劉平箕， 姚黎超， 胡雪， 王錚， 熊芷玉， 江應(yīng)安

武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科， 武漢 430060

肝纖維化表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)蛋白（如Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白）的過度沉積，是慢性病毒感染、酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎等慢性肝損傷的常見后遺癥，嚴重時可能導(dǎo)致肝硬化伴門靜脈高壓［1-2］。肝纖維化的特征是肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化和增殖，HSC是產(chǎn)生基質(zhì)的肌成纖維細胞的主要來源。靜態(tài)和儲存維生素A的HSC的纖維化激活可由來自肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞等細胞的細胞外信號介導(dǎo)［2］?；罨母涡菭罴毎╝HSC）在肝纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，誘導(dǎo)細胞凋亡以消耗aHSC的抗纖維化策略被寄予厚望，但目前仍缺乏被認可的臨床證據(jù)［3］。近幾十年來，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）治療已成為慢性肝病最有希望的治療方法之一［4］。MSC可來源于骨髓、臍帶和脂肪組織，臨床和實驗證據(jù)表明，MSC可通過自分泌或旁分泌多種免疫抑制因子、營養(yǎng)因子和外泌體，甚至分化為功能性肝細胞，發(fā)揮抗纖維化作用，并促進肝再生［5］。幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1（chitinase-3 like-protein-1，CHI3L1）是18-糖基水解酶家族成員，肝臟中高度富含CHI3L1，巨噬細胞、中性粒細胞和HSC等均可以表達CHI3L1［6］。研究［7］表明，血清CHI3L1可作為代償期肝硬化患者發(fā)生首次失代償事件風(fēng)險的有效預(yù)測因子，且在聯(lián)合Child-Pugh分級后具有更高的預(yù)測價值。但CHI3L1在肝纖維化中的具體作用及其是否與人臍帶MSC（human umbilical cord derived mesenchymal stem cell，hUC-MSC）的治療效應(yīng)相關(guān)尚不清楚，本實驗將對此研究探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取18只SPF級6周齡C57BL/6小鼠，小鼠由武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心試驗室提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK2019-0004，使用許可證號：SYXK2015-0027）并飼養(yǎng)于該實驗室，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用隨機數(shù)字表法隨機分為3組，分別為對照組、CCl4模型組（CCl4組）和hUCMSC治療組（MSC組），每組6只。以1 mg/kg CCl4腹腔注射構(gòu)建小鼠肝纖維化模型，CCl4以1∶9的比例溶于玉米油溶液中。CCl4組和MSC組每周腹腔注射10% CCl4溶液2次，連續(xù)注射8周，對照組同時注射相同劑量玉米油，MSC組在注射CCl4溶液的第7、8周經(jīng)尾靜脈注射hUCMSC（1×106個/只），每周注射2次。于第8周末采取小鼠血清，處死小鼠，取小鼠肝臟固定，每組選擇4只小鼠檢測血清，MSC組1只小鼠血清樣本不合格。

1.2 實驗試劑 CCl4和玉米油購于上海Sigma-Aldrich公司，Anti-CHI3L1和Anti-Bax一抗購于武漢Abclonal公司，Anti-GADPH一抗和山羊抗兔IgG HRP購于上海Absin公司，重組CHI3L1和TGF-β購于武漢Abclonal公司，Antiα-SMA一抗和熒光二抗購于上海Abcam公司。

1.3 細胞來源與培養(yǎng) hUC-MSC購于深圳茵冠生物科技有限公司，LX2（永生化的人源性HSC）購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心。hUC-MSC和LX2均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞匯合度達到80%時，以胰酶消化進行傳代，TGF-β干預(yù)LX2以獲得aHSC，Transwell小室用于hUC-MSC和LX2共培養(yǎng)，1.0×105的hUC-MSC接種于上室，1.0×105個HSC接種于下室，CHI3L1加入共培養(yǎng)體系中以探索MSC的作用機制，500 ng/mL的重組CHI3L1被證實能夠顯著促進HSC的增殖和激活［8］。共培養(yǎng)24 h后收集HSC用于Western Blot試驗。

1.4 研究方法

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α ELISA試劑套裝購于上海碧云天生物技術(shù)公司，按照說明書操作。用標準樣品制作標準曲線，將待測樣品加入酶標板中，室溫下孵育120 min，洗板后加入生物素化抗體室溫孵育60 min，洗板后加入HRP-Streptavidin室溫孵育20 min，洗板后加入TMB顯色劑室溫下避光孵育20 min，加入終止液后使用酶標儀檢測A450值。

1.4.2 生化指標檢測 獲取小鼠血清后，樣本送往武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科檢測ALT、AST、ALP。

1.4.3 免疫組織熒光染色 將石蠟切片放入二甲苯-梯度酒精脫蠟復(fù)水，在抗原修復(fù)緩沖液中進行抗原修復(fù)，隨后在山羊血清中進行封閉，封閉結(jié)束后在一抗中孵育過夜，隨后用二抗孵育，再用DAPI復(fù)染細胞核，最后以抗熒光淬滅劑封片。

1.4.4 病理染色 常規(guī)以二甲苯-梯度酒精對石蠟切片脫蠟復(fù)水，隨后進行蘇木素染液染細胞核和返藍試劑返藍，HE染色經(jīng)歷伊紅染液對細胞質(zhì)進行染色，Masson染色經(jīng)歷麗春紅染液-磷鉬酸溶液-苯胺藍染液處理，天狼星紅染色使用天狼星紅苦味酸染液染色，最后梯度酒精-二甲苯脫水透明并加入中性樹脂封片。

1.4.5 Western Blot試驗 用裂解緩沖液（武漢塞維爾生物公司）從組織（液氮研磨后）和細胞中提取蛋白質(zhì)，10% SDS-PAGE凝膠電泳用于分離蛋白，分離蛋白后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore，美國）上，然后在4 ℃冰箱中用一抗孵育過夜，隨后用二抗孵育1 h，曝光顯影儀（BIO-RAD，美國）用于顯示蛋白條帶，ImageJ v1.8.0用于蛋白條帶定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26.0和GraphPad Prism v9.0.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟病理結(jié)果比較 HE染色結(jié)果顯示，相較于對照組，CCl4組細胞排列混亂，細胞腫脹明顯，部分細胞的細胞核消失，匯管區(qū)大量炎癥細胞浸潤，正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞。經(jīng)過干預(yù)后，MSC組細胞腫脹和匯管區(qū)炎癥浸潤較CCl4組明顯改善（圖1a）。Masson染色結(jié)果顯示，被藍染的膠原纖維僅見于對照組的血管區(qū)，但可見于CCl4組的肝實質(zhì)；對照組僅在血管區(qū)可見被藍染的膠原纖維（圖1b）。天狼星紅染色結(jié)果顯示，CCl4組可見被紅染的膠原纖維較粗，且有連接匯管區(qū)的趨勢（圖1c）。經(jīng)過hUC-MSC干預(yù)后，MSC組肝實質(zhì)內(nèi)膠原纖維較CCl4組分布少（P＜0.05）（圖1d）。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理變化Figure 1 Pathological changes in liver tissue of mice in each group

2.2 hUC-MSC治療對肝纖維化小鼠炎癥指標的影響3組小鼠IL-1β、IL-6水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。CCl4組IL-1β、IL-6水平均較對照組升高（P值均＜0.05）；經(jīng)過hUC-MSC治療后，MSC組IL-6水平較CCl4組明顯降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各組小鼠血清炎癥因子表達水平比較Table 1 Serum inflammatory factors expression levels in mice of each group

2.3 hUC-MSC治療對肝纖維化小鼠肝功能指標的影響3組小鼠ALT、AST、ALP水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）。CCl4組ALT、AST和ALP水平均較對照組升高（P值均＜0.05）；經(jīng)過hUC-MSC治療后，MSC組ALT、AST和ALP水平均較CCl4組降低（P值均＜0.05）（表2）。

表2 各組小鼠血清ALT、AST、ALP水平比較Table 2 Serum ALT， AST， and ALP levels in mice of each group

2.4 hUC-MSC治療對肝纖維化小鼠aHSC表達的影響α-SMA是aHSC的標志［9］，α-SMA的免疫熒光結(jié)果顯示，CCl4組中α-SMA分布（紅色）較對照組增多（P＜0.000 1）；經(jīng)過hUC-MSC治療后，MSC組α-SMA分布較CCl4組減少（P＜0.000 1）（圖2）。

圖2 各組小鼠肝臟組織中α-SMA的表達（×200）Figure 2 Expression of α-SMA in liver tissue of mice in each group （×200）

2.5 hUC-MSC通過下調(diào)CHI3L1促進aHSC的凋亡Western Blot試驗結(jié)果顯示，CCl4組CHI3L1水平較對照組和MSC組均顯著升高（P值均＜0.05）（圖3a），升高趨勢與α-SMA分布一致，提示兩者具有關(guān)聯(lián)性。使用重組CHI3L1干預(yù)aHSC和MSC的共培養(yǎng)，并檢測其凋亡指標Bax，結(jié)果顯示，Bax在aHSC-MSC共培養(yǎng)組中的表達高于僅有aHSC的對照組和添加CHI3L1的aHSC-MSC共培養(yǎng)組（P值均＜0.05）（圖3b），提示CHI3L1逆轉(zhuǎn)了MSC對aHSC的促凋亡作用。未發(fā)現(xiàn)Bax在對照組、CCl4組和MSC組中存在明顯差異（P＞0.05）（圖3c）。

圖3 CHI3L1和Bax在各組小鼠中的表達水平比較Figure 3 Protein expression of CHI3L1 and Bax in each group

3 討論

MSC是一種經(jīng)典的多能干細胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［10］。目前，多項關(guān)于MSC治療肝臟疾病的研究正在開展，且部分研究已證實MSC療法的有效性和安全性［11］。MSC改善肝纖維化的作用機制復(fù)雜，其免疫調(diào)控功能主要體現(xiàn)在抑制自然殺傷細胞、促進巨噬細胞向M2極化、上調(diào)調(diào)節(jié)性T淋巴細胞等，此外，MSC可以通過分泌肝細胞生長因子、表皮生長因子等保護肝細胞［12］。骨髓源性MSC的外泌體還可通過促進肝細胞自噬，抑制D-半乳糖胺/脂多糖導(dǎo)致的肝細胞凋亡［13］。

HSC是肝纖維化過程中成纖維細胞的主要來源，在促纖維介質(zhì)和細胞因子的刺激下，HSC被激活并生成α-SMA和膠原蛋白，隨后導(dǎo)致基質(zhì)沉積和纖維化。研究［9］表明，攜帶新型環(huán)狀RNA（circDIDO1）的MSC外泌體可以通過抑制HSC激活，并促進其凋亡，緩解肝纖維化。本研究結(jié)果顯示，CCl4組小鼠肝臟中的α-SMA熒光信號明顯強于對照組和MSC組；將aHSC和MSC共培養(yǎng)，凋亡標志物Bax顯著高于獨立培養(yǎng)的aHSC組。上述結(jié)果提示MSC可促進aHSC的凋亡。對照組、CCl4組和MSC組中的Bax表達未見明顯差異，可能與MSC抑制肝臟其他細胞的凋亡相關(guān)［13］，MSC對不同細胞的選擇性調(diào)控可能消除了Bax的差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，MSC的治療作用可能與CHI3L1下調(diào)相關(guān)。CHI3L1可由多種細胞合成，且與包括HBV在內(nèi)的多種病因所致的肝硬化相關(guān)［6］。老年人群肝臟CHI3L1表達量高于年輕人群，且CHI3L1促進HSC的增殖和活化［8］。CHI3L1能夠抑制死亡受體Fas介導(dǎo)的嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞凋亡［14］，此外，CHI3L1可通過抑制Fas介導(dǎo)的巨噬細胞凋亡，進而加重肝纖維化［15］。本研究發(fā)現(xiàn)CHI3L1和α-SMA具有相同的下調(diào)趨勢，表明MSC對aHSC的促凋亡作用可能是經(jīng)CHI3L1實現(xiàn)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，重組CHI3L1逆轉(zhuǎn)了MSC對HSC的促凋亡作用，證實了CHI3L1的抑制細胞凋亡的作用，MSC治療可下調(diào)CHI3L1，從而促進aHSC凋亡，最終改善肝纖維化。

綜上所述，hUC-MSC可減輕肝纖維化小鼠的炎癥因子水平、纖維化程度及肝功能，作用機制可能與抑制CHI3L1進而促進HSC的凋亡相關(guān)。鑒于肝內(nèi)多種細胞均可表達CHI3L1，本研究未證明被調(diào)控的CHI3L1主要來源于哪種細胞，有待進一步研究探討。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2022年9月1日經(jīng)由武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會審批，批號：20220901A，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：劉平箕、姚黎超負責(zé)設(shè)計論文框架，起草論文；劉平箕、胡雪負責(zé)實驗操作，研究過程的實施；王錚、熊芷玉負責(zé)數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計學(xué)分析，繪制圖表；江應(yīng)安負責(zé)論文修改，擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。