謝靜嵐，洪閣，劉天軍

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程研究所 天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點實驗室，天津 300192

膿毒癥是機體對感染產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)失調(diào)而引起的生理學(xué)和器官功能損害的臨床綜合征，常見于基礎(chǔ)疾病嚴重或抵抗力差的患者，如嚴重創(chuàng)傷、燒傷、重癥肺炎和外科大手術(shù)等[1-2]。膿毒癥的發(fā)病率和死亡率都很高，可累及多個器官，其中腎臟是膿毒癥的易損器官之一，嚴重膿毒癥患者中約有一半的病例會發(fā)生急性腎損傷[3-4]。膿毒癥相關(guān)急性腎損傷臨床上主要表現(xiàn)為腎臟功能突然下降，肌酐和尿素氮水平增加，腎小球濾過率（GFR）和尿量減少，嚴重時甚至出現(xiàn)酸堿平衡失調(diào)、電解質(zhì)紊亂和各種全身并發(fā)癥[5-7]。膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的發(fā)病機制較為復(fù)雜，國內(nèi)外學(xué)者大多認為其與免疫炎癥反應(yīng)、微循環(huán)功能障礙和代謝重編程等有關(guān)[8-11]。目前，臨床上尚無切實可靠的膿毒癥相關(guān)急性腎損傷治療方法，常規(guī)干預(yù)措施主要以對癥支持為主，如液體復(fù)蘇、血液凈化、藥物升壓和腎臟替代等。最近有研究表明，膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的發(fā)生與腎小管上皮細胞中過量的活性氧有關(guān)，不少抗氧化劑在緩解實驗性膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中顯示出積極的作用，如N-乙酰半胱氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等[12-15]。

植物中的多酚類化合物具有很強的抗氧化活性，其可以清除活性氧自由基，防止組織器官被氧化損傷。本實驗室前期將小分子糖與多羥基酚反應(yīng)合成了一系列植物多酚類似物，體外抗氧化研究結(jié)果顯示木糖-鄰苯三酚結(jié)合物（XP）具有良好的自由基清除能力，可以顯著抑制過氧化氫誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細胞損傷[16]。隨后，嘗試將XP用于預(yù)防各種內(nèi)源性或外源性毒性物質(zhì)導(dǎo)致的大鼠急性腎損傷，發(fā)現(xiàn)其可以明顯減輕順鉑、碘海醇或脂多糖引起的腎功能下降和病理學(xué)損傷，機制與減少腎小管細胞凋亡、維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能、抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，但其具體的作用靶點和機制尚不清楚[17]。

因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接相結(jié)合的方法尋找XP改善膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的核心靶點，并分析核心靶點所涉及的炎癥信號通路，最后通過動物實驗驗證XP對炎癥通路的影響和腎臟保護作用機制，以期為臨床上膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的防治提供新思路。

1 材料

1.1 藥品

XP（白色固體粉末，本實驗室自行合成，經(jīng)HPLC面積歸一化法檢測質(zhì)量分數(shù)＞98%），化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1，相對分子質(zhì)量為384.33。

圖1 XP的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of XP

1.2 實驗動物

SD大鼠40只，雄性，SPF級，6周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0008，飼養(yǎng)于清潔級實驗動物房，溫度（25±2）℃，環(huán)境相對濕度（50±5）%，12 h/12 h晝夜交替光照，期間正常飲食、飲水。動物實驗方案由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物倫理委員會批準（批準號IRMDWLL-2023245）。

1.3 實驗試劑和儀器

脂多糖（LPS，美國Sigma公司，批號0000153963）；地塞米松磷酸鈉注射液（天津金耀集團湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，批號52212261）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號2301191907）；蘇木素、伊紅染液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號150916、150917）；戊巴比妥鈉（美國Merck公司，批號P11011）；血清肌酐（CRE）檢測試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號141123003）；血尿素氮（BUN）檢測試劑盒（廈門英科新創(chuàng)科技股份有限公司，批號2103300907）；大鼠中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白NGAL酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（浙江慧珩生物科技有限公司，批號EYX-DD02377）；大鼠腎損傷分子（KIM-1）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（上海羽朵生物科技有限公司，批號YDX1123）；BCA蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號PC0020）；磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）一抗、蛋白激酶B（Akt）一抗、p-AKT一抗（萬類生物，批號WL02240、WL0003b、WLP001a）；p-PI3K一抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號AP0854）；全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號BS-360S）。

2 方法

2.1 XP藥物靶點的預(yù)測和膿毒癥相關(guān)急性腎損傷疾病靶點的獲取

通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch）和PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html）預(yù)測XP的藥物靶點；以“l(fā)ipopolysaccharide induced acute kidney injury”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org）、Drug Bank（https://go.drugbank.com）、OMIM（https://omim.org）數(shù)據(jù)庫中檢索膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的相關(guān)靶點，合并3個數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，去重后得到膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的疾病靶點；運用Venny 2.1.0在線網(wǎng)站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）將藥物靶點和疾病靶點取交集，繪制韋恩圖，再用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/id-mapping）進行靶點信息校正，即得XP防治膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的潛在靶點。

2.2 基因本體（GO）功能及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將XP防治膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的潛在靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）進行GO功能和KEGG通路富集分析，設(shè)置生物種類為“homo sapiens”，P＜0.05。選取排名前10位的GO功能和KEGG通路條目，利用微生信在線分析平臺（https://www.bioinformatics.com.cn）繪制GO功能柱形圖和KEGG通路氣泡圖。

2.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點的篩選

將XP防治膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，刪除游離靶點，再導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化分析。根據(jù)degree值大小，選取排名前10位蛋白作為XP防治膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的核心靶點。

2.4 分子對接

采用ChemBioDraw軟件繪制XP的2D結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Schr?dinger軟件用LigPrep模塊進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和3D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，保存成sdf格式；檢索PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）下載核心靶點的3D結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Schr?dinger軟件用Protein Preparation Wizard模塊進行加氫、去水、氫鍵優(yōu)化和能量最小化，保存成pdb格式；使用Schr?dinger軟件的Glide模塊完成XP和核心靶點的分子對接，對接模式為柔性對接，對接精度為標準對接（SP），計算對接得分（docking score），并以對接結(jié)合能小于-6.0 kJ/mol作為配體和受體結(jié)合較好的判定標準，最后在PyMOL軟件中進行分子對接結(jié)果的可視化分析。

2.5 動物實驗驗證

2.5.1 膿毒癥相關(guān)急性腎損傷模型構(gòu)建、分組及給藥 將40只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、地塞米松（3 mg/kg[18]）組和XP組（200 mg/kg[19]，溶于生理鹽水），每組10只。除對照組外，其余各組大鼠均ip 10 mg/kg LPS溶液構(gòu)建膿毒癥相關(guān)急性腎損傷模型[20-22]。從造模前7 d開始，XP組ig給藥，1次/d，連續(xù)給藥7 d；對照組和模型組同時給予等體積的生理鹽水，1次/d；而地塞米松組于造模前1 h單次ip地塞米松磷酸鈉注射液[23]。

2.5.2 取材 造模后用代謝籠收集4 h內(nèi)各組大鼠的尿液，24 h后收集各組血液樣本，最終使用3%的戊巴比妥鈉進行麻醉，脊椎脫臼處死，收集大鼠腎臟并稱質(zhì)量。

2.5.3 腎功能指標評估 收集血液，離心取上清，利用全自動分析儀測定大鼠血清中CRE和BUN的水平；收集尿液，使用ELISA試劑盒檢測尿液中KIM-1和NGAL的水平。

2.5.4 腎組織病理學(xué)觀察 收集腎組織放置于4%多聚甲醛中固定24 h，腎組織脫水、石蠟包埋、4 μm切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，用樹脂封片。風(fēng)干后于顯微鏡下觀察大鼠腎臟病理情況并拍照。

2.5.5 蛋白免疫印跡法檢測大鼠腎臟組織中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表達 用組織勻漿器將組織腎臟研磨至均勻液體，4 ℃、12 000×g離心30 min，取上清液，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，使用5%的濃縮膠和10%的分離膠經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，一抗稀釋比例為1∶1 000，且按照說明書進行稀釋，4 ℃過夜，洗膜，曝光并置于凝膠成像系統(tǒng)儀顯影，最終使用Image J軟件進行Western blotting條帶灰度分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9.5.1軟件進行統(tǒng)計分析和圖形繪制。采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）進行組間比較。

3 結(jié)果

3.1 XP作用于膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的潛在靶點

通過檢索2.1項下所述數(shù)據(jù)庫進行篩選，將結(jié)果轉(zhuǎn)換為標準基因名，并經(jīng)去重合并后，得到XP藥物作用靶點167個；膿毒癥相關(guān)急性腎損傷疾病靶點共4 423個。最后利用Venny 2.1.0取交集得到XP作用于膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的潛在靶點111個，見圖2。

圖2 XP-膿毒癥致急性腎損傷Venn圖Fig.2 Venn diagram of XP and sepsis associated acute kidney injury

3.2 GO功能及KEGG通路富集分析結(jié)果

將上述潛在靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫后，進行GO功能富集分析，獲得生物過程（BP）共271條（P＜0.05），主要包括炎癥反應(yīng)、細胞凋亡過程的負調(diào)控、對外源性刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、對脂多糖的反應(yīng)、蛋白激酶B信號傳導(dǎo)的正調(diào)控等；細胞組分（CC）共60條，主要包括膜的組成、細胞外分泌體、線粒體、內(nèi)膜結(jié)合細胞器等；分子功能（MF）共100條，主要包括ATP結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等，見圖3。KEGG富集分析結(jié)果共獲得119條生物學(xué)通路，可得潛在靶點主要涉及的途徑有代謝途徑、癌癥途徑、PI3K/Akt信號通路、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、Rap1信號通路、叉頭框蛋白O（FoxO）信號通路等，見圖4。

圖3 GO功能富集分析圖Fig.3 GO functional enrichment analysis

圖4 KEGG通路富集分析圖Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis

3.3 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

PPI網(wǎng)絡(luò)見圖5，共含有111個節(jié)點，節(jié)點顏色越深，degree值越大；742條邊，代表靶點蛋白之間的相互關(guān)聯(lián)。利用Cytoscape 3.9.1插件centiscape 2.2分析了PPI網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree值降序排列，選擇排名前10位節(jié)點作為核心靶點，分別為白蛋白（ALB）、Akt1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、半胱氨酸蛋白酶（CASP3）、酪氨酸激酶（SRC）、雌激素受體1（ESR1）、熱休克蛋白90α家族A類成員1（HSP90AA1）、哈維大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、人絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）。

圖5 XP-膿毒癥相關(guān)急性腎損傷交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Target PPI network of XP -sepsis associated acute kidney injury

3.4 分子對接分析結(jié)果

使用Schr?dinger軟件包將XP分別與核心靶點進行分子對接，對接結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)XP與核心靶點的結(jié)合能均具有較好的結(jié)合活性，其數(shù)值均小于0，這表明XP與核心靶點可自發(fā)結(jié)合。分子對接的結(jié)合能越小，表明小分子配體和蛋白受體之間互作的可能性越大，可通過影響靶蛋白的結(jié)構(gòu)變化，進而調(diào)控相應(yīng)的信號通路。使用PyMol軟件進行可視化處理，可發(fā)現(xiàn)結(jié)合過程中能夠形成氫鍵，而氫鍵可以提供分子間特異性識別，這對生物體內(nèi)的分子識別和信號傳導(dǎo)起到重要作用；還可形成ππ堆積相互作用，增加了結(jié)合穩(wěn)定性，見圖6。驗證了核心靶點均可能在XP作用于膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中發(fā)揮重要作用。

表1 XP與核心靶點分子對接結(jié)果Table 1 Molecular docking of XP with core targets

圖6 XP與核心靶點分子對接可視化Fig.6 Visualization of docking between core targets and XP

3.5 動物實驗驗證

3.5.1 XP對膿毒癥相關(guān)急性腎損傷大鼠腎功能的影響 如圖7所示，與模型組比較，XP組和地塞米松預(yù)處理組CRE、BUN、KIM-1、NGAL水平均顯著降低（P＜0.001）。

圖7 XP對膿毒癥相關(guān)急性腎損傷大鼠腎功能損傷的影響（，n=10）Fig.7 Effect of XP on sepsis associated acute kidney injury kidney function damage in rats (,n=10)

3.5.2 XP對膿毒癥相關(guān)急性腎損傷大鼠腎臟組織的影響 對照組腎小管結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細胞均一排列在外周，未見明顯異常；模型組可見腎小管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴重空泡化，紊亂松散，刷狀緣丟失，腎小管上皮細胞脫落形成碎片，腎間質(zhì)水腫擴張、充滿大量炎性細胞。XP組和地塞米松預(yù)處理組可明顯改善腎小管上皮細胞空泡化、脫落及腫脹，減少了炎性細胞浸潤，見圖8。

圖8 XP對膿毒癥相關(guān)急性腎損傷大鼠腎形態(tài)學(xué)的影響（×400）Fig.8 Effect of XP on kidney morphology in sepsis associated acute kidney injury rats (×400）

3.5.3 XP對膿毒癥相關(guān)急性腎損傷大鼠腎組織PI3K/Akt通路的影響 與模型組比較，XP組和地塞米松預(yù)處理組的p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯升高（P＜0.01、0.001），見圖9。

圖9 XP對膿毒癥相關(guān)急性腎損傷大鼠腎臟PI3K/Akt通路活性的影響（，n=10）Fig.9 Effect of XP on the activity of PI3K/AKT pathway in the kidneys of sepsis associated acute kidney injury rats (,n=10)

4 討論

膿毒癥是一種發(fā)病率和死亡率都很高，由感染引起的全身炎癥反應(yīng)的綜合征，腎臟是主要受影響的器官之一[24]。在膿毒癥期間，由于缺氧、氧化反應(yīng)不完全等，自由基的產(chǎn)生急劇增加，從而抗氧化系統(tǒng)機制嚴重受損[25-26]，因此抗氧化劑在預(yù)防和治療膿毒癥相關(guān)急性腎損傷上可作為一種有效的治療策略。有研究表明綠茶中主要活性成分之一表沒食子兒茶素沒食子酸酯已經(jīng)顯示出通過清除活性氧（ROS）相關(guān)的治療來發(fā)揮腎保護作用[27]，而本課題組前期通過將醛醣或酮糖與多酚反應(yīng)，得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯的一系列類似物，發(fā)現(xiàn)XP對腎損傷的緩解具有明顯療效。XP是由D-木糖與焦性沒食子酸偶聯(lián)得到的，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與表沒食子兒茶素沒食子酸酯最為相似，且具有優(yōu)異的水溶性，制備簡單且無需催化劑，綠色環(huán)保，但在對膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的作用機制有待闡明。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過對數(shù)據(jù)庫的整合，結(jié)合分子對接及實驗驗證深入挖掘XP治療膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的潛在靶點和作用機制。

KEGG分析中，潛在靶點富集在PI3K/Akt信號通路上的數(shù)目較多。PI3K/Akt信號通路可參與炎癥、氧化應(yīng)激等多種病理過程，是調(diào)控炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路，已被證實為膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的治療靶點[28]，并且有研究表明可以通過激活PI3K/Akt信號減輕炎癥和凋亡，促進增殖達到治療膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的效果[29-31]。GO生物過程分析表明XP改善膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的潛在靶點與蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白激酶B信號傳導(dǎo)、蛋白激酶活性等有關(guān)；表明可能與PI3K/Akt蛋白激酶的活性有關(guān)。經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選得ALB、Akt1、GAPDH、CASP3、SRC、ESR1、HSP90AA1、HRAS、CCND1、MAPK1可能為XP改善膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的核心靶點，且分子對接結(jié)果顯示XP與核心靶點均能夠自發(fā)結(jié)合，其中富集在PI3K/Akt通路中的核心靶點Akt1與XP的結(jié)合能最小，為-6.385 kJ/mol，顯示出較強烈的結(jié)合能力。Akt1是Akt的異構(gòu)體之一，而Akt是PI3K下游的磷酸化激酶，Akt被PI3K/Akt通路激活后，可以抑制κB激酶的Thr23位點磷酸化，可影響κB激酶參與了細胞凋亡和炎癥的基因調(diào)節(jié)，對于靶向和控制生物合成及代謝途徑，包括細胞存活、增殖、自噬和凋亡都很重要[32]。Liu等[33]和Zhang等[34]分別在影劑急性腎損傷和LPS所致急性腎損傷模型中發(fā)現(xiàn)通過激活PI3K/Akt可減輕腎功能障礙并降低了氧化應(yīng)激水平、上皮細胞的凋亡水平及減少了腎小管損傷，此外，還可通過PI3K/Akt信號通路來誘導(dǎo)自噬去除受損的線粒體以減少氧化應(yīng)激水平[35]。因此，本研究選擇PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達驗證PI3K/Akt信號通路在XP對膿毒癥相關(guān)急性腎損傷保護作用中的影響。

實驗結(jié)果表明，膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的大鼠模型經(jīng)XP處理后，可明顯緩解大鼠腎功能障礙。另外，LPS誘導(dǎo)引起劇烈的炎癥反應(yīng)能夠產(chǎn)生和釋放大量的促炎細胞因子，導(dǎo)致腎小管上皮細胞的損傷，這被認為是膿毒癥相關(guān)急性腎損傷主要觸發(fā)因素之一[34,36-37]。本研究通過對大鼠腎臟進行HE染色可觀察到XP減輕了腎臟炎癥細胞的浸潤，減少了腎小管上皮細胞的脫落及凋亡。最后利用蛋白免疫印跡法檢測腎臟組織中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表達，結(jié)果顯示XP可顯著升高PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平。

綜上所述，XP防治膿毒癥相關(guān)急性腎損傷關(guān)鍵蛋白可能是Akt1，并且可能通過增加PI3K、Akt的磷酸化，激活了PI3K/Akt信號通路，緩解了腎功能障礙、減輕腎小管上皮細胞的炎癥及凋亡，起到了腎臟保護作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突