李竹蓉， 陳晨， 郭地， 呂思學， 武嘉文， 楊娜， 劉楊

山西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院， 山西 晉中 030619

自身免疫性肝炎（AIH）是一種由自身抗體和自身反應性T淋巴細胞誘導的肝臟炎癥，其特點是循環(huán)自身抗體升高、高丙種球蛋白血癥和界面性肝炎，肝細胞免疫耐受性喪失，可進展為肝硬化甚至肝衰竭［1-4］。AIH主要發(fā)病人群為青少年及中老年女性。研究顯示該病的發(fā)病率逐年上升。AIH在全世界的年發(fā)病率為1.37/10萬人，其中亞洲人群的年發(fā)病率為1.31/10萬人［5］。目前AIH的病因和發(fā)病機制尚不明確［6］。現(xiàn)行治療AIH的策略是單獨使用糖皮質(zhì)激素或與硫唑嘌呤、免疫抑制劑組合。同時，為了保護肝臟、防止疾病的進展和肝功能的惡化，常規(guī)的治療策略還包括保肝降酶等。然而，長期使用這些藥物易使患者出現(xiàn)藥物依賴性、耐藥性及停藥后復發(fā)率較高等問題，因此，亟需尋找安全有效的治療方式［7］。

茵陳蒿湯出自醫(yī)圣張仲景所作《傷寒雜病論》，該方由茵陳、梔子、大黃三味藥組成，具有清熱利濕、利膽退黃的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，茵陳蒿湯用于治療AIH具有良好的臨床療效［8-9］。但有關茵陳蒿湯治療AIH的基礎實驗研究較少，其生物學機制尚未完全闡釋清楚。有研究表明，鐵死亡參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。鐵死亡是一種由鐵依賴的脂質(zhì)過氧化誘導的調(diào)節(jié)性細胞死亡形式。過量的鐵會引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，從而導致鐵死亡。胱氨酸-還原型谷胱甘肽（GSH）-谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是經(jīng)典的鐵死亡抑制系統(tǒng)。在正常生理條件下，胱氨酸通過抗轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A11進入細胞參與GSH的合成。合成的GSH可以被GPX4消耗，進而將活性氧（ROS）轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)醇抑制鐵死亡，保護細胞免受氧化應激，維持膜脂質(zhì)雙分子穩(wěn)態(tài)［10-11］。已有研究表明ROS誘導的氧化應激是多種肝臟疾病的潛在病理生理機制［12］。那么，茵陳蒿湯是否通過抑制鐵死亡及其介導的氧化應激來改善AIH肝損傷，目前尚未見相關報道。因刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）誘導的免疫性肝損傷是一種典型且公認的AIH小鼠模型，其損傷過程非常類似于人類AIH的病理變化過程，故本文將采用Con A尾靜脈注射制備免疫性肝炎小鼠模型，聚焦肝細胞鐵死亡過程，探討茵陳蒿湯對AIH小鼠肝細胞的保護作用機制，為將茵陳蒿湯用于AIH的臨床治療提供科學依據(jù)［13］。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 A51119600全波長酶標儀（thermo scientific公司，美國），733BR4227顯影儀（bio-rad公司，美國），374-706969C熒光酶標儀（thermo scientific公司，美國），041BR301185、041BR328905電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（bio-rad公司，美國）等。

1.2 藥物與試劑 茵陳蒿湯用量參考李冀等［14］主編《方劑學》：茵陳蒿18 g、梔子12 g、大黃6 g。茵陳蒿湯中茵陳（產(chǎn)地陜西，批號211026009），梔子（產(chǎn)地江西，批號211001），大黃（產(chǎn)地甘肅，批號210201）購自北京同仁堂。

GSH、AST、ALT、ROS、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號分別為A006-2-1、C010-2-1、C009-2-1、A003-1、E004-1-1），小鼠IFN-γ ELISA檢測試劑盒（Bioswamp，貨號MU30038），小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒（Bioswamp，貨號MU30030），Con A（索萊寶生物技術有限公司，貨號C8110），ATP檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，貨號S0027），鐵離子檢測試劑盒（Elabscience，貨號E-BC-K772-M），GPX4單克隆抗體（Cell Signaling Technology，貨號52455S），溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）多克隆抗體（Cell Signaling Technology，貨號98051S），GAPDH抗體（Abways，貨號AB0037），HRP-羊抗兔IgG（Abbkine，貨號A21020）。

1.3 實驗動物 8周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠18只（19～25 g），購自斯貝福生物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，動物使用許可證號：SYXK（晉）2020-0006。小鼠分籠飼養(yǎng)在室溫20～25 ℃、濕度為55%環(huán)境中，自由飲水和飲食。

1.4 動物分組及給藥劑量 小鼠適應性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為3組：正常組、模型組、治療組，每組6只。依據(jù)沈晗等［15］茵陳蒿湯煎煮工藝，依照人和動物體表系數(shù)折算法，計算所需的茵陳蒿湯藥量，選用70 kg成人用量換算，茵陳蒿湯藥量為4.68 g生藥/kg，得到終藥液濃度為0.47 g生藥/mL，灌胃體積10 mL/kg，1次/d，持續(xù)2周；模型組和正常組以等體積生理鹽水灌胃；模型組和治療組于末次給藥后2 h予Con A（15 mg/kg）行尾靜脈注射造模，正常組尾靜脈注射生理鹽水。

1.5 取材 Con A尾靜脈注射8 h后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。取血后處死小鼠。血清-80 ℃保存?zhèn)溆?。分離出肝臟、脾臟，生理鹽水漂洗，用濾紙將肝、脾表面的生理鹽水拭干，稱重后部分組織于4%多聚甲醛內(nèi)固定，其余部分-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 肝臟、脾臟指數(shù) 測量小鼠處死前體質(zhì)量及肝臟和脾臟的濕重。按照以下公式計算：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.6.2 血清轉(zhuǎn)氨酶、炎癥因子水平 檢測各實驗組小鼠血清ALT、AST、IFN-γ、TNF-α的含量。所有操作按照試劑盒說明書進行。

1.6.3 肝組織病理學檢測 取肝組織右上葉放入4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（片厚5 μm）。常規(guī)HE染色、中性樹膠封片。光鏡下觀察肝組織壞死面積及淋巴細胞浸潤程度。

1.6.4 肝組織中鐵離子測定 準確稱取肝組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，稱取20 mg肝組織后加入180 μL試劑一勻漿后，15 000×g離心5 min，取上清，用鐵離子測定試劑盒，在593 nm波長處測定吸光度值，據(jù)說明書公式計算肝組織中鐵離子含量。

1.6.5 測量肝組織GSH、MDA含量 準確稱取組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍的生理鹽水制成組織勻漿，離心取上清液待測。根據(jù)試劑盒說明書進行相關操作，分別在405 nm、532 nm波長處檢測吸光度，計算肝組織內(nèi)GSH、MDA含量。

1.6.6 測量肝組織中ROS含量 稱取0.1 g組織，在PBS中剪碎漂洗后加入胰酶消化，尼龍網(wǎng)過濾，收集細胞，按1∶1 000的比例配制探針，加入探針混勻后37 ℃孵育45 min，PBS洗1遍，加入PBS重懸，使用熒光酶標儀在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm處測定熒光度值，所有操作均按照說明書要求進行。

1.6.7 測量肝組織中ATP含量 稱取20 mg肝組織，按說明書要求加入150 μL ATP檢測裂解液勻漿。取上清加入ATP檢測工作液，使用熒光酶標儀測定化學發(fā)光水平，按照說明書公式計算肝組織內(nèi)ATP水平。

1.6.8 Western Blot法檢測肝組織GPX4蛋白表達 根據(jù)裂解液說明書，按20 mg組織加入250 μL含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行組織勻漿，離心取上清。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加一抗GPX4（1∶1 000）、SLC7A11（1∶1 000）4 ℃孵育過夜后，TBST清洗，室溫孵育二抗GAPDH（1∶50 000）2 h，TBST清洗，加入ECL試劑，用顯影儀成像。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)，計量資料采用表示，3組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 茵陳蒿湯對小鼠肝臟、脾臟指數(shù)及肝功能的影響與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均明顯升高（P值均＜0.01），與模型組相比，治療組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均降低（P值均＜0.01）。模型組血清ALT和AST水平較正常組均顯著升高（P值均＜0.01），治療組小鼠血清ALT和AST水平較模型組均明顯降低（P值均＜0.01）（表1）。

表1 茵陳蒿湯對小鼠肝/脾指數(shù)、血清ALT和AST水平的影響Table 1 Effect of Yinchenhao decoction on liver and spleen index， serum ALT and AST levels in mice

2.2 茵陳蒿湯對小鼠肝組織中ROS產(chǎn)生、Fe、MDA、GSH、ATP水平的影響 與正常組相比，模型組肝組織ROS產(chǎn)生量、Fe和MDA水平均顯著升高（P值均＜0.01），GSH和ATP水平顯著降低（P值均＜0.05）。與模型組相比，治療組肝組織ROS產(chǎn)生量、鐵離子和MDA水平顯著降低（P值均＜0.01），GSH和ATP水平顯著升高（P值均＜0.01）（表2）。

表2 茵陳蒿湯對小鼠肝組織中ROS產(chǎn)生、鐵離子、MDA、GSH、ATP水平的影響Table 2 Effects of Yinchenhao decoction on ROS production， Fe， MDA， GSH and ATP levels in liver tissue of mice

2.3 茵陳蒿湯對小鼠肝組織形態(tài)學的影響 HE染色結果顯示正常組肝組織完整，肝小葉清晰，肝細胞規(guī)則排列；在模型組中，出現(xiàn)大面積肝細胞變性、壞死，門管區(qū)炎細胞聚集等病理變化；茵陳蒿湯治療組肝組織病變的程度顯著改善，壞死面積較模型組明顯減少，肝小葉尚清晰（圖1）。

圖1 茵陳蒿湯對小鼠肝組織形態(tài)學的影響（HE染色）Figure 1 Effect of Yinchenhao decoction on liver morphology of mice （HE staining）

2.4 茵陳蒿湯對小鼠血清炎癥因子的影響 與正常組相比，模型組血清IFN-γ、TNF-α水平均升高（P值均＜0.05）；與模型組相比，治療組IFN-γ、TNF-α水平明顯降低（P值均＜0.05）（表3）。

表3 茵陳蒿湯對Con A誘導肝損傷小鼠血清IFN-γ、TNF-α的影響Table 3 Effects of Yinchenhao decoction on serum IFN-γ and TNF-α production in mice with Con A induced liver injury

2.5 茵陳蒿湯對小鼠肝組織中GPX4和SLC7A11蛋白表達的影響 模型組GPX4和SLC7A11蛋白表達水平較正常組顯著降低（P值均＜0.01）；與模型組相比，治療組GPX4和SLC7A11蛋白表達水平均明顯升高（P值均＜0.01）（圖2）。

圖2 茵陳蒿湯對小鼠肝組織中GPX4和SLC7A11蛋白表達的影響Figure 2 Effect of Yinchenhao decoction on GPX4 and SLC7A11 protein expression in liver tissue of mice

3 討論

AIH是一種慢性、難治性疾病，其發(fā)病與多種因素有關，AIH治療主要目標是通過控制肝臟炎癥反應，使血清ALT、AST、IgG水平恢復正常，肝組織內(nèi)炎癥消失［16-18］。根據(jù)《自身免疫性肝炎診斷和治療指南（2021）》［19］，臨床目前仍主要采用潑尼松（龍）聯(lián)合硫唑嘌呤或者單用潑尼松（龍）的非特異性療法。該方案雖可顯著改善大多數(shù)中重度AIH患者的肝生化指標，但至少有10%～15%的患者對上述治療方案應答不佳，另有部分患者不能耐受藥物的不良反應（如股骨頭缺血性壞死、血細胞減少等）或停藥后復發(fā)，因此亟需尋求更佳的治療藥物。研究［20-21］發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯可在病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病中使升高的ALT、AST、TNF-α恢復至正常水平，可以降低血脂、血糖，改善肝脂肪代謝，降低炎性反應，減輕肝損傷。研究［22-24］表明其減輕肝損傷主要表現(xiàn)在改善脂質(zhì)代謝、平衡腸道菌群和調(diào)節(jié)線粒體功能，其醇提物在抗炎及抗氧化、降低MDA含量等方面效果顯著?，F(xiàn)代研究認為，茵陳蒿湯中的主要成分有槲皮素、β-谷甾醇、大黃素、山奈酚等，而槲皮素、β-谷甾醇、大黃酸等成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、降脂和保肝等作用，可誘導細胞自噬對肝細胞起到保護作用［25-27］。本次實驗發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清ALT和AST水平升高；同時，在AIH病理進展中起重要作用的炎性細胞因子TNF-α、IFN-γ水平升高，提示Con A誘導的AIH實驗小鼠存在肝臟炎癥，而治療組ALT、AST及TNF-α、IFN-γ水平均明顯降低，提示茵陳蒿湯對Con A誘導的小鼠免疫性肝損傷具有潛在的保護作用。

鐵死亡是一種調(diào)節(jié)性的細胞死亡形式，其特征是鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化積累［28-29］。研究表明鐵死亡與Xc-系統(tǒng)的功能密切相關。Xc-系統(tǒng)是位于細胞膜上的一種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，是由SLC7A11和SLC3A2兩個亞基組成的異二聚體，是細胞中重要抗氧化系統(tǒng)的一部分。胱氨酸和谷氨酸通過Xc-系統(tǒng)中的胱氨酸/谷氨酸抗轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A11以1∶1的比例交換進出細胞，被吸收的胱氨酸在細胞中還原為半胱氨酸，參與GSH的合成［10］。GPX4是多種細胞類型中鐵死亡的關鍵調(diào)節(jié)酶，具有抗氧化防御作用，可以通過消耗GSH將脂質(zhì)ROS轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)醇，從而保護細胞免受鐵死亡［11］。當Xc-系統(tǒng)失衡時，超負荷游離鐵累積可導致各種肝臟疾病，鐵過載通過芬頓反應誘導ROS產(chǎn)生增多，導致氧化損傷和細胞死亡，從而誘發(fā)鐵死亡［30］。肝臟是體內(nèi)主要的儲鐵部位，當發(fā)生鐵死亡時，肝臟內(nèi)游離的鐵離子增加會加重肝臟負荷，從而造成肝損傷。相關研究［31］表明，腎臟組織中由鐵死亡引起的細胞死亡與GPX4基因缺失有關。GPX4對于預防脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的有害影響至關重要，有研究［12］表明，鐵死亡是AIH發(fā)病機制的啟動劑或介質(zhì)，并且AIH中鐵死亡的發(fā)生受GPX4的調(diào)節(jié)。而GPX4的合成受胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A11的影響。通過建立免疫性肝炎小鼠模型，本研究發(fā)現(xiàn)模型小鼠肝組織中GPX4和SLC7A11蛋白表達水平顯著降低，茵陳蒿湯治療組小鼠肝組織中GPX4和SLC7A11蛋白表達水平顯著升高，這些結果表明茵陳蒿湯可以調(diào)控Con A對小鼠肝組織Xc-系統(tǒng)的抑制作用。

脂質(zhì)ROS的積累是鐵死亡的重要標志物，Xc-系統(tǒng)受到抑制會導致胱氨酸的吸收減少從而影響GSH的合成，導致GPX4活性降低，細胞抗氧化能力下降，脂質(zhì)ROS積累，高水平的ROS會對DNA、蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)造成氧化損傷，并促進脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，導致脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA含量增加，最終發(fā)生氧化損傷和鐵死亡［32］。本研究顯示Con A顯著增強了肝細胞內(nèi)的ROS、鐵離子的累積，并減少了GSH含量及SLC7A11和GPX4蛋白表達水平，提示Con A可能誘導肝組織發(fā)生鐵死亡。茵陳蒿湯顯著抑制了Con A誘導的肝臟內(nèi)ROS產(chǎn)生的增加以及肝組織MDA含量的升高，使肝臟內(nèi)GSH含量升高，表明茵陳蒿湯可能通過增強肝組織的抗氧化作用，從而抑制鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究結果顯示Con A注射后導致Xc-系統(tǒng)失衡，誘導小鼠肝組織發(fā)生鐵死亡。茵陳蒿湯通過增加Xc-系統(tǒng)中GPX4和SLC7A11蛋白表達水平抑制鐵死亡起到肝保護作用。因此，本研究結果表明茵陳蒿湯的肝保護作用機制與可能與增強GPX4和SLC7A11蛋白表達從而抑制鐵死亡相關，為茵陳蒿湯臨床治療AIH的中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了數(shù)據(jù)支持和依據(jù)。由于人與動物的代謝酶、藥物分布以及腸道吸收度等均有不同，中藥的藥代動力學在人體和動物之間可能存在一定差異，因此，本研究結果進行臨床轉(zhuǎn)化尚需進一步的研究工作。

倫理學聲明：本研究方案于2021年9月29日經(jīng)由山西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，批號：2019LL41。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：李竹蓉負責設計論文框架，起草論文及研究過程的實施；陳晨、郭地負責實驗操作，數(shù)據(jù)收集；呂思學、武嘉文負責統(tǒng)計學分析；楊娜、劉楊負責論文修改；劉楊負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。