鼠（每組7 只）的EPM 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給藥前，總路程 (t= 0.825,P= 0.425)和開(kāi)臂路程 (t= -0.542,P= 0.597) 均無(wú)顯著差異。在IS 刺激14 次后，CM 組和Con 組大鼠在高架十字迷宮中的總路程 (t= 1.146,P= 0.274)無(wú)顯著差異，但CM 組大鼠的開(kāi)臂路程 (Z= -3.130,P= 0.002) 明顯比Con 組減少。此外，第14 天時(shí)CM 組大鼠在高架十字迷宮的開(kāi)臂路程 (Z= -3.130,P= 0.002) 明顯較基線減少（見(jiàn)圖3G-3I）。

3.CM 大鼠島葉c-Fos、GluA1 及AC1 表達(dá)增加

在CM 造模完成后，取島葉組織（見(jiàn)圖4A）做免疫印跡檢測(cè)。CM 組島葉c-Fos 的蛋白表達(dá)量明顯高于Con 組（每組5 只，t= 3.548,P= 0.008，見(jiàn)圖4B, 4C）。同時(shí)，CM 組AC1 的表達(dá)也多于Con 組（每組5 只，t= 3.066,P= 0.015；見(jiàn)圖4B, 4D）。最后，GluA1（每組5 只，t= 2.953,P= 0.018）及其磷酸化p-GluA1-S845（每組5 只，Z= -2.611,P= 0.009）在CM 組島葉明顯多于Con 組（見(jiàn)圖4E-4G）。

圖4 反復(fù)IS 硬膜刺激對(duì)島葉的c-Fos、AC1、GluA1 及其磷酸化的影響（n = 5 只/組，±SEM）(A) 島葉解剖位置圖；(B) 免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠島葉c-Fos 和AC1 蛋白表達(dá)的代表圖；(C) CM 大鼠島葉c-Fos蛋白表達(dá)變化經(jīng)對(duì)照組歸一化后的統(tǒng)計(jì)圖；(D) CM 大鼠島葉AC1 蛋白表達(dá)變化經(jīng)對(duì)照組歸一化后的統(tǒng)計(jì)圖；(E)免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠島葉GluA1 和p-GluA1-S845 蛋白表達(dá)的代表圖；(F) CM 大鼠島葉GluA1 蛋白表達(dá)變化經(jīng)對(duì)照組歸一化后的統(tǒng)計(jì)圖；(G) CM 大鼠島葉p-GluA1-S845 水平變化經(jīng)對(duì)照組歸一化后的統(tǒng)計(jì)圖。#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, 與Con 組相比Fig.4 Effects of dural repeated IS stimulation on c-Fos, AC1, GluA1 and its phosphorylation in insula (n = 5 rats/group,±SEM)(A) Schematic diagram showed the location of insula.rhinal fissure (rf); (B) Representative images of c-Fos and AC1 protein expression in the insula of each group, detected by western blot test; (C) Graph showing normalized changes in c-Fos protein expression in the insula of CM rats; (D) Graph showing normalized changes in AC1 protein expression in the insula of CM rats; (E) Representative images of GluA1 and p-GluA1-S845 expression in the insula of each group,detected by western blot test; (F) Graph showing normalized changes in GluA1 protein expression in the insula of CM rats; (G) Graph showing normalized changes in the level of p-GluA1-S845 in the insula of CM rats.#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, compared with the group Con.

4.NB001 島葉注射可改善CM 大鼠眶周痛覺(jué)過(guò)敏及焦慮樣行為

NB001 組和NS 組分析結(jié)果顯示，藥物NB001和NB001 給藥次數(shù)存在交互作用 [F(3, 24) = 21.76,P＜ 0.001]，藥物NB001 [F(1, 8) = 36.49,P＜ 0.001]和NB001 給藥次數(shù) [F(1.14, 9.12) = 24.67,P＜ 0.001]也分別對(duì)眶周機(jī)械閾值有影響。向CM 大鼠雙側(cè)島葉注射1 次NB001 后，NB001 組大鼠的眶周機(jī)械閾值就較NS 組明顯升高（每組5 只，第15 天：t=5.585,P= 0.014）。NB001 連續(xù)治療3 次后，其眶周機(jī)械閾值上升的更加明顯（每組5 只，第17 天：t= 5.337,P= 0.018），而NS組的閾值仍穩(wěn)定在低值（見(jiàn)圖5A）。

圖5 雙側(cè)島葉輸注NB001 對(duì)CM 大鼠眶周機(jī)械閾值及焦慮行為的影響（n = 5 只/組，±SEM）(A) 雙側(cè)島葉輸注NB001 對(duì)CM 大鼠眶周機(jī)械閾值的影響（黑色箭頭指示第1 次注射N(xiāo)B001，陰影部分表示統(tǒng)計(jì)比較時(shí)間）；(B) 各組大鼠的曠場(chǎng)活動(dòng)軌跡代表圖；(C)各組大鼠曠場(chǎng)總路程對(duì)比；(D)各組大鼠曠場(chǎng)中央路程對(duì)比；(E)各組大鼠曠場(chǎng)中央時(shí)間對(duì)比；(F) 各組大鼠進(jìn)入曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)次數(shù)對(duì)比；(G) 各組大鼠的高架十字迷宮活動(dòng)軌跡代表圖；(H) 各組大鼠在高架十字迷宮的總路程對(duì)比；(I) 各組大鼠在高架十字迷宮的開(kāi)臂路程對(duì)比。#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, 與 Con 組相比；**P ＜ 0.01, 與第14 天相比Fig.5 Effect of bilateral insular infusion of NB001 on periorbital mechanical threshold and anxiety behaviors in CM rats (n = 5 rats/group,±SEM)(A) Effect of bilateral insular infusion of NB001 on periorbital mechanical threshold in CM rats (The black arrow indicates the first intraperitoneal injection of NB001.The shaded area indicates statistical comparison times); (B) Representative open field activity tracks for each group of rats; (C) Comparison of total open field distance traveled by each group of rats;(D) Comparison of central open field distance traveled by each group of rats; (E) Comparison of time spent in the central open field by each group of rats; (F) Comparison of the number of entries into the central open field area by each group of rats; (G) Representative EPM activity tracks for each group of rats; (H) Comparison of total distance traveled by each group of rats in the EPM; (I) Comparison of the open-arm distance traveled by each group of rats in the EPM.#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, compared with the group Con; **P ＜ 0.01, compared with day 14.

NB001 組及NS 組大鼠在完成CM 造模時(shí)（第14 天，每組5 只），在曠場(chǎng)的總路程 (t= -0.189,P=0.854)、中央路程 (t= 0.561,P= 0.590)、中央?yún)^(qū)時(shí)間(t= 0.049,P= 0.962) 及進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù) (t= 0.290,P= 0.779) 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接受連續(xù)3 次NB001島葉注射后（第17 天），NB001 組的總路程 (Z=-2.611,P= 0.009)、中央路程 (t= -7.265,P＜ 0.001)、中央?yún)^(qū)時(shí)間 (t= -7.100,P＜ 0.001) 及進(jìn)入中央次數(shù)(t= -5.409,P= 0.001) 均較NS 組明顯增加。且第17天時(shí)NB001 組的總路程(t= -3.864,P= 0.005)、中央路程(t= -6.699,P＜ 0.001)、中央?yún)^(qū)時(shí)間 (t= -6.157,P＜ 0.001) 和進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù) (t= -5.092,P= 0.001)均較基線明顯增加（見(jiàn)圖5B-5F）。

實(shí)驗(yàn)第14 天時(shí)，NB001 組和NS 組大鼠（每組5 只）在高架十字迷宮的總路程 (t= -0.363,P=0.726) 及開(kāi)臂路程 (t= 0.231,P= 0.823) 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)過(guò)3 次連續(xù)NB001 島葉注射治療后，NB001 組大鼠在高架十字迷宮的總路程 (t= -1.846,P= 0.102) 和NS 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但開(kāi)臂路程(Z= -2.611,P= 0.009) 明顯較NS 組增加。且此時(shí)NB001 組的開(kāi)臂路程 (t= 0.486,P= 0.640) 也較治療前明顯增加（見(jiàn)圖5G-5I）。

5.NB001 島葉注射可減少CM 大鼠島葉AC1表達(dá)，GluA1 表達(dá)及磷酸化

AC1 抑制劑NB001 連續(xù)3 次島葉注射后（第17 天），其島葉的AC1 表達(dá)明顯較NS 組減少（每組5 只，t= 8.579,P＜ 0.001）。同時(shí)，NB001 組的GluA1 表達(dá)（每組5 只，t= 3.404,P= 0.009）及p-GluA1-S845, 即GluA1 磷酸化水平（每組5 只，t=4.245,P= 0.003）明顯較NS 組減少（見(jiàn)圖6）。

圖6 雙側(cè)島葉輸注NB001 對(duì)CM 大鼠島葉AC1、GluA1 及其磷酸化的影響（n = 5 只/組，±SEM）(A) 免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠島葉GluA1 和p-GluA1-S845 蛋白表達(dá)的代表圖； (B) NB001 組大鼠島葉AC1 表達(dá)量經(jīng)對(duì)照組歸一化后的統(tǒng)計(jì)圖；(C) NB001 組大鼠島葉GluA1 蛋白表達(dá)變化經(jīng)對(duì)照組歸一化后的統(tǒng)計(jì)圖；(D)NB001 組大鼠島葉p-GluA1-S845 水平變化經(jīng)對(duì)照組歸一化后的統(tǒng)計(jì)圖。##P ＜ 0.01, 與 Con 組相比Fig.6 Effect of bilateral insular infusion of NB001 on AC1, GluA1 and its phosphorylation in CM rats (n = 5 rats/group,±SEM)(A) Representative images of GluA1 and p-GluA1-S845 protein expression in the insula of each group, detected by western blot test; (B) Graph showing normalized changes in AC1 protein expression in the insula of rats from NB001 group; (C) Graph showing normalized changes in GluA1 protein expression in the insula of rats from NB001 group; (D)Graph showing normalized changes in the level of p-GluA1-S845 in the insula of rats from NB001 group.##P ＜ 0.01, compared with the group Con.

討 論

在本研究中，發(fā)現(xiàn)大鼠硬腦膜重復(fù)IS 刺激可誘發(fā)偏頭痛樣癥狀和焦慮情緒行為。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CM 組島葉c-Fos 蛋白表達(dá)增加，同時(shí)GluA1 受體及其磷酸化p-GluA1-S845，以及AC1的表達(dá)均上調(diào)。CM 大鼠島葉微注射AC1 抑制劑NB001能顯著緩解大鼠的眶周痛覺(jué)過(guò)敏和焦慮行為，并降低島葉AC1，GluA1 受體及其磷酸化p-GluA1-S845 的表達(dá)量。

本研究采用反復(fù)IS 刺激硬膜以激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)并產(chǎn)生偏頭痛樣疼痛[22]。結(jié)果表明反復(fù)IS硬腦膜刺激4次后，大鼠眶周機(jī)械閾值出現(xiàn)顯著降低，并在第14 天時(shí)已經(jīng)維持在低值。與既往的研究相比，本研究發(fā)現(xiàn)14 天的IS 硬膜刺激足以誘導(dǎo)成年大鼠出現(xiàn)穩(wěn)定頭部疼痛狀態(tài)[19,23]。本研究檢測(cè)了島葉的c-Fos蛋白表達(dá)，這是一種可反映刺激后神經(jīng)元激活的蛋白標(biāo)志物[24]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CM 模型大鼠的島葉c-Fos蛋白表達(dá)量明顯高于Con 組。該結(jié)果與既往報(bào)道的顱腦核磁研究結(jié)果顯示偏頭痛病人及偏頭痛模型動(dòng)物的島葉較對(duì)照組顯著激活相一致[8,25]，可共同證明島葉參與了偏頭痛的疾病過(guò)程。

既往研究顯示，AMPA 受體可以通過(guò)調(diào)節(jié)AC1參與內(nèi)臟痛及癌痛等疼痛調(diào)控[26,27]。最新研究發(fā)現(xiàn)，大鼠ACC 通過(guò)抑制AC1 表達(dá)進(jìn)而降低GluA1磷酸化水平能有效緩解大鼠偏頭痛樣疼痛[16]，作為和ACC 同樣在痛覺(jué)調(diào)控中發(fā)揮重要作用的島葉，其AC1 表達(dá)是否可以調(diào)控偏頭痛相關(guān)表現(xiàn)尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)了島葉AMPA 的GluA1、p-GluA1-S845 及AC1 的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)GluA1、p-GluA1-S845 及AC1 均明顯較對(duì)照組多。而雙側(cè)島葉立體定位注射AC1 抑制劑 (NB001) 后，發(fā)現(xiàn)大鼠的偏頭痛樣疼痛顯著緩解。同時(shí)顯示，CM 組大鼠島葉的GluA1 表達(dá)及磷酸化均明顯升高，在應(yīng)用NB001 島葉立體定位注射后該變化有所緩解。由此，我們推測(cè)島葉可通過(guò)GluA1 及AC1 調(diào)控偏頭痛的病理生理機(jī)制。

除頭部疼痛外，與焦慮等情緒共病也是非常值得關(guān)注的問(wèn)題。在臨床工作中，偏頭痛病人常常合并焦慮抑郁等負(fù)性情緒[28]，因此，本研究觀察了大鼠連續(xù)IS 硬膜刺激后是否也能產(chǎn)生焦慮樣行為。結(jié)果表明，在連續(xù)硬膜刺激14 天后，大鼠在曠場(chǎng)及高架十字迷宮的焦慮樣行為明顯增加，這更加證實(shí)了偏頭痛與焦慮疾病發(fā)病存在交叉或相互影響的機(jī)制?；诖?，本研究發(fā)現(xiàn)在CM 大鼠中島葉立體定位注射N(xiāo)B001 后，除了眶周機(jī)械閾值有所回升外，其焦慮情緒行為也得到了緩解，進(jìn)一步證明島葉可能通過(guò)調(diào)節(jié)GluA1 和AC1 影響CM 大鼠的痛閾和焦慮樣行為。既往研究表明，小鼠急性偏頭痛樣疼痛發(fā)作不導(dǎo)致焦慮樣行為，但偏頭痛樣疼痛持續(xù)發(fā)作導(dǎo)致中樞痛覺(jué)敏化，同時(shí)表現(xiàn)出焦慮行為[16]。根據(jù)先疼痛后焦慮的癥狀產(chǎn)生順序，考慮NB001 可能通過(guò)緩解疼痛，進(jìn)一步緩解焦慮行為。此外，有多項(xiàng)研究證明NB001 對(duì)生理性疼痛感知、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能無(wú)明顯影響，且無(wú)明顯成癮性[29]。其臨床I 期研究的結(jié)果在健康成人中亦證實(shí)具有良好的安全性和耐受性[30]。因此，NB001 在治療偏頭痛及其相關(guān)焦慮行為方面具有潛在應(yīng)用前景。

本研究首次在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)了島葉參與偏頭痛及其相關(guān)焦慮情緒行為調(diào)控，且這一調(diào)控作用可能是通過(guò)影響島葉GluA1 及AC1 實(shí)現(xiàn)的。但本研究仍存在以下不足之處：①島葉立體定位給藥方式存在較大創(chuàng)傷及風(fēng)險(xiǎn)，后續(xù)應(yīng)完善腹腔注射、灌胃等更加安全的給藥方式。②本實(shí)驗(yàn)所用模型雖為經(jīng)典偏頭痛動(dòng)物模型，但在硝酸甘油誘發(fā)模型、左克洛卡林誘發(fā)模型等其他偏頭痛模型共同驗(yàn)證下更具說(shuō)服力。

綜上所述，島葉可能通過(guò)GluA1 及AC1 參與偏頭痛及其相關(guān)焦慮的病理機(jī)制調(diào)控，AC1 抑制劑可緩解大鼠眶周痛覺(jué)敏化及焦慮樣行為表現(xiàn)，具有臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。