蒙飛，顧萬建

江蘇省中醫(yī)院 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210029

肺癌是當(dāng)今世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是排名第1位的腫瘤死因。非小細(xì)胞肺癌是鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌3種組織分型的總稱，約占肺癌發(fā)生病例的85%，大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期失去手術(shù)機(jī)會(huì)，整體5年生存率僅20%[1]。近年來靶向治療因效率高、不良反應(yīng)低而成為肺癌熱門的研究領(lǐng)域及治療方式，靶向生物標(biāo)記物的開發(fā)及臨床檢測(cè)、靶向藥物的研究和發(fā)展以及評(píng)估靶向抑制劑療效的臨床前/臨床研究取得了顯著進(jìn)展[2]。在非吸煙肺癌中常見的驅(qū)動(dòng)突變間變性淋巴瘤激酶（ALK）占非小細(xì)胞肺癌患者的5%～7%，其異?；罨缁蛲蛔?、重排及擴(kuò)增可激活下游的蛋白激酶B（Akt）、蛋白酪氨酸激酶（JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及激活轉(zhuǎn)錄因子（STAT）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2等信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，是非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的致癌驅(qū)動(dòng)突變基因[3]。針對(duì)該靶點(diǎn)的抑制劑研究已是當(dāng)前抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的熱門方向。最先上市的是輝瑞制藥公司開發(fā)的克唑替尼，在ALK陽性的晚期非小細(xì)胞肺癌治療中取得了良好的療效。但其嚴(yán)重的不良反應(yīng)也逐漸引起人們的重視，如難透過血腦屏障阻礙了其在轉(zhuǎn)移患者中的療效，易原發(fā)及繼發(fā)性耐藥，心率不齊、脫發(fā)、胃腸不良反應(yīng)及視覺障礙等嚴(yán)重不良反應(yīng)[4]。目前，新型2、3代ALK抑制劑已取得較好的臨床實(shí)驗(yàn)效果或已經(jīng)走上臨床[5-6]。此外，第4代的ALK-酪氨酸激酶抑制劑（TKI）（TPX-0131、NUV-655、Repotrectinib）也處于不同研發(fā)階段，初步結(jié)果顯示其能較好地克服復(fù)合突變，并有優(yōu)越的腦滲透性。

美國食品藥品管理局（FDA）于2017年批準(zhǔn)阿來替尼為ALK陽性患者的一線用藥，臨床證據(jù)表明其可顯著降低疾病進(jìn)展或死亡風(fēng)險(xiǎn)達(dá)57%，延長(zhǎng)患者無疾病生存時(shí)間達(dá)34.8個(gè)月，延緩腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生，給ALK陽性非小細(xì)胞肺癌患者帶來明顯的生存獲益。阿來替尼-ALK的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)表明，其苯并咔唑的C-11位羰基和ALK的Met1199的氨基形成的氫鍵是它們相互作用的關(guān)鍵，此外其5位的NH和3位的氰基也與相鄰Lys1150、Glu1167、Gly1269、Glu1270及Arg1253形成氫鍵[7]。研究表明，喹諾酮依諾沙星在多種腫瘤中具有較好的體內(nèi)外抗腫瘤作用，其作用與TRBP蛋白介導(dǎo)的microRNA加工有關(guān)[8]。本研究通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)在喹諾酮依諾沙星的C-3位修飾苯并咪唑的新化合物L(fēng)Z-106，結(jié)構(gòu)式見圖1，具有相似的阿來替尼-ALK結(jié)合特征，并通過多種分子細(xì)胞生物學(xué)手段評(píng)估了其ALK激酶抑制能力、探討了其對(duì)ALK陽性細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，對(duì)于ALK抑制劑自主研發(fā)有一定參考意義。

圖1 LZ-106化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of LZ-106

1 材料與方法

1.1 化合物及細(xì)胞系

LZ-106[2-(1-ethyl-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-yl)-1,4-dihy-dro-1,8-naphthyridin-3-yl)-1H-benzo[d]imidazole-6-carbonitrile]由中國藥科大學(xué)江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成，為淺黃色粉末，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%，經(jīng)DMSO配制成0.05 mol/L母液備用。阿來替尼（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.99%，貨號(hào)S5232，）、Akt激活劑（SC79，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，貨號(hào)S7863）購自Selleck Chemicals公司，STAT3激活多肽（Colivelin TFA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.86%，貨號(hào)HYP1061A）購自MedChemExpress（MCE）公司。

NCI-H2228細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，采用含10%胎牛血清[維森特生物技術(shù)（南京）有限公司，貨號(hào)086-150]的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 分子對(duì)接

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載ALK的蛋白結(jié)構(gòu)（pdb ID：7MK7），經(jīng)AutoDock程序（V 4.2）模擬ALK與LZ-106結(jié)合構(gòu)象。為了盡可能完整地搜索配體的構(gòu)象空間，保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)此期間保持固定的分子對(duì)接。進(jìn)行了100次單獨(dú)的遺傳算法進(jìn)行構(gòu)象搜索，以生成100個(gè)配體的對(duì)接構(gòu)象。以配體位置的質(zhì)心為中心Docking box的大小為6 nm×6 nm×6 nm。Grid box設(shè)置為0.0375 nm的足夠包圍ALK中觀察到的最大結(jié)合口袋。

1.3 分子水平激酶活性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Promega公司的ALK Kinase Enzyme System及ADP-Glo? Kinase Assay試劑盒完成。將LZ-106、阿來替尼分別自20 nmol/L往下4倍倍比稀釋10個(gè)系列梯度濃度，然后每個(gè)濃度抑制劑取1 μL加入2 ng ALK蛋白及2 μL底物室溫反應(yīng)60 min。加5 μL ADP-Glo? Reagent混勻，室溫反應(yīng)40 min終止反應(yīng)，并消耗殘留ATP，然后再加10 μL激酶檢測(cè)試劑室溫反應(yīng)30 min后經(jīng)Varioskan LUX化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H2228細(xì)胞消化后制備成2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。設(shè)置LZ-106濃度梯度（0.25、0.5、1、2、4、8、10、12、16、24 μmol/L）并配制雙倍濃度藥液，將細(xì)胞懸液和藥液等體積混勻，每孔液體體積為100 μL（即每孔1×104個(gè)細(xì)胞），接種于超低黏附96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照（僅加細(xì)胞）和3個(gè)空白孔。藥物作用24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱作用1～2 h后于450 nm處激發(fā)波長(zhǎng)讀取其吸光度（A）值。

存活率＝（A給藥－A空白）/（A對(duì)照－A空白）

1.5 Annexin V/PI細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H2228細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的細(xì)胞濃度，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待其貼壁并生長(zhǎng)至適宜細(xì)胞密度（約為70%）時(shí)，設(shè)置對(duì)照組和LZ-106（1、2、4 μmol/L）組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物處理24 h，隨后用0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，以PBS溶液清洗并重懸。然后依據(jù)Annexin VFITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）使用說明，用緩沖Buffer溶液重懸細(xì)胞，并將Annexin-V和PI染料分別加入樣品管中，避光染色20 min后經(jīng)流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur）檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Flowjo 7.6.1軟件進(jìn)行分析。同法檢測(cè)Akt激活劑SC79（8 μg/mL）和STAT3激活劑Colivelin（10 μmol/L）共同處理H2228細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。

1.6 Western blotting法檢測(cè)蛋白水平

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H2228細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的細(xì)胞濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待其貼壁并生長(zhǎng)至細(xì)胞密度約為70%時(shí)，分別加入1、2、4 μmol/L的LZ-106處理24 h。常規(guī)方法進(jìn)行p-ALKY1604、p-STAT3Y705、p-ERK1/2T202/Y204、Akt、p-AktS473（Cell signaling公司），ERK1/2、Tubulin、羊抗兔二抗（ABclonal公司），ALK、STAT3（Proteintech公司）蛋白水平檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 LZ-106與ALK的分子對(duì)接

應(yīng)用AutoDock軟件對(duì)LZ-106和ALK的分子對(duì)接構(gòu)象進(jìn)行模擬，結(jié)果證實(shí)了該化合物基本構(gòu)型與阿來替尼基本保持一致，LZ-106化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖1。其羰基能夠和ALK的關(guān)鍵鉸鏈區(qū)（hinge reign）的Met1199形成氫鍵，7位哌嗪取代基的氨基可以與Arg1120形成氫鍵[7]。此外該化合物萘啶環(huán)還可以和Arg1120和Leu1122形成p-π共軛作用，這一作用是先導(dǎo)化合物阿來替尼所不具備的（圖2）。因此推測(cè)依諾沙星衍生物L(fēng)Z-106能夠和ALK有效地結(jié)合并發(fā)揮作用。

圖2 LZ-106和ALK模擬結(jié)構(gòu)構(gòu)象（A）、結(jié)構(gòu)構(gòu)象局部放大圖（B）、LZ-106和阿來替尼在ALK蛋白中的構(gòu)象疊合圖（C）Fig.2 Simulated structural conformation of LZ-106 and ALK (A),local magnification of structural conformation(B),conformation superposition of LZ-106 and aletinib in ALK protein (C)

2.2 LZ-106的體外ALK激酶抑制作用

用4倍倍比（20 nmol/L起始）稀釋梯度濃度的LZ-106和阿來替尼進(jìn)行ALK激酶活性檢測(cè)。如圖3所示，二者均能濃度相關(guān)性地抑制ALK的激酶活性，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（15.51±2.09）、（0.60±0.12）nmol/L，表明LZ-106能在無細(xì)胞體系中有效抑制ALK激酶活性。

圖3 LZ-106和阿來替尼對(duì)ALK激酶活性影響Fig.3 Effect of LZ-106 and alectinib on ALK kinase activity

2.3 LZ-106對(duì)細(xì)胞存活率的檢測(cè)

分別用0.25、0.5、1、2、4、8、10、12、16、24 μmol/L LZ-106孵育H2228細(xì)胞12、24 h。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度的LZ-106作用后，均表現(xiàn)出對(duì)H2228細(xì)胞的活力抑制作用，且其作用強(qiáng)度具有濃度相關(guān)性（圖4），其IC50分別為（2.256±0.206）μmol/L（12 h）、（0.977±0.110）μmol/L（24 h）。

圖4 LZ-106對(duì)H2228細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effect of LZ-106 on H2228 cell survival rate

2.4 LZ-106誘導(dǎo)H2228細(xì)胞凋亡

分別用0、1、2、4 μmol/L LZ-106處理H2228細(xì)胞24 h，經(jīng)Annexin V/PI細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，能明顯濃度相關(guān)性地誘導(dǎo)H2228細(xì)胞凋亡（圖5），其凋亡率分別為（12.78±2.56）%、（20.59±2.96）%、（37.66±4.16）%（P＜0.05、0.001）。

圖5 LZ-106對(duì)H2228細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of LZ-106 on apoptosis of H2228 cells

2.5 Western blotting檢測(cè)LZ-106對(duì)ALK及相關(guān)下游通路關(guān)鍵激酶表達(dá)的影響

如圖6所示，LZ-106可以顯著降低p-ALK的水平，抑制ALK的磷酸化（P＜0.001）。此外研究表明，EML4-ALK通過激活下游Ras/ERK、PI3K/AKT和JAK3/STAT3通路以促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖及轉(zhuǎn)移[9]。因此本研究也檢測(cè)了相關(guān)通路的關(guān)鍵激酶表達(dá)水平，如圖6所示，LZ-106處理H2228細(xì)胞后，p-ERK1/2、p-STAT3的表達(dá)水平下降（P＜0.05、0.001），表明LZ-106能夠濃度相關(guān)地抑制PI3K/Akt和JAK3/STAT3通路。

圖6 LZ-106對(duì)H2228細(xì)胞中ALK及下游通路關(guān)鍵激酶活性的影響Fig.6 Effect of LZ-106 on the activity of key kinases in ALK and downstream pathways in H2228 cells

2.6 LZ-106通過PI3K/Akt和JAK3/STAT3通路誘導(dǎo)H2228細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LZ-106誘導(dǎo)H2228細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本研究采用LZ-106（4 μmol/L）與Akt激活劑SC79（8 μg/mL）、STAT3激活劑Colivelin（10 μmol/L）共同處理H2228細(xì)胞[10]。如圖7所示，通過Annexin V/PI染色經(jīng)流式分析可觀察到SC79和Colivelin可削弱LZ-106的凋亡誘導(dǎo)作用，而SC79和Colivelin單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯影響。由此表明LZ-106可能通過PI3K/Akt和JAK3/STAT3通路誘導(dǎo)H2228細(xì)胞凋亡。

圖7 LZ-106與SC79、Colivelin共同處理對(duì)H2228細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effect of LZ-106 combined with SC79 and Colivelin on apoptosis of H2228 cells

3 討論

ALK激活與數(shù)十種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，以ALK激酶為靶標(biāo)的分子靶向藥物研究逐漸成為國內(nèi)外抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。LZ-106是根據(jù)阿來替尼的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在依諾沙星的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上全新合成的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。本研究經(jīng)分子對(duì)接模擬、體外激酶實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞水平等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LZ-106能顯著地抑制ALK激酶活性，抑制EML4-ALK融合NSCLC的活力誘導(dǎo)其凋亡。且通過Western blotting以及信號(hào)通路激動(dòng)劑聯(lián)合處理，發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能是通過PI3K/Akt，JAK3/STAT3信號(hào)通路而發(fā)揮作用，但精細(xì)的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)的該先導(dǎo)化合物雖然能與ALK結(jié)合，且具有一定的ALK激酶抑制活性，但是酶活抑制能力低于阿來替尼26倍，說明其藥物結(jié)構(gòu)優(yōu)化與改造還有很長(zhǎng)的路要走。此外本研究還有一些缺陷，如細(xì)胞系的選擇僅僅針對(duì)1種ALK陽性細(xì)胞，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需要增加更多的細(xì)胞系；且后續(xù)需要開展異種移植瘤等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其體內(nèi)的抗腫瘤效果。

綜上所述，LZ-106為新一代ALK靶向藥物研發(fā)提供了全新的先導(dǎo)化合物，能較好地抑制ALK激酶活性，促進(jìn)ALK陽性細(xì)胞凋亡作用，且其對(duì)PI3K/Akt，JAK3/STAT3通路的調(diào)控可能是其作用的關(guān)鍵分子機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突