張立娜，張向宇，朱雨晴，劉玉華，馬穎鈺，趙海亮

1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院，河北 石家莊 050051

2.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617

3.河北省醫(yī)學情報研究所，河北 石家莊 050071

4.河北省兒童醫(yī)院，河北 石家莊 050031

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）感染而起的一類傳染性疾病，嚴重可引起肝硬化、肝衰竭、肝癌等疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約有2.96億人感染慢性肝炎，相比于往年，患病比率有所下降，但全球消除病毒性肝炎病毒也是刻不容緩[1]。HBV屬于DNA病毒，潛伏期較長，西醫(yī)臨床上多采用抗病毒治療法對抗HBV感染所引起的乙型病毒性肝炎，如干擾素類藥物以及核苷（酸）類似物藥[2]。中醫(yī)藥治療乙型病毒性肝炎逐漸走向大眾視野，相對于西醫(yī)治療乙型病毒性肝炎的療程較長、停藥后復發(fā)率較高等狀況[3]，中藥治療有著辨證論治、多成分、多靶點共同作用，從而實現(xiàn)快速且有效解決不同證型乙型病毒性肝炎的優(yōu)勢[4]。

舒肝寧注射液是由茵陳、梔子、板藍根、靈芝等多種中藥提取物以及黃芩苷組成的用于治療急、慢性乙型病毒性肝炎的中成藥之一。具有清熱解毒、利濕退黃、益氣扶正、保肝護肝的功效[3]。研究表明，組成舒肝寧注射液的5種中藥提取物中，發(fā)揮療效的包括有機酸類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、腺苷類、生物堿類等多種化學成分[5-8]。但目前舒肝寧注射液活性成分治療乙型病毒性肝炎的分子作用機制并不明確。網(wǎng)絡藥理學作為新興學科，可從網(wǎng)絡調(diào)控、網(wǎng)絡構(gòu)建進行多成分、多靶點的方劑網(wǎng)絡模型創(chuàng)造[9]，進一步揭示中藥方劑在某種病癥中的治療作用機制。本研究則基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)探究舒肝寧注射液中活性成分治療乙型病毒性肝炎的分子作用機制，為其臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 舒肝寧注射液主要成分的篩選

舒肝寧注射液是由茵陳、梔子、板藍根和靈芝提取物及黃芩苷組成的中藥復方注射劑。茵陳提取物中的綠原酸等有機酸類化合物為其主要的活性成分，有抗炎、抗病毒、保肝利膽、抗氧化等作用[10]；環(huán)烯醚萜苷類為梔子提取物中主要的一類活性成分，通過抑制氧化應激、抗脂質(zhì)過氧化等作用發(fā)揮保肝利膽作用[11]；板藍根中表告依春及腺苷類、生物堿類成分有較強的抗病毒作用為主要活性成分[12]；靈芝提取物中三萜類及腺苷類化合物為其主要活性成分，具有護肝解毒功效[13]。有學者對舒肝寧注射液中的綠原酸、梔子苷、黃芩苷、表告依春、腺苷等主要成分進行了定量分析[5-8]。另外，通過其他針對4味藥材物質(zhì)組解析的文獻報道[14-17]，并以含量高、活性好、各結(jié)構(gòu)類型兼顧的原則，選取舒肝寧注射液中的代表性成分為研究對象。

1.2 化合物靶點預測分析

在PubChem數(shù)據(jù)庫獲得代表性化合物結(jié)構(gòu)及其Smlies號，將其導入Swiss Target Prediction平臺，選物種為“人”，進行化合物潛在作用靶點的篩選；在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索欄輸入化合物英文名，檢索其作用靶點，然后整合2個數(shù)據(jù)庫結(jié)果，得到舒肝寧注射液主要代表性成分潛在作用靶點庫。

同時利用GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫搜索“hepatitis B”，獲得乙型病毒性肝炎疾病候選靶點。最后利用Venny平臺獲取成分潛在作用靶點與疾病靶點的交集靶點，即為舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎的潛在靶點。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建

將1.2項下獲得的交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人、置信度為0.9，獲得交集靶點的PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)，將該數(shù)據(jù)表導入Cytoscape 3.9.1軟件，獲得PPI網(wǎng)絡圖，利用Analyze Network工具進行分析，獲取各靶點degree值等信息。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫對PPI網(wǎng)絡中高度連接的網(wǎng)絡進行分組及可視化處理。并對MCODE進行功能富集分析。

1.5 基因本體（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

運用Omicsbean平臺對舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎的潛在靶點進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，ID type設置為Gene Symbol，物種設置為“Homo sapiens”。

1.6 “藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡圖構(gòu)建

建立“藥材-成分”“成分-靶點”對應關(guān)系工作表并導入Cytoscape 3.9.1軟件，繪制“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡關(guān)系圖。

1.7 乙型病毒性肝炎信號通路網(wǎng)絡分析

分析信號通路結(jié)果，獲得乙型病毒性肝炎疾病信號通路，找到該信號通路中的靶點信息，并逆推確定舒肝寧注射液中作用于該通路的化學成分，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.1獲得“藥材-成分-靶點-乙型病毒性肝炎通路”網(wǎng)絡關(guān)系圖。

1.8 分子對接驗證

將PPI網(wǎng)絡分析中得到的核心靶點與“藥材-成分-靶點-乙型病毒性肝炎通路”網(wǎng)絡分析中的潛在靶點取交集靶點作為對接受體，于PDB數(shù)據(jù)庫中下載蛋白三維結(jié)構(gòu)；并根據(jù)化合物靶點預測分析結(jié)果中，分別與交集靶點作用的化合物為對接配體，從Pub Chem數(shù)據(jù)庫中下載配體結(jié)構(gòu)的3D sdf格式文件，利用Schr?dinger2020 Maestro 12.4軟件對蛋白受體以及化合物小分子做去水、能量最小化以及氫鍵優(yōu)化處理后進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 舒肝寧注射液有效成分

根據(jù)化合物選取原則及文獻查閱，共確定舒肝寧注射液中19個代表性成分。主要包括來源于茵陳、梔子、板藍根、靈芝藥材中的有機酸類成分如綠原酸、異綠原酸C等，環(huán)烯醚萜苷類成分如梔子苷、京尼平苷等，含硫類成分如表告依春，喹唑酮類成分如色胺酮，腺苷類成分如腺苷、鳥苷，吲哚生物堿類成分如靛玉紅等，三萜類成分如靈芝酸A等，以及處方中黃酮類成分黃芩苷，見表1。

表1 舒肝寧注射液有效成分Table 1 Active ingredient of Shuganning Injection

2.2 潛在作用靶點篩選

共獲得19個化合物的584個作用靶點，整理去重后共得到321個潛在作用靶點；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫以“relevance score＞10”為條件獲得2 506個乙型病毒性肝炎相關(guān)靶點；通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得415個乙型病毒性肝炎相關(guān)靶點，二者綜合去重后獲得2 640個靶點。將321個化合物潛在作用靶點與2 640個疾病靶點數(shù)據(jù)導入Venn平臺，獲得173個交集靶點，視為舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎的潛在靶點。

2.3 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將173個交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人、置信度為0.9，獲得PPI網(wǎng)絡，見圖1。分析發(fā)現(xiàn)該PPI網(wǎng)絡圖共涉及142個節(jié)點，300條邊，平均相鄰節(jié)點數(shù)為4.579，按degree值排序，靠前的20個靶點為非受體酪氨酸激酶（SRC）、熱休克蛋白（HSP90AA1）、雌激素受體1（ESR1）、磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3CA）、表皮生長因子受體（EGFR）、連環(huán)蛋白1（CTNNB1）、核受體輔阻遏物2（NCOR2）、腫瘤壞死因子（TNF）、整合素B1（ITGB1）、胱天蛋白酶3（CASP3）、蛋白激酶Cα（PRKCA）、組蛋白脫乙酰酶1（HDAC1）、細胞凋亡調(diào)節(jié)因子（Bcl-2）、Ras家族蛋白（HRAS）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAF1）、細胞色素P450家族蛋白（CYP1A1）、雄激素受體（AR）、V-rel網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2（PTPN11）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9），視為核心靶點。圖中圓形節(jié)點即靶點，其中節(jié)點越大顏色越深表示degree值越大，節(jié)點間連線顏色越深代表靶點之間聯(lián)系越緊密。

圖1 舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎的PPI網(wǎng)絡分析圖Fig.1 PPI network analysis of Shuganning Injection in treatment of hepatitis B

2.4 蛋白質(zhì)相互作用富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行聚類分析，共生成6個顯著聚類團，見圖2。對不同聚類團中的靶點進行潛在功能分析。通過富集分析顯示，MCODE 1主要對生物刺激的反應進行調(diào)節(jié)以及與癌癥相關(guān)；MCODE 2主要與細胞凋亡信號通路的負調(diào)控以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工有關(guān)；MCODE 3參與膠原蛋白降解、基質(zhì)金屬蛋白酶的激活；MCODE 4主要參與對肽的反應、細胞的活化以及MAPK信號通路相關(guān)；MCODE 5與T/B細胞受體信號通路、C型凝集素受體信號通路相關(guān)；MCODE 6參與胺代謝、色氨酸代謝、芳香族化合物分解代謝過程。

圖2 舒肝寧治療乙型病毒性肝炎相關(guān)蛋白靶點的cluster模塊分析圖Fig.2 Cluster module analysis of targets related to Shuganning Injection in treatment of hepatitis B

2.5 GO、KEGG富集分析

將舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎的潛在作用靶點導入Omicsbean平臺，進行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析。通過分析發(fā)現(xiàn)，在P＜0.05條件下，共富集到5 409條生物過程（BP）、426個細胞組分（CC）、609個分子功能（MF）、166個KEGG相關(guān)通路。按P值升序排序，GO功能富集分析各自選前10項進行可視化處理（圖3）、KEGG通路富集選擇前20個做分析（圖4）。結(jié)果表明，在BP方面涉及細胞對化學刺激的響應、對生物及細胞過程的正調(diào)控、對脅迫的響應等；在CC方面涉及細胞質(zhì)、囊泡、細胞外基質(zhì)等；MF主要涉及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合等。干預的信號通路主要有VEGF、TNF、T細胞受體（T cell receptor）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎等信號通路。

圖3 GO功能富集分析圖Fig.3 Analysis of GO functional enrichment

圖4 KEGG通路富集分析圖Fig.4 Analysis of KEGG pathway enrichment

2.6 舒肝寧注射液“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建

建立“藥材-成分-靶點”對應關(guān)系工作表，通過Cytoscape 3.9.1軟件繪制“藥材-成分-靶點”網(wǎng)絡作用圖，見圖5。通過Analyze Network分析，該網(wǎng)絡圖具197個節(jié)點，341條邊，平均相鄰節(jié)點數(shù)為3.431。證明舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎是多成分與多靶點間的相互作用。

圖5 “藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖Fig.5 Network diagram of “traditional Chinese medicine-active ingredient-target”

2.7 乙型病毒性肝炎信號通路相關(guān)靶點網(wǎng)絡

對KEGG富集到的乙型病毒性肝炎疾病信號通路進行深入分析發(fā)現(xiàn)，舒肝寧注射液19個化合物中有13個可作用于乙型病毒性肝炎信號通路的16個靶點（圖6），其中在PPI網(wǎng)絡分析中處于核心地位的靶點有9個，分別為SRC、PIK3CA、PRKCA、TNF、CASP3、HRAS、RAF1、MMP9、Bcl-2。

圖6 乙型病毒性肝炎通路相關(guān)“藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖Fig.6 Viral hepatitis B pathway related “drug-active ingredient-target” network diagram

2.8 分子對接結(jié)果

采用分子對接技術(shù)對舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎的機制進行進一步探討。以PPI網(wǎng)絡分析中的核心靶點與乙型病毒性肝炎信號通路分析中的9個重疊靶點作為受體，其所對應的活性成分作為對接配體，于Schr?dinger2020 Maestro 12.4軟件中處理后進行分子對接。配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，兩者對接分數(shù)越低。結(jié)果如表2所示，對接示意圖見圖7，除PIK3CA和PRKCA 2個靶點與活性成分對接分數(shù)處于-3～-5 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ），其余7個靶點與化合物的對接得分均優(yōu)于-5 kcal/mol。分子對接結(jié)果表明，舒肝寧注射液可通過多成分干預多個靶點，調(diào)控乙型病毒性肝炎信號通路，發(fā)揮治療乙型病毒性肝炎的作用。

圖7 分子對接示意圖Fig.7 Diagram of molecular docking

表2 分子對接結(jié)果Table 2 Molecular docking results

4 討論

早在2016年，全球衛(wèi)生組織已經(jīng)發(fā)布“到2030年消除病毒性肝炎”的戰(zhàn)略目標[18]，由此可見因HBV引起的乙型病毒性肝炎目前仍屬于全球公共衛(wèi)生問題。近年來，相對于西醫(yī)的抗病毒治療法，中醫(yī)藥使用的中藥復方、中成藥治療更受歡迎。舒肝寧注射液是以《傷寒論》中的經(jīng)典名方“茵陳蒿湯”為基礎加減而成。中醫(yī)辨證論治注重扶正祛邪，而舒肝寧注射液在原有組方“祛邪”的基礎上增加了“扶正”的功效，以清熱解毒、利濕退黃為主，益氣扶正、保肝護肝為輔，突出了中醫(yī)辨證論治的特點。

本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法探討舒肝寧注射液對于乙型病毒性肝炎的治療作用機制。運用文獻檢索的方式得到舒肝寧注射液組方組成提取物中的19個活性成分。結(jié)合活性成分靶點與疾病靶點進行分析，通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，篩選出舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎的靶點有SRC、HSP90AA1、RELA、PIK3CA、EGFR等142個，對其進行聚類分析共得到6個顯著聚類團。GO功能富集對舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎靶點結(jié)果顯示，BP主要涉及對含氧化合物的反應、生物過程與細胞過程的正向調(diào)節(jié)；CC主要包括胞質(zhì)部分以及細胞質(zhì)；MF主要是蛋白的結(jié)合。KEGG通路分析顯示，IL-17信號通路、TNF信號通路、C型凝集素受體信號通路、丙型病毒性肝炎、乙型病毒性肝炎等通路可能與舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎有關(guān)。IL-17是輔助性T細胞亞群的標志性促炎細胞因子，可通過誘導新基因轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定靶mRNA來調(diào)控炎癥基因的表達[19]。

通過“藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡分析，以靈芝酸A、靈芝酸B、異綠原酸C、京尼平苷、梔子苷、黃芩苷為主要活性成分。靈芝酸A/B同屬靈芝三萜類化合物，有抗氧化、保肝護肝的效果。相關(guān)報道中，靈芝酸A可調(diào)控脂代謝、降低炎癥因子的表達、抑制核因子-κB（NF-κB）通路表達來改善多種情況造成的肝損傷[20]。異綠原酸C是一種天然有機酸，臨床上具有抗炎、抗病毒、保肝護肝等作用。Hao等[21]發(fā)現(xiàn)異綠原酸存在的抗氧化性可通過抑制乙型病毒性肝炎的指標性成分（HBsAg和HBeAg）的產(chǎn)生以達到預防、治療乙型病毒性肝炎的效果。京尼平苷是中藥梔子的主要抗炎活性成分，在保肝利膽上也有顯著作用。研究表明，京尼平苷能通過抑制NF-κB、p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等相關(guān)通路來抑制促炎因子釋放、提高抗炎因子水平而達到抗炎的效果[22]。大量研究表明，梔子苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、治療脂肪肝等作用。對于非酒精性脂肪性肝病造模地鼠，梔子苷可使天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）含量趨于正常水平[23]。CD14在肝細胞中可以被檢測，且CD14可作為脂多糖的受體，介導脂多糖發(fā)生的細胞炎癥反應。而黃芩苷可通過抑制CD14表達，從而抑制脂多糖誘導的Toll樣受體65（TLR65）/核因子-κB（NF-κB）p14通路的激活從而抑制炎癥的產(chǎn)生[24]。

在對乙型病毒性肝炎通路的數(shù)據(jù)分析中提示，組成舒肝寧注射液的5種中藥提取物的13個活性成分，靈芝酸A/B、表告依春、靛玉紅、京尼平苷、異綠原酸C等可共同作用于SRC、PIK3CA、CASP3、BCL2、TNF、RAF1、MMP9等16個有關(guān)乙型病毒性肝炎通路的靶點。研究表明，缺氧條件下SRC會在KCs（肝臟中的一類常駐巨噬細胞群）中被激活，從而達到抑制肝臟炎癥的效果[25]。研究發(fā)現(xiàn)，由乙型肝炎病毒感染相關(guān)的肝細胞癌與PIK3CA基因的突變顯著相關(guān)[26]。TNF具有很強的促炎和免疫調(diào)節(jié)能力，其中的TNFR1與TNFR2受體共同協(xié)作可對炎癥性肝病起作用[27]。細胞凋亡在肝臟疾病中有重要作用，研究表明，當由外源物質(zhì)引起的過度炎癥或氧化應激會增加肝細胞凋亡[28]，包括促凋亡標志物CASP3表達增加以及抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，最終導致肝損傷。乙型肝炎病毒的X蛋白（HBVX）的反式激活是RAF1激活的間接結(jié)果[29]。也有實驗表明MMP9的表達在具有HBV-X表達的細胞中顯著上調(diào)[30]，證明了MMP9在炎癥因子表達中的重要作用。分析發(fā)現(xiàn)，乙型病毒性肝炎通路富集到的靶點與PPI核心靶點有9個重疊基因（SRC、PIK3CA、PRKCA、TNF、CASP3、HRAS、RAF1、MMP9、Bcl-2），分子對接結(jié)果顯示，以上9個靶點與其對應的活性成分對接結(jié)果較好，提示其可能為舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎的關(guān)鍵靶點。

綜上所述，舒肝寧注射液治療乙型病毒性肝炎的分子機制可能是通過其環(huán)烯醚萜苷類、腺苷類、三萜類及吲哚類生物堿等成分干預SRC、PIK3CA、PRKCA、TNF等關(guān)鍵靶點進而調(diào)控乙型病毒性肝炎信號通路，發(fā)揮治療乙型病毒性肝炎的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突