邱功欽， 謝丹， 陳姿任， 歐陽(yáng)石

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 a.感染性疾病科， b.廣東高校生物靶向診治與康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510000

HBV感染仍然是一個(gè)嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。全球約有2.96億人為慢性HBV感染，每年約有150萬(wàn)新發(fā)感染者，乙型肝炎每年約導(dǎo)致82萬(wàn)人死亡，其中大部分死于乙型肝炎肝硬化和肝細(xì)胞癌［1］。核苷（酸）類(lèi)似物（nucleotide analogues，NAs）抗病毒治療可抑制HBV的持續(xù)復(fù)制，從而減輕肝細(xì)胞炎癥、壞死及肝纖維化程度，延緩和減少終末期肝病事件的發(fā)生，改善HBV感染者的生活質(zhì)量及延長(zhǎng)生存時(shí)間［2-4］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，即使在長(zhǎng)期接受NAs藥物治療的患者中，仍有部分患者血清HBV DNA處于間歇或持續(xù)性低水平檢出陽(yáng)性狀態(tài)，即存在低病毒血癥（low-level viremia，LLV）［5］。已有研究［6-12］報(bào)道LLV患者預(yù)后不良，短期有增加耐藥的風(fēng)險(xiǎn)以及病毒學(xué)突破的風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期可能增加肝纖維化進(jìn)展和肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并使肝癌患者的總體生存率更低。但是之前由于PCR檢測(cè)靈敏度的限制，很多應(yīng)用普敏PCR檢測(cè)HBV DNA＜100 IU/mL的人群被視為核酸定量陰性，隨著高靈敏的實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用，HBV DNA定量在10～99 IU/mL的這部分人群被發(fā)現(xiàn)。本文將HBV DNA在10～99 IU/mL的這部分定義為極低病毒載量（very low viral load，VLVL）。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)VLVL的相關(guān)研究報(bào)道。本研究聚焦NAs經(jīng)治≥48周、經(jīng)普敏PCR檢查HBV DNA（檢測(cè)下限100 IU/mL）結(jié)果為陰性（低于檢測(cè)下限）的慢性乙型肝炎（CHB）患者，進(jìn)一步行高敏HBV DNA檢測(cè)（檢測(cè)下限10 IU/mL），以發(fā)現(xiàn)CHB患者中的VLVL人群，揭示該人群的臨床特點(diǎn)及影響因素，為臨床及時(shí)調(diào)整治療方案提供精準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)CHB精準(zhǔn)治療提供有意義的臨床參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019年9月—2022年2月就診于本院感染科接受NAs治療的CHB患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合我國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［13］中CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡≥18歲；（3）接受NAs療程≥48周；（4）本院普敏PCR（檢測(cè)下限為100 IU/mL）檢測(cè)HBV DNA均為陰性（低于檢測(cè)下限），進(jìn)一步行高敏PCR法（檢測(cè)下限為10 IU/mL）檢測(cè)HBV DNA的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并甲、丙、丁、戊型肝炎或HIV感染者；（2）合并失代償期肝硬化、酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病、肝癌等其他肝?。唬?）合并其他嚴(yán)重臟器疾病或其他惡性腫瘤；（4）既往接受或目前正在使用干擾素、免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物治療；（5）妊娠期或哺乳期婦女；（6）NAs抗病毒治療依從性不佳者；（7）臨床資料嚴(yán)重缺失，病史不全者。

1.2 觀察指標(biāo) 收集一般資料，包括年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、是否合并乙型肝炎肝硬化、NAs治療時(shí)間；實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：收集患者高敏PCR法檢測(cè)HBV DNA結(jié)果及同期的血清病毒學(xué)指標(biāo)，包括血清定量乙型肝炎表面抗原（qHBsAg）、HBeAg和前基因組RNA（pgRNA）；此外，收集肝腎功能、血脂、血常規(guī)、AFP指標(biāo)；無(wú)創(chuàng)肝纖維化指標(biāo)：肝硬度測(cè)定值（liver stiffness measurements，LSM）、血小板比率指數(shù)（aspartate aminotransferase to platelet ratio index，APRI）。

1.3 研究方法 根據(jù)高敏HBV DNA結(jié)果分為VLVL組（HBV DNA 10～99 IU/mL）和完全病毒學(xué)應(yīng)答（complete virology response，CVR）組（HBV DNA＜10 IU/mL或未檢測(cè)到）。HBV DNA＜10 IU/mL表示出現(xiàn)PCR擴(kuò)增曲線，在線性檢測(cè)下限10 IU/mL以下但無(wú)法準(zhǔn)確定量。HBV DNA未檢測(cè)到表示PCR擴(kuò)增熒光曲線無(wú)抬頭。普敏HBV DNA方法采用HBV核酸測(cè)定試劑盒（PCR-熒光探針?lè)?，中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司），檢測(cè)下限100 IU/mL，檢測(cè)上限5×108IU/mL，靈敏度30 IU/mL。高敏HBV DNA檢測(cè)方法采用HBV核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光法，Cobas 6800/8800檢測(cè)系統(tǒng)，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司），檢測(cè)下限10 IU/mL，檢測(cè)上限1×109IU/mL，靈敏度2.4 IU/mL。HBV血清學(xué)標(biāo)志物（qHBsAg、HBeAg）采用（Cobas e 601分析儀，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）；AFP采用電化學(xué)發(fā)光法（羅氏801原裝試劑，羅氏E801全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀），pgRNA檢測(cè)采用HBV pgRNA檢測(cè)試劑盒（中國(guó)廣東廣州SUPBIO生物技術(shù)有限公司），檢測(cè)下限200 拷貝/mL，檢測(cè)結(jié)果＜200 拷貝/mL為陰性，≥200 拷貝/mL為陽(yáng)性。血常規(guī)、血生化等指標(biāo)均在本院檢驗(yàn)科完成。LSM測(cè)定采用瞬時(shí)彈性成像技術(shù)（應(yīng)用Fibroscan設(shè)備）。APRI=［AST/AST的正常值上限×100］/血小板計(jì)數(shù)（×109/L）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）評(píng)價(jià)相關(guān)血清病毒學(xué)指標(biāo)對(duì)高敏HBV DNA高于檢測(cè)下限的預(yù)測(cè)價(jià)值。采用二元Logistic回歸分析探討未實(shí)現(xiàn)CVR的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分組情況 本研究共納入106例患者，其中血清HBV DNA未檢測(cè)到52例，HBV DNA＜10 IU/mL 30例，即CVR組共82例，占比77.4%。VLVL組（HBV DNA 10～99 IU/mL）24例，占比22.6%。

2.2 一般資料比較 106例患者中位年齡33.0歲，男性76例，中位BMI為21.9 kg/m2，14例診斷為乙型肝炎肝硬化，NAs治療中位時(shí)長(zhǎng)2.7年。其中，VLVL組患者年齡比CVR組更?。≒=0.004）（表 1）。

2.3 臨床特征比較 在血清生化學(xué)指標(biāo)方面，VLVL組ALT水平明顯高于CVR組（P=0.017）。肝纖維化指標(biāo)方面，VLVL組FIB-4評(píng)分稍低于CVR組（P＜0.001）。在HBV血清學(xué)指標(biāo)方面，VLVL組qHBsAg水平、HBeAg陽(yáng)性率均明顯高于CVR組（P值均＜0.05）；106例CHB患者中有52例行HBV pgRNA檢測(cè)，VLVL組pgRNA陽(yáng)性率亦明顯高于CVR組（P＜0.05）（表2）。

表1 VLVL組和CVR組一般資料比較Table 1 Comparison of general characteristics between VLVL group and CVR group

表2 VLVL組和CVR組臨床特征比較Table 2 Comparison of clinical characteristics between VLVL group and CVR group

2.4 qHBsAg水平預(yù)測(cè)高敏HBV DNA高于檢測(cè)下限的ROC曲線 將高敏HBV DNA檢測(cè)結(jié)果10～99 IU/mL作為陽(yáng)性事件，＜10 IU/mL及未檢測(cè)到作為陰性事件，應(yīng)用ROC曲線分析qHBsAg水平預(yù)測(cè)高敏HBV DNA高于檢測(cè)下限（＞10 IU/mL）的價(jià)值。qHBsAg水平預(yù)測(cè)高敏HBV DNA高于檢測(cè)下限（＞10 IU/mL）的曲線下面積（AUC）為0.717（95%CI：0.615～0.818，P=0.002），當(dāng)最佳cut-off值為1 214.5 IU/mL時(shí)，敏感度為95.5%，特異度為53.9%（圖1）。

圖1 qHBsAg水平預(yù)測(cè)高敏HBV DNA高于檢測(cè)下限的ROC曲線Figure 1 ROC curve of qHBsAg titer prediction for highly sensitive HBV DNA above the lower detection limit

2.5 未實(shí)現(xiàn)CVR的影響因素分析 將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)（年齡、qHBsAg水平、HBeAg陽(yáng)性）納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，HBeAg陽(yáng)性（OR=3.654，P=0.027）和qHBsAg（OR=2.985，P=0.039）是未實(shí)現(xiàn)CVR的獨(dú)立影響因素（表3）。

表3 二元Logistic回歸分析未實(shí)現(xiàn)CVR的影響因素Table 3 Binary Logistic regression analysis of influencing factors of incomplete virology response

3 討論

我國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》［2］中明確指出：對(duì)HBsAg陽(yáng)性者，包括正在接受抗病毒治療的CHB患者，應(yīng)盡可能采用高靈敏且檢測(cè)線性范圍大的HBV DNA檢測(cè)方法（定量下限為10～20 IU/ml）。同時(shí)也指出，CHB患者應(yīng)用一線NAs治療≥48周經(jīng)高敏HBV DNA檢測(cè)仍可檢出者，建議調(diào)整NAs治療方案或者聯(lián)合干擾素治療。由此可見(jiàn)HBV DNA定量檢測(cè)是否“可檢出”成為決定啟動(dòng)抗病毒治療及判斷治療效果的重要指標(biāo)。本研究回顧性收集了106例接受NAs治療≥48周經(jīng)普敏HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果為低于檢測(cè)下限的CHB患者，進(jìn)一步行高敏HBV DNA檢測(cè)，結(jié)果顯示有超過(guò)50%的患者沒(méi)有達(dá)到真正意義的CVR，其HBV DNA定量為10～99 IU/mL，并且這部分患者炎癥損傷水平（尤其ALT水平）、qHBsAg水平、pgRNA陽(yáng)性率以及HBeAg陽(yáng)性率均顯著高于CVR（HBV DNA＞10 IU/mL）組。因此，高敏HBV DNA定量檢測(cè)對(duì)于發(fā)現(xiàn)潛在慢性HBV感染VLVL患者具有重要意義，可作為HBV精準(zhǔn)治療策略的臨床參考指標(biāo)之一。臨床醫(yī)師不應(yīng)忽視這部分患者，需及時(shí)行高敏HBV DNA檢測(cè)。

有學(xué)者［5］提出NAs經(jīng)治CHB患者發(fā)生LLV的可能機(jī)制與NAs藥物作用機(jī)制的局限性以及NAs治療時(shí)部分患者肝細(xì)胞的不活躍增殖狀態(tài)相關(guān)，這部分患者通過(guò)換用或加用新的NAs藥物可能難以徹底解決LLV問(wèn)題，而近期的報(bào)道［14-15］均顯示LLV亦有較高的炎癥和纖維化進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。HBV感染者的ALT水平與肝臟炎癥和纖維化程度密切相關(guān)［2］。已有研究［16-19］表明ALT在正常水平偏上限時(shí)，也會(huì)存在肝臟炎癥和纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)在普敏PCR檢測(cè)中VLVL組往往會(huì)被歸于“CVR”組，但經(jīng)高敏PCR檢測(cè)，實(shí)際患者仍然存在VLVL，而且其ALT水平顯著高于CVR組，提示VLVL組因?yàn)椴《镜拇嬖诙绊懜闻K炎癥和纖維化，提醒臨床醫(yī)生對(duì)于VLVL應(yīng)重視。

qHBsAg水平作為臨床上重要且常用的指標(biāo)，不僅用于臨床診斷，還可以反映HBV DNA的復(fù)制和預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展以及評(píng)估預(yù)后［20］。然而較少文獻(xiàn)探究qHBsAg水平在NAs長(zhǎng)期治療CHB患者中VLVL的應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，VLVL組qHBsAg水平顯著高于CVR組，且qHBsAg水平預(yù)測(cè)高敏HBV DNA高于檢測(cè)下限（＞10 IU/mL）的AUC為0.717，當(dāng)最佳cut-off值為1 214.5 IU/mL時(shí)，敏感度為95.5%，特異度為53.9%。因此該指標(biāo)具有一定的參考價(jià)值，在尚未開(kāi)展高敏HBV檢測(cè)的地區(qū)，若普敏HBV DNA結(jié)果顯示低于檢測(cè)下限，則可依據(jù)qHBsAg水平判斷患者是否處于VLVL狀態(tài)，以協(xié)助決策下一步治療方案。

血清HBV pgRNA是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closedcircular DNA，cccDNA）直接轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，可以反映cccDNA的活性［21-23］。cccDNA是HBV前基因組RNA復(fù)制的原始模板，只有清除了細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA，才能徹底消除乙型肝炎患者病毒攜帶狀態(tài)，以達(dá)到抗病毒的治療目標(biāo)［24］。盡管在本研究中，僅有52例（49%）患者行血清HBV pgRNA檢測(cè)，但結(jié)果顯示VLVL組pgRNA陽(yáng)性率顯著高于CVR組。提示VLVL狀態(tài)的存在，是pgRNA無(wú)法徹底轉(zhuǎn)陰的一個(gè)重要影響因素。

此外，本研究結(jié)果顯示，HBeAg陽(yáng)性和高qHBsAg水平是未實(shí)現(xiàn)CVR的獨(dú)立影響因素。與Kim等［11］發(fā)現(xiàn)基線高HBsAg水平、HBeAg陽(yáng)性均為CHB患者發(fā)生LLV的獨(dú)立危險(xiǎn)因素這一研究結(jié)論基本一致。這在疾病早期可以為臨床醫(yī)生的治療方向提供參考。

值得注意的是，高敏HBV DNA檢測(cè)結(jié)果報(bào)告包括“＜10 IU/mL”“未檢測(cè)到”這兩種結(jié)果，已有學(xué)者［5，25］強(qiáng)調(diào)應(yīng)該對(duì)此兩種結(jié)果進(jìn)行更為清晰地辨析，前者表示樣本中有PCR擴(kuò)增曲線、痕量DNA確實(shí)存在但無(wú)法準(zhǔn)確定量，而后者表示未檢測(cè)到目的基因。本研究曾嘗試對(duì)“＜10 IU/mL”“未檢測(cè)到”進(jìn)行獨(dú)立分組，探討這兩種結(jié)果在臨床特征方面有無(wú)差異，結(jié)果未見(jiàn)高敏HBV DNA“＜10 IU/mL”與“未檢測(cè)到”兩組臨床特征有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有無(wú)必要對(duì)HBV DNA“存在但低于檢測(cè)下限”和“未檢測(cè)到”這兩種結(jié)果進(jìn)行區(qū)分，需要從臨床和檢驗(yàn)兩個(gè)角度辯證看待，這兩組的臨床轉(zhuǎn)歸和長(zhǎng)期預(yù)后有待進(jìn)一步更大樣本量的研究。

綜上所述，對(duì)于普敏已達(dá)到所謂“CVR”的CHB患者，經(jīng)高敏HBV DNA檢測(cè)后，仍可發(fā)現(xiàn)部分患者實(shí)際上仍處于VLVL狀態(tài)。對(duì)其臨床特點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，這部分VLVL患者炎癥損傷水平、qHBsAg水平、pgRNA陽(yáng)性率以及HBeAg陽(yáng)性率均顯著高于CVR組，提示臨床工作中還需推廣普及高敏HBV DNA檢測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)VLVL人群，及時(shí)調(diào)整治療方案。

本研究也存在一定局限性。本研究屬于單中心橫斷面研究，一方面后續(xù)可進(jìn)一步長(zhǎng)期追蹤VLVL患者調(diào)整治療策略后的肝臟炎癥狀態(tài)、纖維化程度以及pgRNA、qHBsAg變化情況；另一方面可進(jìn)一步開(kāi)展多中心更大樣本量研究，以區(qū)分高敏HBV DNA“＜10 IU/mL”與“未檢測(cè)到”兩種情況臨床特征的差異。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2023年3月28日經(jīng)由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：GYWYL2023-60。

利益沖突聲明：本研究不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：邱功欽負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集及分析，撰寫(xiě)論文，修改論文；謝丹、陳姿任負(fù)責(zé)修改和校對(duì)論文；歐陽(yáng)石負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)，擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。