邢國靜， 羅龍龍， 王麗菲， 王順娜， 鄭曉鳳， 盧利霞 ，張久聰

1 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院消化內(nèi)科， 蘭州 730050

2 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內(nèi)科， 銀川 750001

3 蘭州大學第二醫(yī)院消化內(nèi)科， 蘭州 730030

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是指由化學藥品、生物制品、中成藥等按處方藥或非處方藥管理的藥品，以及中藥材、天然藥物、保健品、膳食補充劑等產(chǎn)品，或其代謝產(chǎn)物乃至其輔料、污染物、雜質(zhì)等所導致的肝損傷［1］，是常見的藥物不良反應，可在短期內(nèi)造成肝衰竭，甚至死亡。據(jù)估計，我國DILI的年發(fā)生率至少為23.8/10萬，高于其他國家［2］。N-乙酰半胱氨酸、糖皮質(zhì)激素、水飛薊素等藥物雖然對DILI有一定治療作用，但療效和安全性有一定局限性［3-5］。人工肝作為一種臨時肝支持系統(tǒng)，因其設備復雜、體積大，限制了其應用［6］。肝移植是目前唯一有效手段，由于器官供體短缺、免疫排斥反應和醫(yī)療費用高限制了其應用。近年來，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）在DILI治療中的潛在優(yōu)勢逐漸突顯，越來越多的研究表明，MSC可通過其歸巢能力、肝源分化、免疫調(diào)節(jié)和旁分泌效應促進肝細胞再生及減少肝細胞凋亡，從而減輕肝損傷［3］。MSC來源的外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-EXO）具有類似MSC的功能，不僅無致瘤風險，且具有更低的免疫原性、較長的循環(huán)半衰期、良好的滲透性和生物相容性［7］，在肝損傷的治療中頗受關(guān)注。因此，本文將從MSC和MSC-EXO的作用及干預DILI的作用機制進行綜述，以期為DILI的診治提供新的思路。

1 MSC及其外泌體概述

1.1 MSC概述 MSC是一種具有紡錘狀結(jié)構(gòu)和塑性底物黏附特性的非造血干細胞，具有強大的自我更新能力，可分化為中胚層譜系細胞和其他外胚層譜系細胞［8］。目前，已從臍帶、月經(jīng)血、脂肪、骨髓等組織中分離出MSC，臨床常用的主要來源為骨髓、臍帶血和脂肪組織。MSC表達表面標志物CD73、CD90和CD105，但不表達造血標志物CD45、CD34、CD14和CD79［9］。MSC具有多種生物學作用，如多譜系分化、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、抗凋亡、抗纖維化活性和組織修復［10-11］；此外，還釋放多種生物活性成分（包括蛋白質(zhì)、生長因子、趨化因子、微小RNA（microRNA，miRNA）和細胞因子），參與組織修復及再生［12］。MSC如此強大的功能被認為是細胞治療中最有前途的干細胞類型之一，已在肌肉骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心肌、肝臟、角膜、氣管和皮膚等相關(guān)組織得到廣泛研究和應用［13］。

1.2 外泌體概述 外泌體是直徑為40～160 nm的細胞外囊泡，存在各種體液中并且可由多種細胞分泌；其攜帶大量生物活性物質(zhì)，如DNA、mRNA、非編碼RNA、脂質(zhì)和各種蛋白質(zhì)，不僅在細胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導中起著重要作用，還在各種病理生理條件下作為診斷性的生物標志物和治療載體，具有巨大的潛力［14］。此外，外泌體還含有大量的膜聯(lián)蛋白、四跨膜蛋白家族（如CD63、CD81和CD9）和熱休克蛋白（如Hsp60、Hsp70和Hsp90）［15］。早期研究表明，外泌體在炎癥、細胞凋亡、凝血、細胞內(nèi)信號傳導、抗原呈遞和細胞穩(wěn)態(tài)等多種生物活動中起著至關(guān)重要的作用［16］。MSC-EXO作為MSC旁分泌作用的關(guān)鍵成分，不僅含有細胞因子、生長因子、信號脂質(zhì)、mRNA和調(diào)節(jié)性miRNA，還表達血管內(nèi)皮生長因子、細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導劑和基質(zhì)金屬蛋白酶9，這些因子在血管生成和組織修復中發(fā)揮重要作用［17］。MSC-EXO作為一種新型的無細胞療法，已被應用于各種疾病模型中，包括神經(jīng)、心血管、免疫、腎臟、肌肉骨骼、肝臟、呼吸系統(tǒng)、眼部和皮膚疾病以及癌癥［18］。

2 MSC及其外泌體移植治療DILI的作用機制

2.1 減輕肝臟炎癥反應 肝細胞作為肝實質(zhì)細胞的重要組成部分，生理功能獨特、所處環(huán)境特殊，極易在各種藥物作用下受到侵襲而發(fā)生炎癥反應。因此，有效減輕肝臟炎癥反應被認為是緩解肝損傷的重要措施。

在對乙酰氨基酚（APAP）引起的肝損傷模型中，損傷的肝組織可分泌多種細胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、單核細胞化學引誘蛋白-1、生長調(diào)節(jié)蛋白、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和基質(zhì)細胞衍生因子1等，這些細胞因子可有效誘導MSC遷移到受損肝臟部位，促進受損組織修復［19］。Salomone等［20］給APAP誘導的肝損傷大鼠移植脂肪組織MSC，發(fā)現(xiàn)其可使血漿ALT和AST表達下調(diào)、凝血酶原時間減少、血氨水平正常；HE染色顯示肝組織壞死也被完全抑制。人臍帶MSC（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）給藥不僅可以改善APAP誘導的肝損傷小鼠血清ALT水平、病理損傷；還可抑制肝臟促炎細胞因子和趨化因子［包括TNF-α，IL-1β，單核細胞趨化蛋白-1和趨化因子（CXC基序）配體1］mRNA水平，并減少巨噬細胞、中性粒細胞向肝組織浸潤。特別是Notch激活的hUC-MSC，可大大增強上述抗炎活性和治療作用［21］。

MSC-EXO是一種重要的旁分泌效應體，在組織、器官損傷修復過程中可有效降低肝臟炎癥反應，避免肝組織進一步損傷、惡化。在D-氨基半乳糖/脂多糖（D-GalN/LPS）誘導的小鼠肝損傷模型中，脂肪組織MSC-EXO可通過抑制miR-17介導的硫氧還蛋白互作蛋白減少肝巨噬細胞中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體的活化來改善肝臟炎癥反應［22］。此外，在TNF-α預處理后，hUC-MSC釋放大量富含miR-299-3p的外泌體，可通過抑制NLRP3通路的激活來減輕炎癥并促進肝組織修復［23］。由此可見，除了MSC和MSC-EXO在減輕肝臟炎癥反應，維持肝臟穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用；外泌體相關(guān)非編碼RNA也在肝臟保護作用方面發(fā)揮重要作用，為肝損傷的治療提供了新的方向和依據(jù)。

2.2 促進肝細胞增殖及再生 肝臟損傷后，肝細胞增殖及再生是肝臟從損傷中恢復所依賴的一個重要過程，在肝細胞存活和肝穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，也是治療DILI的重要途徑。MSC遷移至受損肝臟后發(fā)生肝源分化，并釋放生長因子，如肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-6、纖維蛋白原和轉(zhuǎn)化生長因子-α等促進肝細胞增殖及再生［24］。在胺碘酮誘導的體內(nèi)外肝損傷模型中，脂肪組織MSC不僅可以增加損傷肝細胞的細胞活力、阻止細胞凋亡途徑的激活、刺激啟動期基因的表達，還可使免疫細胞浸潤減少及再生反應增強，顯著減弱小鼠肝損傷［25］。

MSC-EXO也可有效促進肝細胞增殖及再生，阻止DILI的進展。在采用APAP和H2O2誘導的體外肝細胞損傷模型和CCl4誘導急性肝損傷的小鼠模型中觀察到，人類胚胎MSC-EXO干預后，啟動期因子表達增加、細胞活力得到改善、肝臟再生基因［核因子（NF）-κB、cyclin D1和cyclin E］和細胞增殖標志物（增殖細胞核抗原）的表達明顯上調(diào)［26］。因此，不管是體內(nèi)還是體外實驗，MSC及MSC-EXO均可改善受損肝臟，并刺激剩余的肝細胞再生和恢復，延緩疾病進展。

2.3 抗肝細胞凋亡作用 細胞凋亡是一種高度調(diào)控的細胞死亡形式，是許多穩(wěn)態(tài)和病理所必需的流程，涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控。Liu等［27］證實hUC-MSC移植可使D-GalN/LPS誘導的急性肝衰竭小鼠末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記染色陽性細胞減少、Bcl-xl/Bax蛋白比率增加、裂解半胱天冬酶-3和TNF-α水平下調(diào)。

自噬是由溶酶體介導的細胞分解代謝過程，在維持肝細胞和代謝穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。骨髓MSC-EXO通過增加自噬標記蛋白（微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ、Beclin-1）的表達促進自噬體的形成，在自噬體的誘導下促凋亡蛋白Bax和裂解半胱天冬酶-3的表達水平顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平上調(diào)，顯著減輕D-GaIN/LPS誘導的肝細胞損傷和凋亡，提高存活率［28］。另有研究［29］發(fā)現(xiàn)，hUCMSC-EXO可通過激活胰島素樣生長因子-1/磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2信號通路，進而逆轉(zhuǎn)APAP誘導的肝細胞凋亡。近些年，關(guān)于MSC及MSC-EXO的研究尚處于起步階段，其抗凋亡所涉及的信號通路仍需進一步研究。

2.4 改善氧化應激 氧化應激是多種肝臟疾病常見的病理生理基礎(chǔ)，氧化應激與抗氧化應激失衡即可影響DILI的進展。越來越多的證據(jù)表明MSC和MSC-EXO在治療肝損傷過程中可通過降低氧化應激發(fā)揮其治療作用。Huang等［30］證實小鼠視網(wǎng)膜脂肪組織MSC可抑制細胞色素P450活性、減少毒性硝基酪氨酸的積累、增加抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶）活性及抗氧化因子（核因子紅細胞2相關(guān)因子2、血紅素氧合酶1、醌氧化還原酶1）基因的表達來保護肝細胞免受APAP誘導的細胞損傷。深入研究發(fā)現(xiàn)這與下游MAPK信號激活被抑制和炎性細胞因子（IL-1α、IL-1β）的產(chǎn)生密切相關(guān)。另有研究［31］證實hUC-MSC條件培養(yǎng)基可通過下調(diào)miR-486-5p和上調(diào)絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白Pim-1減輕H2O2誘導的肝細胞氧化應激損傷，其機制與抑制TGF-β/Smad通路有關(guān)。

越來越多的研究表明MSC-EXO可減輕損傷肝細胞的氧化應激狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)氧化應激誘導的細胞凋亡。研究人員［32］在CCl4誘導的小鼠肝損傷中比較了hUC-MSCEXO與保肝劑（聯(lián)芬雙酯）的抗氧化作用，結(jié)果顯示，hUCMSC-EXO具有更明顯的抗氧化和保肝作用。更重要的是，hUC-MSC-Ex可通過調(diào)節(jié)多條信號通路改善氧化應激，如在CCl4和H2O2誘導的肝損傷模型中，hUC-MSC-Ex可通過上調(diào)ERK1/2和Bcl-2及下調(diào)IκB激酶B/NF-κB/胱天蛋白酶-9/-3途徑，并輸送谷胱甘肽過氧化物酶1以改善氧化應激誘導的細胞凋亡［33］。

2.5 免疫調(diào)節(jié)作用 免疫失衡是肝損傷重要的發(fā)病機制。在炎癥組織部位，MSC可以直接影響先天和適應性免疫細胞的浸潤和活性，誘導肝組織修復和再生。一項刀豆球蛋白A誘導的急性肝損傷小鼠模型的研究［34］表明，扁桃體MSC通過抑制淋巴細胞、樹突狀細胞和Kupffer細胞的浸潤，降低損傷小鼠血清炎癥因子（TNF-α、TNF-γ和IL-4）水平，并增加肝保護因子IL-10的血清水平。Wang等［35］證實骨髓MSC分泌的前列腺素E2可誘導巨噬細胞從M1（促炎）向M2（抗炎）表型極化，減少促炎因子的釋放，抑制D-GaIN/LPS誘導的肝臟炎癥反應和肝細胞凋亡。骨髓MSC還可通過下調(diào)肝臟自然殺傷T淋巴細胞中的IL-17及增加產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性自然殺傷T淋巴細胞數(shù)量減弱CCl4誘導的急性肝衰竭［36］。此外，MSC還可通過抑制中性粒細胞的募集和活性，改善D-GalN/LPS誘導的大鼠肝功能，降低病死率［37］。MSC對適應性免疫細胞（如T淋巴細胞或B淋巴細胞）的增殖和活化作用也被研究所證實［38］。

MSC-EXO也參與DILI的免疫調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)IL-6預處理可顯著上調(diào)hUC-MSC-EXO中miR-455-3p的水平，這些外泌體通過下調(diào)靶基因PIK3r1，抑制巨噬細胞活化。在小鼠內(nèi)毒素血癥和化學性肝損傷模型中，過表達miR-455-3p可減輕肝損傷、減少巨噬細胞浸潤及血清炎癥因子水平，改善肝損傷［39］。小鼠骨髓MSC-EXO可通過減弱Kupffer細胞M1型極化，減輕肝臟炎癥反應，促進CCl4誘導的體內(nèi)外肝組織修復［40］。由此可見，MSC和MSCEXO均可通過免疫調(diào)節(jié)作用，有效抑制促炎免疫細胞的活化及促炎細胞因子分泌，阻斷免疫反應的級聯(lián)活性，恢復肝臟免疫穩(wěn)態(tài)。

3 MSC-EXO移植治療其他肝臟疾病的作用機制

MSC-EXO除了在DILI中具有保護作用，在其他肝病中也發(fā)揮重要作用。如在CCl4誘導的肝纖維化小鼠中，hUC-MSC-EXO通過遞送miR-148a靶向巨噬細胞中的Kruppel樣因子6/信號轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄激活因子3途徑發(fā)揮抗纖維化作用［41］。在非酒精性脂肪性肝炎動物和細胞模型中，hUC-MSC-EXO被證實可通過減少細胞脂質(zhì)沉積，減輕肝損傷［42］。在缺血/再灌注肝損傷模型中，人誘導多能干細胞來源MSC-EXO通過抑制炎癥細胞的浸潤、減少炎癥因子的釋放、改善氧化應激，減輕肝細胞壞死和凋亡［43］。近年來，MSC-EXO對腫瘤的作用一直是研究熱點，其在肝癌治療中展現(xiàn)出“雙刃劍”作用，一方面可抑制腫瘤生長，另一方面也可促進腫瘤的生長和遷移［44］。

4 MSC及其外泌體在疾病治療中的局限與挑戰(zhàn)

如上所述，MSC移植在體內(nèi)外實驗中均可有效減輕肝損傷，但研究［45］表明，MSC在受損組織區(qū)域的存活率低，移植潛力低和潛在的致瘤性也限制了其在組織修復中的有效性。此外，MSC在接受體外預處理（如化學試劑、缺氧或炎癥）后可增加療效，但這些因素的適用劑量及是否會對MSC產(chǎn)生不利影響尚不清楚［46］。MSC-EXO在疾病的治療中顯示出良好的應用前景，但也存在很多挑戰(zhàn)：（1）尚無統(tǒng)一的分離、純化技術(shù)來獲得外泌體；（2）分離的外泌體其儲存以及運輸條件的系統(tǒng)標準和方案尚未建立；（3）外泌體注射的最佳劑量和注射頻率尚不確定；（4）外泌體來源多樣、成分復雜，目前尚無法確定改善DILI的具體物質(zhì)；（5）大多數(shù)研究都是短期的，長期治療效果未知。綜上，雖然MSC-EXO在再生醫(yī)學方面理論上優(yōu)于MSC，但仍需要更多的臨床前實驗和基礎(chǔ)研究來克服外泌體在治療應用中的局限性。

圖1 MSC及MSC-EXO移植治療DILI的作用機制Figure 1 The mechanism of MSC and MSC-EXO transplantation in the treatment of DILI

5 小結(jié)與展望

MSC-EXO作為無細胞療法，為DILI提供了一類有效的治療方法，為改善肝損傷、逆轉(zhuǎn)肝衰竭和改善預后提供了新的方向。盡管臨床前研究中的絕大多數(shù)陽性結(jié)果尚未轉(zhuǎn)化為臨床療效，相信隨著相關(guān)技術(shù)的日益成熟，MSC-EXO背后分子機制不斷深入研究，MSC-EXO的治療潛力可以得到充分發(fā)揮。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：邢國靜負責課題設計，撰寫論文；王麗菲、羅龍龍、王順娜、鄭曉鳳參與修改論文；盧利霞、張久聰負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。