王知意， 楊廣越， 張瑋， 浦婭瓊， 趙鑫， 馬文婷，， 劉旭凌，， 吳柳，， 陶樂，， 劉成

上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院 a.肝病實驗室， b.中心實驗室， c.感染科， 上海 200062

肝纖維化是由多種病因引起的慢性、進行性、彌漫性肝病，其主要病理特征是肝內細胞外基質過度增生與異常沉積所導致的肝臟結構和/或功能異常改變，持續(xù)進展可形成肝硬化，引起門靜脈高壓等并發(fā)癥［1］。肝星狀細胞（HSC）是肝纖維化發(fā)生的細胞學基礎，抑制HSC活化是抗肝纖維化的重要步驟［2］，然而抑制HSC活化的藥物仍難走向臨床［3］，提示需要從新的角度探索HSC活化機制。

平足蛋白（podoplanin，PDPN）是一種特異于淋巴系統(tǒng)的黏蛋白型跨膜糖蛋白，在多種腫瘤中均有表達，被認為是腫瘤的標志物［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，PDPN可能通過基質金屬蛋白酶控制甲狀腺乳頭狀癌細胞侵襲與遷移。然而PDPN在肝纖維化中的表達及功能罕見報道。本研究以PDPN在肝纖維化中的表達為切入點，探究PDPN對HSC活化的作用，為肝纖維化治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選取2019年9月—2022年6月首次就診于本院感染科的慢性乙型肝炎患者75例，收集患者性別、年齡等基本信息，記錄患者生化指標檢測結果，入院后患者簽署肝穿刺知情同意書，病理分期由本院病理科鑒定報告。

1.2 動物及造模 12只雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質量（20±2）g，購自上海斯貝福公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010］，飼養(yǎng)于本院實驗動物中心［動物使用許可證號：SYXK（滬）2019-0020］，飼養(yǎng)室溫度（22±1）℃，相對濕度30%～60%，12 h光照/12 h黑暗，自由進食和飲水，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常組和模型組，每組各6只。模型組小鼠腹腔注射10% CCl4，0.04 mL/只，每周3次；正常組小鼠注射等體積橄欖油。6周后，各組小鼠禁食不禁水12 h，麻醉小鼠，下腔靜脈采血，取出肝組織固定于10%福爾馬林進行后續(xù)實驗。

1.3 試劑與儀器 PDPN蛋白購自R&D公司，貨號3670-PL；Trizol購自Takara，貨號9190；逆轉錄試劑盒購自Takara，貨號RR037A；SYBR購自Takara，貨號RR420；PDPN抗體購自Abcam公司，貨號ab128994和ab11936；BAY11-7082購自碧云天，貨號S1523；CCl4購自上海凌峰公司，貨號051025；免疫組化二抗（貨號BA-1000）及ABC-HRP（貨號6100）試劑均購自Vector；DAB購自中杉金橋，貨號ZLI-9018；天狼星紅染液由上海中醫(yī)藥大學劉平教授課題組饋贈；鏈酶蛋白酶購自Roche，貨號9036-06-0；Ⅳ型膠原酶購自Sigma-Aldrich，貨號V900893；透明質酸酶購自Sangon Biotech，貨號I621BC0413；DNase購自Sigma-Aldrich，貨號SLBF7798V；Nycodenz購自Alere Technologies AS，貨號1002424；Percoll購自上海羿圣生物，貨號40501ES60。FBS購自Gibco，貨號10270-106；實時熒光定量PCR儀購自ABI，型號VIIA 7 DX；多功能酶標儀購自Thermo Varioskan，型號LUX；離心機購自Thermo，型號5804R。病理脫水、包埋等設備均購自Leica公司，具體如下：半自動輪轉式切片機（型號RM2245）、自動脫水機（型號TP1020）、包埋機（型號EG1150H）、全自動染色機（型號ST5010）、自動封片機（型號CV5030）、熒光顯微鏡（購自Olympus，型號BX43）。

1.4 小鼠肝臟原代細胞分離 小鼠肝竇內皮細胞（LSEC）、HSC、Kupffer細胞、肝內膽管細胞（BEC）、肝細胞分離及培養(yǎng)方法參照課題組已發(fā)表文獻［1］。

1.5 細胞培養(yǎng)及處理 小鼠原代HSC（DMEN-10% FBS）培養(yǎng)于12孔板，培養(yǎng)48 h后，換液為無血清培養(yǎng)基，PDPN蛋白處理15 min（終濃度為100 ng/mL），NF-κB抑制劑（BAY11-7082）處理1 h（終濃度1 μmol/mL），收集細胞檢測炎癥因子基因表達。

1.6 肝組織病理染色 選取肝右側最厚一葉，10%中性福爾馬林固定，自動脫水機逐級脫水，包埋、4 μm切片。Leica全自動染色機進行HE染色，觀察組織學損傷。

天狼星紅染色：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗滌3次，滴加天狼星紅染色液，37 ℃孵育20 min，無水乙醇沖洗，晾干后封片。

免疫組化：石蠟切片首先脫蠟至水，再用EDTA抗原修復液＞95 ℃熱修復15 min后PBS洗3次，滴加H2O2滅活內源性過氧化物酶，使用BSA封閉后一抗4 ℃過夜，PBS洗3次，滴加對應二抗30 min，PBS洗凈后滴加A+B 30 min，PBS洗凈后用DAB顯色，蘇木素復染，無水乙醇脫水，二甲苯透明后封片。每組隨機100倍下拍5個視野，采用Image-Pro軟件統(tǒng)計陽性面積。

1.7 免疫印記 肝組織或細胞中加入含PMSF的RIPA裂解液，4 ℃，10 000 rpm，10 min離心后取上清。BCA法測定蛋白濃度，定量后加入Loading Buffer變性。取20 μg變性后的蛋白樣品至SDS-PAGE電泳，230 mA，1.5 h分離膠，再轉膜至PVDF膜，5% BSA封閉1 h，一抗（4 ℃）過夜孵育，二抗60 min室溫孵育，洗凈后顯影收集圖片。

1.8 實時定量PCR（RT-PCR） Trizol法提取肝組織和/或細胞總RNA，測定濃度后逆轉錄［Takara逆轉錄試劑盒（Cat：RR037A）］至cDNA，RT-PCR采用ABIViiA? 7 Dx儀器檢測相關引物，引物序列見表1，結束采用2-ΔΔCT法分析計算相關指標的基因相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The RT-PCR primer sequences

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，2組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。兩組數(shù)據(jù)相關性分析采用Spearman相關性分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PDPN在肝纖維化患者肝組織中上調并與肝纖維化分期呈顯著正相關 慢性乙型肝炎患者肝活檢HE染色表明：S0期肝組織正常，S4期肝組織纖維增生、炎性浸潤明顯（圖1a）。采用同患者的免疫組化檢測PDPN表達，發(fā)現(xiàn)S0期肝組織PDPN表達呈弱陽性，S4期患者陽性分布于肝竇，表達顯著升高（t=8.892，P=0.001）（圖1b）。為了進一步衡量PDPN表達與肝纖維化分期的關系，檢測75例患者PDPN的mRNA表達，結果表明，PDPN mRNA在正常肝臟中表達較低，在S3、S4期肝臟中表達顯著升高，與正常組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.001）（圖1c）。相關性分析結果表明，PDPN mRNA表達與肝纖維化分期顯著正相關（r=0.655，P＜0.001）（圖1d）。

圖1 PDPN在臨床肝活檢樣本中的表達Figure 1 The expression of PDPN mRNA in liver biopsy tissue

2.2 PDPN表達在肝纖維化小鼠肝組織中升高 HE染色結果顯示：正常組小鼠肝組織正常，小葉結構清晰，炎性浸潤較少；模型組小鼠肝小葉中央靜脈偏離，炎性浸潤，脂肪變等病變。天狼星紅染色結果顯示：正常組小鼠組肝臟匯管區(qū)和中央靜脈壁有少量膠原纖維著色，模型組小鼠肝組織見增生的膠原纖維分割肝小葉形成纖維間隔，部分假小葉形成（圖2）。

圖2 兩組小鼠肝組織病理染色結果Figure 2 The pathological staining of liver tissue in two groups

正常組PDPN陽性在肝竇區(qū)表達相對較少，模型組肝組織中PDPN在主要集中在纖維間隔，表達顯著增加（P＜0.001）；提示肝纖維化進展中PDPN表達顯著增加，在纖維間隔中表達增多（表2）。

表2 CCl4模型中PDPN及其mRNA表達分析Table 2 Statistics of PDPN protein and mRNA expression in two groups

2.3 PDPN主要表達在LSEC 為明確PDPN在肝臟中的來源，分離了小鼠肝臟中各種類型的原代細胞，PTPCR檢測小鼠的肝細胞、LSEC、HSC、Kupffer細胞和BEC中PDPN的表達。結果表明，PDPN在LSEC中表達最高（圖3）。提示肝臟PDPN主要來源于LSEC。

圖3 小鼠肝臟各類型細胞中PDPN mRNA相對表達Figure 3 Relative expression of PDPN mRNA in various types of mouse liver cells

2.4 PDPN促進HSC活化相關通路 PDPN（100 ng/mL）處理原代小鼠HSC 15 min，RT-PCR檢測炎癥相關因子TNF-α、CCL3、CXCL1和CXCR1的mRNA表達，與對照組（PBS）相比，上述指標均顯著升高（P值均＜0.05），表明PDPN可促進HSC活化。BAY11-7082（NF-κB信號抑制劑）處理后，上述炎癥指標水平均明顯下降（P值均＜0.05），表明在BAY11-7082處理HSC后，PDPN的促炎癥效果顯著降低（表3）。

表3 小鼠原代HSC中炎癥指標水平Table 3 Expression of inflammatory in mouse primary HSC

3 討論

肝纖維化是慢性肝損傷中的一個動態(tài)過程，各類慢性肝病和遺傳相關疾病等均可導致肝纖維化［6］。其特征是細胞外基質增生與降解失衡，最終導致肝硬化［7］?；罨腍SC是肝纖維化發(fā)生的細胞學基礎，靶向HSC藥物研究是目前的熱點和難點，但尚未在人體研究中突顯出療效［8］，這提示單方面將抗肝纖維化的研究聚焦在HSC上并不全面。

LSEC在維持肝內微循環(huán)穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用［9］，研究［10］發(fā)現(xiàn)LSEC與維持HSC靜止和支持肝臟再生有關，但研究LSEC致肝纖維化報道較少。PDPN是一種黏蛋白跨膜蛋白［11］。最近研究［12］表明，PDPN在惡性腫瘤中高表達，如鱗狀細胞癌、惡性間皮瘤，因此，PDPN也參與了腫瘤的形成和發(fā)展。另有研究［13］表明，PDPN在小鼠膽管結扎模型中表達升高，但PDPN參與肝纖維化進展的機制未見報道，本研究探討了PDPN在HSC活化和肝纖維化中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙型肝炎患者肝組織中PDPN的表達隨著肝纖維化分期的增加而升高，并且與肝纖維化分期呈顯著正相關，提示PDPN與肝纖維化進展密切相關。通過小鼠肝纖維化模型分析顯示，PDPN主要分布在肝竇，主要在纖維間隔表達升高，再次證實PDPN與肝纖維化進展相關。通過對人和小鼠肝臟原代細胞分析發(fā)現(xiàn)，與肝細胞、HSC、Kupffer細胞及BEC相比較，PDPN高表達于LSEC。通過小鼠原代HSC發(fā)現(xiàn)，PDPN可顯著誘導HSC炎癥表達，提示PDPN可誘導HSC活化，而抑制NF-κB信號，PDPN誘導HSC炎癥產(chǎn)生的能力顯著被抑制，提示PDPN通過NF-κB誘導HSC活化促進肝纖維化進展。

綜上所述，肝纖維化進展中，PDPN顯著升高，肝臟中PDPN主要來源于LSEC，肝損傷后來源于LSEC的PDPN誘導NF-κB信號誘導HSC活化，促進肝纖維化進展。

倫理學聲明：臨床研究于2020年8月12日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院倫理委員會審批，批號：PTEC-2020-32（Y）-1，符合臨床研究倫理規(guī)范。動物實驗于2022年6月30日由上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批，批號：QWEC-A-202206008，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：王知意、楊廣越、張瑋、趙鑫負責實驗操作及資料分析，撰寫論文；馬文婷、劉旭凌、吳柳、浦婭瓊參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉成、陶樂負責課題設計，指導撰寫文章并最后定稿。