吳佩亮，王良興，黃曉穎

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension, PH）是一種危及生命的心肺疾病，其特征是血管阻力升高，最終導(dǎo)致進(jìn)行性右心室衰竭[1]。流行病學(xué)研究表明，PH患者的臨床預(yù)后較差。如果不進(jìn)行治療，許多PH和右心室衰竭的患者會(huì)死亡[2]。因此，早期診斷、早期干預(yù)和預(yù)后評(píng)估對(duì)提高PH患者的生存率、預(yù)后和精準(zhǔn)治療具有重要意義。

漢黃芩素（5, 7-二羥基-8-甲氧基黃酮, wogonin） 是黃芩根中一種主要的黃酮類成分。研究表明，在卵清蛋白（ovalbumin, OVA）暴露的過敏性哮喘炎癥小鼠模型中，漢黃芩素通過促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕氣道炎癥[3-4]。然而，漢黃芩素對(duì)PH的潛在作用鮮有報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)外源性中藥單體黃芩苷干預(yù)后小鼠肺組織中磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylation phosphatidylinositol-3-kinases, p-PI3K）、磷酸化蛋白質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶（phosphorylation protein-serine-threonine kinase, p-AKT）的表達(dá)水平顯著下降，小鼠的右心室壓力（right ventricular systolic pressure,RVSP）顯著下降，肺血管壁增厚減輕，進(jìn)而緩解PH。鑒于黃芩苷與漢黃芩素都屬于黃芩的黃酮類成分，兩者都具有抗炎、抗氧化、抗纖維化和抗增殖作用，存在一定相似性，故我們推測(cè)PI3K/AKT可能作為一個(gè)關(guān)鍵通路參與漢黃芩素抑制PH肺血管重建過程。此外，在多種腫瘤細(xì)胞中維甲酸X受體A（retinoid X receptor alpha, RXRA）依賴N端切割形式tRXRA發(fā)揮促癌作用，其致病機(jī)制主要包括PI3K/AKT、NFκB等信號(hào)通路[5-6]。然而，RXRA在PH中的作用仍不清楚。本研究旨在闡明漢黃芩素是否通過miR-451抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)通路對(duì)低氧誘導(dǎo)的PH（HPH）發(fā)生發(fā)展中的保護(hù)作用，為PH的臨床防治開辟新的思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源、分組和給藥方案

由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供18只野生型C57BL/6小鼠，許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0020，雄 性，10～14周齡，體質(zhì)量18～25 g。將小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為常氧對(duì)照（N）組、低氧（H+Saline）組、低氧+漢黃芩素（H+w）組。將N組小鼠飼養(yǎng)在常壓常氧（21% O2）SPF環(huán)境中，H+Saline組及H+w組小鼠飼養(yǎng)在低氧（O2濃度維持在9%～11%）實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)21 d，每日造模24 h。H+w組小鼠在造模前，每日腹腔注射5 mg/kg漢黃芩素。漢黃芩素、740Y-P購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress公司。本研究實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞來源、分組和給藥方案

小鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（murine pulmonary artery smooth muscle cells, MPASMCs）購(gòu)自ATCC，分為常氧（N）組、低氧（H+PBS）組、低氧+低劑量漢黃芩素（H+40 μmol/L w）組、低氧+高劑量漢黃芩素（H+80 μmol/L w）組，低氧+高劑量漢黃芩素（H+ 80 μmol/L w）+740Y-P（20 μg/mL）組[7]。N組在常氧（5% CO2，21% O2，74% N2，37 ℃）環(huán)境中培養(yǎng)48 h， H+PBS組、H+40 μmol/L w組、H+80 μmol/L w組和H+80 μmol/L w+740Y-P組在低氧（5% CO2，3% O2，92% N2，37 ℃）環(huán)境中培養(yǎng)48 h。

1.3 方法

1.3.1 RVSP、左頸總動(dòng)脈壓力（mean carotid arterial pressure, mCAP）測(cè)定 對(duì)C57BL/6小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（0.05 mL/10 g）進(jìn)行麻醉，將小鼠固定在小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)手術(shù)器械鈍性解剖，定位并分離右側(cè)頸外靜脈2 cm以及左頸總動(dòng)脈1 cm，Powerlab生理信號(hào)系統(tǒng)記錄測(cè)量小鼠血流動(dòng)力學(xué)：RVSP和mCAP。

1.3.2 肺動(dòng)脈重構(gòu)指標(biāo)檢測(cè) 解剖分離小鼠右肺中葉，將組織浸泡在4%多聚甲醛中固定48 h，固定好的組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，3～5 μm厚切片，常規(guī)梯度脫蠟，在25 ℃下進(jìn)行HE染色3 min，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件分析肺動(dòng)脈重構(gòu)指標(biāo)：肺小動(dòng)脈管壁直徑（wall thickness, WT）和管總直徑（total thickness, TT）、肺小動(dòng)脈管壁面積（wall area, WA）和管總面積（total area, TA）。

1.3.3 RT-qPCR 細(xì)胞內(nèi)總RNA的抽提采用TRIzol提取試劑盒，使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行cDNA合成。隨后RT-qPCR采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems公司）進(jìn)行。使用GAPDH對(duì)表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并通過2-ΔΔCt方法進(jìn)行量化。引物序列如下：巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）F 5’-TCCTGACTTACCAGCTCATGT-3’，R 5’-CCAAGATCGC TAGACTGGGC-3’；CAB39 F 5’-TGAACCTGCTGCGAGACAAA A-3’，R 5’-TGCGTCTTGTTAGGATTGGCTA-3’；GAPDH F 5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，R 5’-AAGTGGTCGTTGAGG GCAATG-3’；miR-451 F 5’-GCGGCGCAAAGAATTCTCCT-3’，R 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-451 inhibitor 5’-AACTCAGTAATGGTAACGGTTT-3’。

1.3.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用CCK-8、EdU及集落形成檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞增殖能力。CCK-8實(shí)驗(yàn)：將MPASMCs接種于96孔板中，細(xì)胞密度為5×103/孔，培養(yǎng)24 h，將10 μL CCK-8溶液（美國(guó)MedChemExpress公司）加入48孔板中，在37 ℃下培養(yǎng)4 h。最后，每個(gè)孔在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。EdU檢測(cè)：滴入適量工作液在細(xì)胞爬片上，在孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞片，用EdU試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）進(jìn)行染色，最后用熒光顯微鏡（日本Olympus公司）觀察EdU染色圖像并采集，隨后統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。集落形成實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞按每孔750個(gè)細(xì)胞接種到12孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，14 d后加入多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定并加入結(jié)晶紫進(jìn)行染色，計(jì)算細(xì)胞集落個(gè)數(shù)。

1.3.5 傷口愈合/劃痕實(shí)驗(yàn) 將MPASMCs接種于6孔培養(yǎng)板，待MPASMCs生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%時(shí)，用200 μL槍頭在MPASMCs內(nèi)劃一垂線，用PBS沖洗劃下的MPASMCs，加入無血清培養(yǎng)基[8]。

1.3.6 Western blot 利用蛋白裂解緩沖液RIPA（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）提取肺組織和細(xì)胞總蛋白，采用BCA法（美國(guó)Pierce公司）測(cè)定各個(gè)樣本的蛋白濃度，提取的蛋白進(jìn)行10% SDS/PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在Western blot快速封閉液中封閉。應(yīng)用cyclin B1、p-PI3K、p-AKT、PCNA、RXRA、Bcl-2、Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）-2和MMP-7（抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行一抗孵育，在4 ℃冰箱內(nèi)放置過夜，用TBS-T在室溫下?lián)u晃洗滌膜3次，每次持續(xù)10 min。室溫下加入HRP二抗抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）孵育后化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。

1.3.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology, TCMSP）篩選漢黃芩素關(guān)鍵活性成分，按照生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%、類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18的篩選條件進(jìn)行靶分子篩選；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）是預(yù)測(cè)和構(gòu)建“蛋白-蛋白”相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫(kù)[9]，將漢黃芩素和PH共同作用的基因通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建“蛋白-蛋白”相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 黃芩調(diào)控PH的下游效應(yīng)分子的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)及篩選

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選黃芩調(diào)控PH的下游效應(yīng)分子，見圖1A。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選黃芩關(guān)鍵活性成分，按照OB≥30%、DL≥0.18的篩選條件，共篩選出36種關(guān)鍵活性成分，獲得關(guān)鍵活性成分作用的靶點(diǎn)共96個(gè)。從GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)共收集了3 762個(gè)PH相關(guān)基因。最后，將黃芩活性成分作用的靶點(diǎn)96個(gè)和3 762個(gè)PH相關(guān)基因進(jìn)行匯集，生成85個(gè)兩者共同作用的基因，見圖1B。隨后將黃芩和PH共同作用的基因通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建“蛋白-蛋白”相互作用網(wǎng)絡(luò)，并由Cytoscape軟件將“PH-基因-靶標(biāo)-黃芩”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，篩選出“PH-基因-靶標(biāo)-黃芩”網(wǎng)絡(luò)中排名前5的黃芩重要的活性成分，分別為：漢黃芩素（wogonin），黃芩素 （baicalein），β-谷甾醇（beta-sitosterol），豆甾醇（stigmasterol），木蝴蝶素A（oroxylin A），見圖1C。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的結(jié)果，選取了漢黃芩素作為主要的活性成分進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并且構(gòu)建了GO分子功能分類層次網(wǎng)絡(luò)、GO生物學(xué)過程分類層次網(wǎng)絡(luò)及通路富集分析下游通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可通過PI3K/AKT、IL-17信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等調(diào)節(jié)PH的進(jìn)程，見圖1D-F。

圖1 漢黃芩素作用于HPH的下游靶點(diǎn)通路篩選及預(yù)測(cè)

2.2 漢黃芩素抑制低氧誘導(dǎo)的MPASMCs增殖和遷移

與N組比，H+PBS組MPASMCs細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力、EdU陽(yáng)性細(xì)胞率、細(xì)胞集落形成數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+ 80 μmol/L w組MPASMCs細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力、EdU陽(yáng)性細(xì)胞率、細(xì)胞集落形成數(shù)顯著減少，其中H+ 80 μmol/L w組較H+40 μmol/L w組對(duì)MPASMCs細(xì)胞增殖能力的抑制作用更為明顯（P＜0.05），見圖2AC。與N組比，H+PBS組MPASMCs中增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05）；與H+PBS組比，H+ 40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），見圖2D。與N組比，H+PBS組MPASMCs細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞侵襲數(shù)、相對(duì)遷移距離顯著增加（P＜0.05）；與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞侵襲數(shù)、相對(duì)遷移距離顯著下降（P＜0.05），其中H+80 μmol/L w組較H+ 40 μmol/L w組對(duì)MPASMCs細(xì)胞遷移能力的抑制作用更為明顯（P＜0.05），見圖2E、圖2G。與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），見圖2F。

圖2 漢黃芩素抑制低氧誘導(dǎo)的MPASMCs增殖和遷移

2.3 漢黃芩素對(duì)肺小動(dòng)脈重構(gòu)、RVSP、mCAP的影響

H+Saline組小鼠WA/TA、WT/TT和RVSP與N組比顯著升高（P＜0.05）；與H+Saline組比，H+w組WA/TA、WT/TT和RVSP顯著下降（P＜0.01）；mCAP在N組、H+Saline組和H+w組3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 漢黃芩素對(duì)小鼠肺小動(dòng)脈重構(gòu)以及血流動(dòng)力學(xué)的影響

2.4 漢黃芩素能夠抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2通路激活

與N組比，H+PBS組MPASMCs中p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見圖4A。與N組比，H+Saline組小鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與H+Saline組比，H+w組小鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2蛋白表達(dá)表達(dá)顯著下降（P＜0.01），見圖4B。

圖4 漢黃芩素對(duì)PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)通路的影響

2.5 漢黃芩素調(diào)控PI3K/AKT/RXRA通路抑制MPASMCs增殖和遷移

與H+PBS組比，經(jīng)740Y-P干預(yù)后，漢黃芩素對(duì)p-PI3K、p-AKT、RXRA及Bcl-2蛋白表達(dá)抑制效應(yīng)被顯著削弱（P＜0.05），見圖5A；與H+PBS組比，H+ 80 μmol/L w組細(xì)胞增殖能力顯著下降，經(jīng)740Y-P干預(yù)后，740Y-P能夠部分逆轉(zhuǎn)漢黃芩素對(duì)MPASMCs增殖能力的抑制效應(yīng)（P＜0.05），見圖5B-D。與H+PBS組比，H+80 μmol/L w組細(xì)胞遷移能力顯著下降，經(jīng)740Y-P干預(yù)后，740Y-P能夠部分逆轉(zhuǎn)漢黃芩素對(duì)MPASMCs遷移能力的抑制效應(yīng)（P＜0.05），見圖5E。

圖5 漢黃芩素抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)軸

2.6 漢黃芩素通過上調(diào)miR-451抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2通路激活

與N組比，miR-451在H+Saline組小鼠肺組織中表達(dá)水平顯著減少（P＜0.05）；與H+Saline組比，miR-451在H+W組小鼠肺組織中表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），見圖6A。與N組比，miR-451在H+PBS組MPASMCs中表達(dá)顯著減少（P＜0.01）；與H+PBS組比，miR-451在H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），見圖6B。與N組比，H+PBS組MPASMCs中CAB39和MIF表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）；與H+PBS組比，H+40 μmol/L w組和H+80 μmol/L w組MPASMCs中CAB39和MIF表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），見圖6C-E。miR-451 inhibitor干預(yù)能夠部分逆轉(zhuǎn)漢黃芩素對(duì)MPASMCs增殖和遷移能力的抑制效應(yīng)（P＜0.05），見圖6F、圖6G。表明漢黃芩素通過上調(diào)miR-451靶向調(diào)控CAB39和MIF，繼而抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)通路激活，調(diào)控PH進(jìn)展，見圖6H。

圖6 漢黃芩素通過上調(diào)miR-451抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)軸參與PH進(jìn)展

3 討論

PH是一種影響肺小動(dòng)脈嚴(yán)重的疾病。盡管PH的確切病理生理學(xué)仍不清楚，但最近的進(jìn)展使人們更好地了解了肺血管重塑的細(xì)胞和分子驅(qū)動(dòng)因素，包括內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、平滑肌細(xì)胞異常、炎癥和免疫系統(tǒng)失調(diào)以及受體和配體的不平衡[10]。PH發(fā)生的關(guān)鍵性標(biāo)志是肺動(dòng)脈細(xì)胞功能障礙以及小動(dòng)脈重塑，由于血管平滑肌細(xì)胞不受控制的增殖、細(xì)胞骨架瓦解和去分化，導(dǎo)致血管中膜增厚和管腔閉 塞[11]。PH中肺動(dòng)脈表型的形成有多種過程，包括遺傳因素、DNA損傷、miRNA、性激素、氧化應(yīng)激和細(xì)胞代謝改變[12]。在臨床上，內(nèi)皮素途徑、前列環(huán)素途徑和一氧化氮/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶途徑[13]的多種靶向藥已被批準(zhǔn)用于治療PH。雖然這些藥物能夠改善患者的臨床癥狀，但不能逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展。因此，研究PH的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探索新型有效的治療方案，對(duì)于改善PH的臨床預(yù)后十分重要。

我國(guó)藥用植物資源豐富，從天然草藥中開發(fā)出更有效、更安全的防治PH的藥物具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為唇形科多年生草本植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根[14]，是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的50種基本草藥之一，作為一種具有很高藥用價(jià)值和廣泛功效的傳統(tǒng)中藥，目前被認(rèn)為是治療如炎癥、發(fā)熱、動(dòng)脈粥樣硬化、過敏和排尿困難的強(qiáng)有力的藥用植物[15]。既往的研究表明，黃芩提取物及其生物活性成分具有廣泛的藥理活性，包括抗炎[16]、抗氧化[17]、抗 菌[18]、神經(jīng)保護(hù)[19]、抗腫瘤[20]。與單體或化學(xué)藥通常作用于單一靶點(diǎn)不同，黃芩的有效成分群是如何作用于體內(nèi)靶點(diǎn)群，從而發(fā)揮整合調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法成功構(gòu)建了黃芩作用于HPH的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，并成功篩選出黃芩最主要的活性成分之一漢黃芩素，同時(shí)預(yù)測(cè)到PI3K/AKT/RXRA是漢黃芩素調(diào)控PH進(jìn)展的潛在信號(hào)通路。因此，本研究在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)漢黃芩素可顯著抑制MPASMCs的增殖能力，同時(shí)漢黃芩素還能夠顯著抑制MPASMCs的遷移和侵襲能力，初步證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果。在動(dòng)物模型上，低氧組小鼠RVSP顯著升高，表明成功構(gòu)建了HPH小鼠模型，經(jīng)過漢黃芩素干預(yù)后本研究結(jié)果表明漢黃芩素能夠顯著改善肺小動(dòng)脈的重構(gòu)以及降低RVSP，進(jìn)而緩解PH。上述體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明漢黃芩素能夠緩解HPH的發(fā)生發(fā)展。

基于網(wǎng)路藥理學(xué)篩選預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究為了進(jìn)一步闡明了漢黃芩素發(fā)揮其作用的潛在機(jī)制，選擇PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。PI3K/AKT是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)控多種細(xì)胞功能，如增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路能夠促進(jìn)PASMCs的增殖，下調(diào)PI3K/AKT能抑制PASMCs的增殖，促進(jìn)其凋亡，改善低氧誘導(dǎo)的肺血管結(jié)構(gòu)重建，從而緩解PH[22]。本研究體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示漢黃芩素能夠顯著抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)通路的活化，表明PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)通路是漢黃芩素調(diào)控PH進(jìn)展的潛在下游效應(yīng)通路。

miRNA在體內(nèi)表達(dá)豐富，miRNA對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、分化和凋亡等多種細(xì)胞過程發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)慢性缺氧小鼠模型和PH患者血漿中存在miR-451表達(dá)下降，上調(diào)miR-451可改善血流動(dòng)力學(xué)和血管重塑，從而減輕PH的發(fā) 展[25-26]，與本研究的結(jié)果一致。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-451能夠靶向調(diào)控PI3K/AKT通路[27]。基于此，我們推測(cè)漢黃芩素可能通過調(diào)控miR-451影響PI3K/AKT信號(hào)通路。另有研究表明CAB39和MIF是miR-451的直接靶蛋白并且介導(dǎo)了miR-451對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控作用[27-28]，本研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的MPASMCs細(xì)胞中CAB39和MIF表達(dá)上調(diào)，漢黃芩素能夠顯著抑制CAB39和MIF的表達(dá)水平。表明漢黃芩素可能通過上調(diào)miR-451靶向調(diào)控CAB39和MIF，繼而抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)通路激活。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)漢黃芩素能夠改善HPH小鼠右心室壓力和肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重塑，抑制低氧誘導(dǎo)的MPASMCs的增殖和遷移。進(jìn)一步探究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)漢黃芩素通過上調(diào)miR-451的表達(dá)靶向調(diào)控CAB39和MIF進(jìn)而抑制PI3K/AKT/RXRA/Bcl-2信號(hào)通路，最終緩解PH的進(jìn)展。