梁子晗， 李佳輝， 程爽， 袁卓雅， 榮文雅， 劉亞杰， 郝玉潔， 王睿林

1 河南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院， 鄭州 450000

2 南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院， 廣州 510405

3 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心中醫(yī)肝病科， 北京 100039

藥物性肝損傷（DILI）是指由各類處方或非處方的化學藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥、天然藥、保健品、膳食補充劑及其代謝產(chǎn)物乃至輔料等所誘發(fā)的肝損傷［1］，較于其他肝損傷缺乏明顯的特異性，具有潛在肝毒性，嚴重時可發(fā)展為肝衰竭甚至死亡。其中由中草藥誘發(fā)的肝損傷具有臨床使用廣泛、潛伏期長、發(fā)病隱匿、診斷困難、機制復雜、難以預測等特點，占亞洲國家所有DILI發(fā)病率的25%［2］，是醫(yī)學界逐漸關注的重點問題。

中草藥在我國已有上千年的應用史，自近代以來隨著中草藥致毒性事件頻發(fā)，如何解決中草藥毒性問題迫在眉睫。何首烏（polygonum multiflorum thunb，PM）作為傳統(tǒng)常用補益類中草藥，具有解毒、截瘧、潤腸通便的功效，經(jīng)過炮制后可補肝腎、強筋骨、益精血、烏須發(fā)、化濁降脂，臨床廣泛用于治療高脂血癥、神經(jīng)衰弱、老年癡呆、骨關節(jié)炎等疾病。研究［3］發(fā)現(xiàn)，PM主要含有二苯乙烯類、羥基蒽醌類衍生物、黃酮類、磷脂類等化合物，同時這些活性成分也具有潛在的肝毒性，如大黃素、二苯乙烯苷（TSG）、大黃酸等。繼1988年PM引起肝毒性事件被首次報道后，美國、英國等國家也陸續(xù)出現(xiàn)服用PM導致肝損傷病例［4］，此后多國發(fā)布PM及相關制劑警告及監(jiān)管通告。因此，如何安全合理使用PM以減少和避免肝損傷發(fā)生是一項重要的臨床問題。

1 PM致DILI機制簡述

PM誘導的肝損傷（PM-DILI）以特異質(zhì)型藥物性肝損傷（IDILI）為主，但并不排除高劑量給藥時誘發(fā)的直接肝毒性作用，其病理特征以肝細胞損傷型最為常見，其次是膽汁淤積型和混合型［5］。PM-DILI機制主要通過破壞線粒體功能，誘發(fā)免疫應激及氧化應激反應，改變膽汁酸穩(wěn)態(tài)，干擾細胞色素P450酶（CYP450）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）等相關代謝酶的表達等途徑最終導致肝細胞死亡［6］。肝細胞死亡是PM-DILI的起始事件，主要包括凋亡、壞死、自噬等途徑，其中壞死與凋亡是當前研究的主要熱點。PM及其代謝產(chǎn)物作用于機體所激活的促死亡與抗死亡相關信號通路的平衡，決定著肝細胞死亡事件是否發(fā)生以及肝細胞損傷程度［7］。多種信號通路在PM-DILI發(fā)病過程中扮演著重要角色，并可能成為PM引起肝損傷的潛在治療靶點。

2 PM通過線粒體相關信號通路致DILI機制

2.1 線粒體參與肝細胞死亡 線粒體作為細菌來源的細胞器，由圍繞基質(zhì)的兩層膜組成，含有酶和線粒體DNA，是三磷酸腺苷（ATP）的主要部位，參與真核細胞的能量產(chǎn)生、代謝和凋亡，在調(diào)節(jié)各種藥物誘導的肝細胞死亡中起核心作用［8］。線粒體毒性是導致DILI的主要機制之一，藥物及其代謝產(chǎn)物經(jīng)過多種化學反應，誘導細胞內(nèi)應激，激活線粒體觸發(fā)細胞死亡的外在與內(nèi)在途徑，通過相關信號影響B(tài)cl2家族成員的平衡，如促凋亡（Bax、Bak）、抗凋亡（Bcl2、BclxL），進而影響線粒體的通透性［9］（圖1）。死亡受體激活或細胞應激使肝臟線粒體通透性轉變（MPT），線粒體去極化，并導致ATP的嚴重消耗、細胞色素C釋放、半胱天冬酶活化從而調(diào)節(jié)細胞程序性死亡［7］。由此可知，MPT在線粒體介導細胞死亡中發(fā)揮關鍵作用。藥物及其代謝化合物積聚在線粒體，通過改變電子傳遞復合物的氧化還原狀態(tài)，或與這些復合物中的蛋白質(zhì)共價結合，共同導致電子流中斷促進活性氧（ROS）的產(chǎn)生，進一步損害呼吸鏈，導致更多的ROS產(chǎn)生，當ROS達到一定閾值時，激活關鍵的c-Jun N端激酶（JNK）信號通路，同時導致MPT［7］。由此可見，藥物及其代謝產(chǎn)物作用于線粒體通過抑制其呼吸鏈、增加ROS以及MPT最終導致DILI的發(fā)生（圖2）。

圖1 線粒體介導的細胞死亡機制［9］Figure 1 Mitochondria-mediated cellular death mechanism［9］

圖2 線粒體介導的DILI機制［7］Figure 2 Mechanism of mitochondria-mediated DILI［7］

2.2 JNK信號通路 JNK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶蛋白家族成員，主要由細胞因子和環(huán)境應激激活，參與細胞增殖、分化、發(fā)育、炎癥反應與凋亡［10］。線粒體是JNK促凋亡信號傳導的主要靶點，Han等［7］研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路介導線粒體在對乙酰氨基酚誘導的DILI中起重要作用。在肝毒性劑量下，對乙酰氨基酚及代謝產(chǎn)物與線粒體中的谷胱甘肽（GSH）和蛋白質(zhì)共價結合，導致肝細胞發(fā)生劇烈的氧化還原變化，GSH過氧化物酶消耗GSH解毒導致線粒體中H2O2釋放增加，H2O2是ROS最主要成分，其含量的增加是細胞質(zhì)中JNK活化的關鍵因素。JNK激活后可易位到線粒體，誘導MPT的發(fā)生及細胞色素C、凋亡誘導因子等凋亡因子的釋放，抑制線粒體生物能量產(chǎn)生，從而促進肝細胞壞死與凋亡［7］。JNK激活后，本身也可通過線粒體ROS生成，增加導致細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1的激活，從而實現(xiàn)自我放大、自身激活。與此同時，JNK還可以直接參與Bcl-2家族成員的調(diào)控，如激活Bax、使Bcl-xl失活［11］。研究［12］發(fā)現(xiàn)，PM可降低肝線粒體琥珀酸脫氫酶活力和呼吸鏈復合物Ⅰ活性，影響還原型輔酶Ⅰ呼吸鏈功能，導致細胞代謝障礙，從而增加ROS生成，激活JNK；此外，PM可調(diào)控Fas/FasL死亡受體通路，上調(diào)促凋亡因子Bax表達，下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2表達，影響肝臟線粒體的通透性。Lin等［13］研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可通過抑制線粒體呼吸鏈復合物功能，影響氧化磷酸化途徑，導致ROS生產(chǎn)增加，隨后激活JNK，誘導肝細胞死亡。研究［14-15］發(fā)現(xiàn)，PM可降低肝細胞中GSH水平，提高ROS含量，增強JNK表達水平。以上研究提示，PM可能通過影響線粒體呼吸鏈功能，改變線粒體通透性，消耗GSH，增加ROS含量，激活JNK信號通路，從而誘導DILI的發(fā)生。

2.3 ROS/ATM/P53通路 毛細血管擴張性共濟失調(diào)突變基因（ATM）編碼的蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在DNA雙鏈斷裂時被激活，通過磷酸化參與DNA修復和細胞周期控制的關鍵底物來響應DNA損傷［16］。P53作為腫瘤抑制基因，參與調(diào)節(jié)細胞周期檢查點、細胞凋亡、衰老、DNA修復，維持基因組完整性和控制血管生成［17］。Lai等［18］研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可觸發(fā)ROS產(chǎn)生并破壞線粒體膜電位，使ATM在Ser1981位點磷酸化激活，伴隨著P53在Ser15位點磷酸化激活，Bax表達增強，通過線粒體介導細胞色素C釋放誘導細胞凋亡。Bounda等［19］研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸通過線粒體途徑誘導細胞凋亡的機制與上述過程相似。以上研究提示，PM活性成分可能通過激活ATM、P53，增強Bax的表達，通過線粒體介導與其他危險因素共同參與DILI的發(fā)生。

3 PM通過法尼醇X受體（FXR）相關信號通路致DILI機制

3.1 FXR維護膽汁穩(wěn)態(tài) FXR作為一種膽汁酸激活的轉錄因子，可感知膽汁酸水平，對維護膽汁酸穩(wěn)態(tài)至關重要。當膽汁酸水平升高時，F(xiàn)XR將被激活，誘導抑制肝細胞膽汁酸生物合成的程序［20］。膽汁酸是FXR的生理配體，F(xiàn)XR與膽汁酸結合后，可抑制膽汁酸合成中的限速酶細胞色素P450家族成員7A1（CYP7A1），同時激活回腸膽汁酸轉運蛋白，膽汁酸通過與FXR結合的方式調(diào)節(jié)自身的合成和運輸。與此同時，F(xiàn)XR還可以調(diào)節(jié)膽鹽輸出泵（BSEP）、肝臟多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）、鈉牛磺膽酸共轉運多肽（NTCP）等相關基因，調(diào)控膽汁酸的攝取、轉運與排泄［21］（圖3）。Sinal等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在飲食中添加1%的膽酸會導致FXR基因敲除小鼠血清膽汁酸水平升高約8倍。由此可見，F(xiàn)XR信號在膽汁淤積性肝損傷中發(fā)揮重要的保護作用。

圖3 FXR維護膽汁穩(wěn)態(tài)機制Figure 3 Mechanism of FXR-maintained bile homeostasis

3.2 腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/FXR通路 AMPK是一種能量傳感器蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細胞能量代謝中起關鍵作用，是FXR轉錄活性的負調(diào)節(jié)因子，BSEP作為FXR的直接靶基因，由FXR激活，是人類主要的管狀膽鹽出口泵，通過以膽鹽依賴性方式調(diào)節(jié)膽汁脂質(zhì)分泌［23］。Li等［24］研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過激活AMPK來加重α-萘基異硫氰酸鹽（ANIT）誘導的膽汁淤積，同時抑制FXR表達。Lien等［25］發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸通過抑制AMPK減輕雌激素誘導的膽汁淤積。大黃素是已知的AMPK激活劑，PM大黃素可通過AMPK抑制FXR的激活，下調(diào)BSEP等相關基因表達，加重膽汁淤積［26］。孫萌等［27］發(fā)現(xiàn)PM TSG呈劑量依賴性下調(diào)FXR表達，并抑制下游靶點BSEP、CYP7B1的表達。以上研究提示，PM活性成分可能通過激活AMPK，抑制FXR，減少BSEP，下調(diào)CYP7B1表達，從而具有誘導肝內(nèi)膽汁淤積加重肝細胞損傷的潛在風險。

3.3 FXR/小異二聚體伴侶（SHP）通路 孤兒核受體SHP是膽汁酸的關鍵調(diào)節(jié)因子，其被FXR誘導激活后與孤兒核受體肝受體同系物-1結合，可抑制CYP7A1的表達，從而減少膽汁酸的生成，維護膽汁穩(wěn)態(tài)［28］。此外，人成纖維細胞生長因子19（FGF19）的磷酸化可顯著增強SHP的基因功能，F(xiàn)GF19是FGFR4的高親和力肝素依賴性配體，被FXR激活后，通過肝腸循環(huán)從回腸分泌到肝臟，結合并激活FGFR4受體，與β-Klotho組成復合物，進一步激活SHP等信號通路，共同抑制CYP7A1的表達［29］。由此可見，F(xiàn)XR/SHP信號通路在調(diào)控肝腸循環(huán)膽汁酸水平中發(fā)揮著重要作用。Zhang等［30］研究發(fā)現(xiàn)，PM可通過FXR/SHP通路誘導IDILI的發(fā)生。Dai等［31］、韓宗萍等［32］研究發(fā)現(xiàn)PM可抑制FXR的表達，下調(diào)SHP、CYP7A1的表達。Sun等［33］研究發(fā)現(xiàn)PM TSG可抑制FXR激活，下調(diào)SHP表達，干擾膽汁酸合成的替代途徑，加重膽汁淤積。以上研究提示，PM可能通過抑制FXR/SHP信號通路導致膽汁淤積造成肝細胞損傷。

4 PM通過Toll樣受體4（TLR4）相關信號通路致DILI機制

4.1 TLR4參與免疫應激調(diào)控 TLR4是一種Ⅰ型跨膜蛋白，在識別病原體和激活先天免疫中起關鍵作用，主要在抗原呈遞細胞（如巨噬細胞等）上表達，細菌脂多糖（LPS）是其主要配體［34］。LPS是免疫系統(tǒng)中強有效的誘導劑，肝臟受損后其水平明顯增加，與TLR4結合后可通過髓樣細胞分化因子88（MyD88）依賴途徑和MyD88非依賴途徑進行信號傳導，增加炎性介質(zhì)的釋放，并激活機體免疫炎癥反應［35］。研究表明，LPS介導的TLR4通路在肝損傷過程中發(fā)揮重要作用。

4.2 TLR4/MyD88/核因子κB（NF-κB）通路 MyD88作為一種胞質(zhì)適配器蛋白，在先天性和適應性免疫反應中起核心作用，是TLR4和IL-1受體（IL-1R）的關鍵下游靶點蛋白［36］。TLR4與LPS結合后，發(fā)生二聚化，并傳導至胞內(nèi)，與MyD88相互作用，結合并磷酸化IL-1R相關激酶，隨后激活腫瘤壞死因子α受體相關因子6（TRAF6），進而激活NF-κB誘導激酶，使IκB激酶磷酸化，IκB泛素化降解后釋放NF-κB進入細胞核，引起TNF-α、IL-1?、IL-6等相關炎癥介質(zhì)的釋放，最終導致組織、器官的炎癥與損傷［37］。謝麗華等［38］研究表明經(jīng)LPS誘導后，PM醇提液可上調(diào)mTLR4表達，影響MyD88及下游通路的表達，且不呈劑量依賴性。潘韻錚等［39］發(fā)現(xiàn)LPS與順式TSG聯(lián)合應用可顯著增強肝臟TLR4、MyD88、NF-κB的表達，提高血液中IL-1β、TNF-α等炎性因子的水平。Long等［40］研究發(fā)現(xiàn)，PM可激活TLR4，選擇性上調(diào)MyD88表達，誘導下游NF-κB信號通路。另有研究［41］發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB通路是順式TSG導致IDILI的重要基因通路。以上研究提示，PM可能經(jīng)LPS誘導激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，參與機體免疫應激，導致IDILI的發(fā)生。

4.3 TLR4/β干擾素TIR結構域銜接蛋白（TRIF）/干擾素調(diào)節(jié)因子-3（IRF-3）通路 TRIF作為Toll/IL-1受體同源結構域的銜接蛋白，過表達時可激活NF-κB，是比MyD88更有效的IFN-β誘導劑，在LPS激活IRF3和誘導IFN-β中起關鍵作用。TRIF與TLR4被相關橋接分子（如易位關聯(lián)膜蛋白62、TLR銜接分子-2等）連接，共同導致IRF3易位到細胞核，通過TRAF6相關途徑激活NF-κB［42］。毛宏梅等［43］、謝麗華［38］研究發(fā)現(xiàn)PM醇提液經(jīng)LPS誘導可顯著提高肝細胞TLR4、TRIF和IRF-3 mRNA和蛋白表達水平。由此可見TLR4/TRIF/IRF-3信號通路可能是LPS介導PM致IDILI作用機制之一。

5 PM通過PRKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）/轉錄激活因子4（ATF4）/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）通路致DILI機制

肝臟暴露于生物和化學刺激時需要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、自噬與氧化還原應激來維持自身細胞與組織穩(wěn)態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+儲存及穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)折疊加工。當機體受到外界因素刺激發(fā)生氧化應激、炎癥、鈣代謝紊亂等事件后，導致錯誤折疊與未折疊蛋白質(zhì)蓄積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細胞內(nèi)平衡紊亂引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，通過轉錄因子如CHOP等途徑誘導細胞自噬與凋亡［44］。研究［45-46］發(fā)現(xiàn)，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡與肝臟疾病的發(fā)生密切相關。PRKR是Ⅰ型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，參與綜合應激反應和未折疊蛋白反應。當發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激后，激活PERK，磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α），隨之激活ATF4，導致CHOP過度表達，通過增加p-eIF2α去磷酸化、提高Bax水平、加強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化酶1α表達、抑制抗凋亡蛋白激酶B活化等途徑促進細胞凋亡［47］。研究［48］發(fā)現(xiàn)，PM大黃素經(jīng)代謝酶活化后可產(chǎn)生肝毒性更強的5-羥基大黃素，其可通過破壞L02細胞線粒體結構和功能，增加ROS產(chǎn)生，致使胞內(nèi)Ca2+超載從而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PERK/ATF4/CHOP信號通路，從而增加DILI發(fā)生風險。

6 PM通過過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARγ）信號通路致DILI機制

PPARγ是脂肪細胞分化的調(diào)節(jié)劑，主要分布在肝臟與脂肪細胞中，參與脂質(zhì)和葡萄糖代謝、細胞增殖和凋亡以及免疫調(diào)節(jié)［49］。Li等［50］研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激活后可通過增強IκB-α表達，減少NF-κB核易位，降低NF-κB的DNA結合活性，從而減少細胞因子的產(chǎn)生和組織損傷。研究［51］表明，經(jīng)LPS/順式TSG處理的大鼠，p65水平升高，IκB-α和PPARγ表達降低，且PPARγ通路與LPS/順式-SG誘導的肝損傷呈負相關，加用吡格列酮（PPARγ受體激動劑）處理后可增加PPARγ和IκB-α的蛋白質(zhì)水平。Meng等［52］研究發(fā)現(xiàn)，PM順式TSG可下調(diào)PPARγ表達，激活NF-κB信號通路，增加TNF-α、IL-6等促炎細胞因子誘導IDILI的發(fā)生。以上研究提示，PM可能通過抑制PPARγ相關信號通誘導IDILI的發(fā)生發(fā)展。

7 PM通過其他相關通路致DILI機制

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構成二聚體，當其與生長因子受體結合后，可活化絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt），隨后激活或抑制相關下游蛋白（如Caspase-9），從而發(fā)揮促細胞生存、增殖并抑制細胞凋亡及調(diào)控葡萄糖代謝等作用［53］。研究［54］發(fā)現(xiàn)，PM可通過降低轉運蛋白溶質(zhì)載體家族16成員2表達致使PI3K/Akt信號通路無法順利激活，進而導致促凋亡蛋白及因子（如P53蛋白、Caspase-9）無法被抑制而導致肝細胞凋亡。核因子紅細胞2相關因子2（Nrf2）/Kelch樣ECH關聯(lián)蛋白1（Keap1）信號通路是一種細胞內(nèi)防御機制，參與細胞抵消氧化應激，而PM在致死毒性劑量下可抑制肝細胞Nrf2信號通路［55］；Gonzalez等［56］研究發(fā)現(xiàn)CYP2E1可激活CHCl3、CCl4等具有肝毒性的化學物質(zhì)，產(chǎn)生ROS導致肝細胞毒性加重。汪美汐等［57］研究發(fā)現(xiàn)PM大黃素可誘導CYP450酶如CYP2E1的上調(diào)。UDP葡糖醛酸基轉移酶1家族多肽A1（UGT1A1）是目前發(fā)現(xiàn)唯一可代謝膽紅素的酶，其功能受損會導致膽紅素蓄積進而引發(fā)肝毒性。據(jù)報道［58］，NF-κB的激活可抑制UGT1A1的表達，從而加重炎癥過程中的高膽紅素血癥。微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3（LC3）、泛素結合蛋白P62是自噬過程中的關鍵蛋白。PM可通過影響LC3、P62蛋白的表達，增加肝細胞自噬，導致肝損傷［59］。綜上所述，PM可能通過抑制PI3K/Akt、Nrf2信號通路，下調(diào)UGT1A1表達，上調(diào)CYP2E1表達，影響LC3、P62蛋白表達，誘導DILI發(fā)生。

8 小結

PM通過調(diào)控JNK、ROS/ATM/P53通路改變線粒體通透性破壞線粒體功能、介導AMPK/FXR、FXR/SHP通路加重膽汁淤積、參與TLR4/MyD88/NF-κB、TLR4/TRIF/IRF-3通路誘導免疫應激、激活PERK/ATF4/CHOP通路誘發(fā)ERs、抑制PPARγ、PI3K/Akt、Nrf2/Keap1通路加重炎癥反應與氧化應激等多種途徑協(xié)同作用共同導致肝細胞死亡，多靶點、多途徑、多層次誘導DILI的發(fā)生發(fā)展（圖4）。

圖4 PM致DILI信號通路Figure 4 Signaling pathways of polygonum multiflorum-induced DILI

PM致肝毒性信號通路仍有待更多研究探索，如高劑量的PM可引起氨基酸、脂質(zhì)和能量的代謝紊亂，導致三羧酸循環(huán)功能障礙，其中涉及哪些信號通路；P53信號通路在調(diào)節(jié)細胞鐵死亡中發(fā)揮著重要作用，PM調(diào)控的ROS/ATM/P53通路與肝細胞鐵死亡有何關系；PM是否通過其他相關通路調(diào)控肝細胞死亡等等。深入剖析不同信號通路之間的作用機制，有助于在臨床使用PM時通過調(diào)節(jié)相關通路的激活或抑制降低其肝毒性發(fā)生風險，為防治PM致DILI提供潛在作用靶點。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：梁子晗負責課題設計，資料分析，撰寫論文；李佳輝、程爽、袁卓雅、榮文雅、劉亞杰、郝玉潔參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；王睿林負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。