田夢凡，高青青，易雅麗，國大亮，劉玉璇

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

中藥材天麻由常年異養(yǎng)型蘭科植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的干燥塊莖制作而來，味甘，性平，歸肝經(jīng)[1]。目前已知化學(xué)成分中占比最多的是酚類化合物[2]，主要為天麻素，即4-羥甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。天麻素屬天麻中小分子酚型糖苷[3]，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、保護(hù)神經(jīng)元、改善學(xué)習(xí)記憶能力、抗精神病等作用[4]。

目前天麻素提取純化技術(shù)有限且瑕瑜互見，因此，我們致力于尋找高效、環(huán)保且易操作的新興提取、純化方法。超聲輔助酶提取兼顧了超聲的機(jī)械性能和酶的水解作用，在破碎細(xì)胞壁、增加目標(biāo)產(chǎn)物溶出、提高天麻素提取率、避免天麻素分解方面具有優(yōu)勢[5]。本試驗(yàn)還對提取液進(jìn)行分離純化。近年來，雙水相萃取作為一種高效的分離技術(shù)被越來越多科研工作者關(guān)注[6]。雙水相體系是兩種不相容聚合物（例如聚合物與鹽或聚合物與聚合物）在水性溶劑中超過一定濃度，導(dǎo)致液相分離所形成[7]。雙水相體系多用于分離蛋白質(zhì)、抗體及植物活性成分等[8]，可滿足當(dāng)前生產(chǎn)快速、經(jīng)濟(jì)和易于實(shí)施的要求[9]。

天麻素初步純化后需要再次精細(xì)純化，現(xiàn)有天麻素純化方法主要有高速逆流色譜法[10]、制備型高效液相色譜法[11]和大孔樹脂法[12]等。前兩者純化天麻素生產(chǎn)污染嚴(yán)重，且實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高，不適用于工業(yè)大生產(chǎn)。大孔吸附樹脂法吸附量大、熱穩(wěn)定性好且綠色環(huán)保[13]。因此本試驗(yàn)采用超聲輔助酶提取天麻素，通過雙水相萃取進(jìn)行初步純化，再通過大孔樹脂進(jìn)行精細(xì)純化，以提高目標(biāo)產(chǎn)物純度，為制劑研發(fā)提供保障要求。

1 材 料

1.1 試藥與試劑 天麻由河北全泰藥業(yè)提供，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源教研室主任張堅(jiān)副教授鑒定為天麻正品。天麻素對照品（批號：AF20100454，純度：98%）購于成都埃法生物科技有限公司；纖維素酶（批號：C805042）、α-淀粉酶（批號：C12227987）均購于上海麥克林生化科技有限公司；檸檬酸（批號：20200529）購于天津渤化化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨（批號：20230103）購于福晨化學(xué)試劑有限公司；D301型弱堿性苯乙烯系陰離子樹脂（批號：20210720）、ADS-17大孔吸附樹脂（批號：20210720）、HPD100大孔吸附樹脂（批號：20231013）、AB-8型大孔吸附樹脂（批號：20210715）均購于北京索萊寶科技有限公司；乙腈為色譜純；無水乙醇為分析純。

1.2 主要儀器 HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；JP-060S型超聲波清洗器（深圳潔盟有限公司）；PHS-25型數(shù)顯酸度計(jì)（雷磁分析儀器廠）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；LC2000型高效液相色譜儀（上海天普分析儀器有限公司）；HY-2型調(diào)速多用振蕩器（江蘇榮華儀器制造有限公司）；L-530型離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 天麻素含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為GS-120-5 C18EX（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液（3∶97）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為220 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取5.05 mg天麻素對照品，置于25 mL容量瓶中，加乙腈-水（3∶97）溶液定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.202 mg/mL的天麻素對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取干燥天麻塊莖粉碎，過30目篩，稱取天麻粗粉2.0 g于具塞錐形瓶，按0.5%酶比例加入α-淀粉酶，按1∶30料液比加入pH值=7的溶劑，在60 ℃水浴鍋中提取60 min，后經(jīng)超聲處理（功率：180 W，頻率：40 kHz）30 min，于100 ℃中將酶滅活10 min，濾去藥渣，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至生藥質(zhì)量濃度為0.1 g/mL。

2.2 天麻素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，于10 mL容量瓶，加乙腈-水（3∶97）溶液定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.020 2、0.040 4、0.060 6、0.080 8、0.101 0、0.121 2、0.141 4 mg/mL的天麻素溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，繪制天麻素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 提取工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)考察 基于“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法及其他條件固定，對酶種類（纖維素酶、α-淀粉酶）及比例（0∶0、3∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶3）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）、加酶量（0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%）、酶解時間（20、40、60、80、100 min）、酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）、酶解pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以天麻素提取量為指標(biāo)，考察不同因素對天麻中天麻素提取量的影響。

2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選天麻素提取工藝 根據(jù)單因素考察結(jié)果，選取對天麻素提取量影響較大的4個因素[料液比（A）、加酶量（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）]用正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)

2.3.3 最佳工藝驗(yàn)證 參照最優(yōu)正交試驗(yàn)工藝參數(shù)提取3批天麻素，計(jì)算天麻素含量，驗(yàn)證工藝穩(wěn)定性。

2.4 純化工藝優(yōu)化

2.4.1 雙水相萃取初步純化天麻素

2.4.1.1 雙水相系圖繪制 參照ALBERTSSON P A[14]的濁點(diǎn)滴定方法繪制雙水相體系圖，操作如下：稱取一定量硫酸銨溶于去離子水，待完全溶解后滴加無水乙醇并震蕩，加至溶液出現(xiàn)渾濁為止，記錄消耗無水乙醇的體積。再向體系中滴加去離子水并震蕩，加至溶液重新變?yōu)槌吻澹涗浰尤ルx子水體積。反復(fù)進(jìn)行上述操作，記錄每次加入乙醇和去離子水體積，計(jì)算硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)，繪制雙水相系圖。

2.4.1.2 雙水相萃取工藝 取一定量天麻提取液，加入一定量的硫酸銨，溶解后置4 ℃冰箱冷藏12 h，進(jìn)行低溫鹽析反應(yīng)，經(jīng)3 000 r/min（離心半徑為93 mm）離心5 min，棄去鹽析出的不溶物，將上清液按一定乙醇體積分?jǐn)?shù)加入乙醇，振搖5 min，靜置，待分層清晰穩(wěn)定后，吸取上層液測定天麻素含量。

2.4.1.3 雙水相萃取工藝參數(shù)考察 基于“2.4.1.2”項(xiàng)下方法及其他條件固定，根據(jù)雙水相系圖和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，對硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（12.5%、15.0%、17.5%、20.0%、22.5%）、提取液濃度（0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)（40.0%、42.5%、45.0%、47.5%、50.0%）進(jìn)行考察，計(jì)算天麻素萃取量。

2.4.1.4 雙水相萃取工藝驗(yàn)證 將所得雙水相萃取最佳工藝參數(shù)進(jìn)行天麻素萃取，驗(yàn)證3批。

2.4.2 大孔樹脂純化天麻素

2.4.2.1 大孔樹脂純化工藝 （1）大孔樹脂預(yù)處理：95%乙醇浸沒大孔樹脂（HPD100、AB-8、ADS-17、D301）24 h，并沖洗至白色渾濁徹底除去，后用蒸餾水沖洗至無醇味，依次用5%HCl和5%NaOH分別浸泡大孔樹脂4 h后用蒸餾水沖洗至中性，裝柱備用。

（2）靜態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)：稱取各型號大孔樹脂1.0 g于具塞錐形瓶中，分別加入20 mL萃取液，于25 ℃條件下以100 r/min（震蕩幅度為20 mm）在恒溫震蕩儀上震蕩24 h，測定上清液中天麻素含量，計(jì)算靜態(tài)吸附率和靜態(tài)吸附量。將吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗后用70%乙醇解吸，相同條件下震蕩24 h。檢測解吸出液體中天麻素含量，計(jì)算靜態(tài)解吸率和靜態(tài)解吸量。

（C0：吸附前天麻素濃度；C1：吸附后上清液天麻素濃度；V1：吸附后上清液體積；M：大孔樹脂質(zhì)量；C2：解吸液天麻素濃度；V2：解吸液體積。）

（3）動態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)：取一定量篩選好的大孔樹脂，預(yù)處理后，濕法裝入潔凈玻璃色譜柱，取一定濃度萃取液以一定流速上樣，直至大孔樹脂吸附飽和，收集未被吸附的流出液，計(jì)算吸附量和吸附率。后用大量蒸餾水沖洗至無萃取液殘留。用一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇以一定流速洗脫至完全，收集洗脫液，計(jì)算解吸量和解吸率。

2.4.2.2 大孔樹脂純化工藝參數(shù)考察 利用靜態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)對大孔樹脂型號進(jìn)行篩選，對上樣液濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL）和洗脫液體積分?jǐn)?shù)（10%、30%、50%、70%、90%）進(jìn)行考察；利用動態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)對上樣流速（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 BV/h）和徑高比（1∶3、1∶5、1∶7）進(jìn)行考察；后根據(jù)考察結(jié)果進(jìn)行上樣量考察，并對洗脫流速（2、3、4、5、6 BV/h）進(jìn)行考察，最后對洗脫劑用量進(jìn)行考察。

2.4.2.3 大孔樹脂純化工藝驗(yàn)證 將所得大孔樹脂最佳工藝參數(shù)進(jìn)行天麻素純化驗(yàn)證，共驗(yàn)證3批。

3 結(jié) 果

3.1 天麻素標(biāo)準(zhǔn)曲線 對天麻素對照品質(zhì)量濃度和峰面積進(jìn)行線性關(guān)系考察，得到回歸方程：y=847 536x+2 240.7，r=0.999 7，說明天麻素在0.020 2～0.141 4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。（見圖1）

圖1 天麻素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 提取工藝優(yōu)化

3.2.1 單因素試驗(yàn)考察結(jié)果 由圖2a可知，加纖維素酶和α-淀粉酶明顯有助于提高天麻素提取量，且天麻素提取量隨著α-淀粉酶所占比例增加而逐漸提高，當(dāng)酶全部為α-淀粉酶時，天麻素提取量達(dá)到最高，且纖維素酶和α-淀粉酶沒有協(xié)同作用，因此，選擇單獨(dú)用α-淀粉酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。

圖2 超聲輔助酶提取單因素試驗(yàn)考察結(jié)果圖

由圖2b可知，天麻素提取量隨著加酶量的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。在加酶量到達(dá)0.5%時，天麻素提取率達(dá)到最高，后下降原因猜測是加酶量過多，吸附包裹在藥材表面，從而影響有效成分溶出。因此，選擇加酶量0.5%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖2c可知，天麻素提取量隨料液比增大而呈現(xiàn)先增大后減小趨勢。在料液比為1∶30時，天麻素提取量最大，推測可能原因是隨料液比增加，使液體體積在增加，體系的黏度降低，天麻素較容易提取出來。當(dāng)料液比超過1∶30，酶的有效作用濃度和底物濃度被稀釋，酶的結(jié)合能力也隨之降低，從而使天麻素溶出降低。因此，選擇料液比為1∶30進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖2d可知，天麻素提取量隨著酶解時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。在酶解時間達(dá)到60 min時，天麻素提取量達(dá)到最高。酶解時間過長導(dǎo)致有效成分性質(zhì)改變，從而降低了天麻素提取量。因此，選擇酶解時間60 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖2e可知，天麻素提取量隨著酶解溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。在酶解溫度達(dá)到50℃時，天麻素提取量達(dá)到最高，后下降原因是溫度較高，酶活性降低，從而影響有效成分提取。因此，選擇酶解溫度50 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖2f可知，天麻素提取量隨著酶解pH值的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。在酶解pH值達(dá)到5.5時，天麻素提取量達(dá)到最高；α-淀粉酶活性受pH值影響。pH值=5.5時，α-淀粉酶發(fā)揮最大活性，后隨pH值增大而活性降低。因此選擇pH值=5.5進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2，4個因素對天麻素提取量影響順序?yàn)椋篈>C>B>D。因此天麻素提取量的正交優(yōu)化試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B3C3D3，即料液比（g/mL）為1∶30，加酶量（g/g）為0.8%，酶解時間為80 min，酶解溫度為60 ℃。方差分析見表3，因素A、B、C、D對天麻素提取量的影響均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

表2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

3.2.3 最佳提取工藝驗(yàn)證 按照天麻素提取量的正交優(yōu)化試驗(yàn)最優(yōu)組合A2B3C3D3，即料液比（g/mL）為1∶30，加酶量（g/g）為0.8%，酶解時間為80 min，酶解溫度為60 ℃，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得天麻素提取量結(jié)果依次為5.826、5.686、5.629 mg/g，平均值為5.714 mg/g，RSD值為1.77%，表明最優(yōu)條件下提取天麻中天麻素工藝較為穩(wěn)定可靠，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3.3 純化工藝考察結(jié)果

3.3.1 雙水相萃取

3.3.1.1 雙水相系圖繪制 乙醇-硫酸銨雙水相系圖見圖3。圖中曲線為雙水相臨界點(diǎn)，曲線下方是均一相區(qū)，上方是雙水相區(qū)，在雙水相體系中有機(jī)溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與無機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。雙水相體系選擇應(yīng)遵從既能成相又不飽和析出原則，選擇曲線上方合適乙醇體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3.3.1.2 雙水相萃取工藝參數(shù)考察 由圖4a可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于40%時，體系不能形成兩相；乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時，會有鹽析出。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，兩相的體積比亦隨之增大，原因是乙醇奪取鹽相中水分子，上相體積隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而增加，且上相中乙醇的濃度是增加的。這有利于天麻素更多分配到上相中，因此天麻素萃取量增大。最終選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為47.5%。

圖4 雙水相萃取工藝考察結(jié)果

由圖4b可知，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，萃取量先增加，到硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%時達(dá)到最大，而后呈現(xiàn)變化幅度較小的下降趨勢。其原理是隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，萃取逐漸達(dá)到完全，而超過17.5%后，繼續(xù)增加鹽濃度會爭奪水導(dǎo)致萃取量下降。在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%時，分配系數(shù)和萃取率均達(dá)到各自的最大值。考慮到節(jié)省成本，選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.0%。

由圖4c可知，當(dāng)提取液濃度高于0.2 g/mL時，隨提取液質(zhì)量濃度增加，天麻素萃取量降低，原因是濃度過高，乙醇和鹽加入量變低，導(dǎo)致提取不完全，提取液質(zhì)量濃度低于0.2 g/mL，趨于平穩(wěn)。所以選擇0.2 g/mL提取液濃度。

3.3.2 大孔樹脂純化工藝

3.3.2.1 大孔樹脂型號篩選 由圖5a可知，吸附率：HPD100＞D301＞ADS17＞AB-8；解吸率：AB-8＞HPD100＞ADS-17＞D301，綜合考量4種大孔樹脂吸附率和解吸率，選擇HPD100進(jìn)行后續(xù)處理。

圖5 大孔樹脂純化工藝考察結(jié)果

3.3.2.2 上樣濃度篩選 由圖5b可知，天麻素上樣濃度為0.1～0.2 g/mL時，吸附率變化不大且均大于50%；天麻素上樣濃度高于0.2 g/mL時，吸附率隨上樣濃度升高逐漸降低。原因是低濃度天麻素萃取液經(jīng)過大孔樹脂時，樹脂吸附量有限，當(dāng)濃度大于0.2 g/mL時，大孔樹脂較難吸附完全?？紤]到吸附效率等因素，選擇天麻素上樣濃度為0.2 g/mL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.3.2.3 徑高比 由圖5c可知，徑高比為1∶5時吸附量和吸附率均達(dá)到最大，猜測原因是徑高比較小時，對天麻素上樣液吸附不完全而導(dǎo)致浪費(fèi)較多；徑高比越大，樹脂吸附越不飽和，樹脂利用越不充分。因此選擇徑高比為1∶5進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.3.2.4 上樣流速考察 由圖5d可知，隨著天麻素上樣液流速的增大，大孔樹脂對天麻素的吸附率均呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)天麻素上樣液流速在2～3 BV/h時，吸附率趨向平穩(wěn)。當(dāng)天麻素上樣液流速大于3 BV/h時，大孔樹脂對天麻素的吸附率呈顯著降低趨勢?？紤]到吸附效率等因素，選擇3 BV/h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.3.2.5 上樣量考察 由圖5e可知，上樣量達(dá)到60 mL時，天麻素已經(jīng)發(fā)生泄露；上樣量達(dá)到100 mL時，天麻素的質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL，達(dá)到上樣液濃度的1/10；上樣量超過180 mL后上樣量與泄漏量達(dá)到動態(tài)平衡，此時大孔樹脂吸附飽和。因此選擇上樣量為100 mL。

3.3.2.6 洗脫液體積分?jǐn)?shù)考察 由圖5f可知，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，解吸率先增加后減小。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時，解吸率達(dá)到最高，為98.4%。因此選擇洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.3.2.7 洗脫流速考察 由圖5 g可知，解吸率隨洗脫流速增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，在洗脫流速為4 BV/h時解吸率最大。洗脫流速過快導(dǎo)致30%的乙醇大孔樹脂上停留時間短，無法將天麻素解吸完全，因此選擇洗脫流速為4 BV/h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.3.2.8 洗脫劑用量考察 由圖5h可知，隨著洗脫液用量增多，洗脫的天麻素質(zhì)量濃度不斷增大。當(dāng)30%乙醇用量為90 mL時，洗脫出天麻素質(zhì)量濃度達(dá)到最高，繼續(xù)洗脫，洗脫出天麻素質(zhì)量濃度持續(xù)下降。當(dāng)洗脫液體積增加到230 mL時，洗脫出天麻素質(zhì)量濃度約為洗脫液用量為90 mL時的1/25，表明被大孔樹脂吸附的天麻素基本被洗脫完全，因此選擇洗脫劑用量為230 mL。

3.3.3 試驗(yàn)驗(yàn)證 經(jīng)試驗(yàn)選擇雙水相初步純化天麻素最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為47.5%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.0%，提取液濃度為0.2 g/mL。選擇大孔樹脂進(jìn)一步純化天麻素最佳工藝為選擇HPD100大孔樹脂，上樣濃度為0.2 g/mL，徑高比為1∶5，上樣流速為3 BV/h，上樣量為100 mL，洗脫液體積分?jǐn)?shù)為30.0%，洗脫流速為4 BV/h，洗脫劑用量為230 mL。3批試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果見表4。純化后的天麻素純度比純化前提高了5.43倍，純化效果顯著。

表4 純化工藝驗(yàn)證結(jié)果

4 討 論

天麻始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[15]，被列為“上品”，性溫和，有息風(fēng)通絡(luò)、平肝止痙之功效。天麻常配伍川芎、半夏、鉤藤等藥物治療頭痛類病證[16]。近年來，對天麻藥用研究愈來愈多。本研究著眼于天麻中含量較多，功效研究較全面的酚類化合物天麻素，考慮建立高效的提取純化方法，為后續(xù)制劑及病證治療奠定基礎(chǔ)。目前天麻素提取方法主要有傳統(tǒng)浸泡提法、熱回流提取法等。這些方法耗時長且效率低，存在溶劑安全問題[17]。相較而言，超聲輔助酶提取方法提取效率高、綠色環(huán)保[18]。其原理是利用酶的水解性使植物細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)組分中的有效成分溶出，并且利用超聲波產(chǎn)生空化效應(yīng)和強(qiáng)烈的振動使藥材細(xì)胞壁破碎，從而促進(jìn)藥材中的有效成分轉(zhuǎn)移至提取溶劑中[19]。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最佳提取工藝為：料液比（g/mL）為1∶30，加酶量（g/g）為0.8%，酶解時間為80 min，酶解溫度為60 ℃，酶解pH值為5.5。3批驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果也證明該工藝穩(wěn)定。

本研究采用雙水相體系進(jìn)行初步分離，原理是利用天麻素在上、下相優(yōu)先分布的分配系數(shù)會因電荷作用、化學(xué)鍵產(chǎn)生的影響發(fā)生相應(yīng)的變化，達(dá)到分離目的[20]。此方法耗能低、耗材少，具有靈活性和可靠性。考察最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為47.5%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.0%，天麻素提取液濃度為0.2 g/mL。吸附性大孔樹脂是一種高度交聯(lián)的非離子樹脂，吸附/解吸機(jī)制受氫鍵和范德華力的調(diào)節(jié)[21]，同時大孔吸附樹脂的多孔結(jié)構(gòu)使其具有分子篩作用[22]。本研究通過試驗(yàn)明晰最佳上樣和洗脫條件，以達(dá)到最好的分離純化效果。此前有研究純化天麻素純度可達(dá)到20.14 mg/g[12]，本研究分離純化效果更優(yōu)。最佳工藝為選擇HPD100大孔樹脂，上樣濃度為0.2 g/mL，徑高比為1∶5，上樣流速為3 BV/h，上樣量為100 mL，洗脫液體積分?jǐn)?shù)為30%，洗脫流速為4 BV/h，洗脫劑用量為230 mL。3批試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示純化后的天麻素純度比純化前提高了5.43倍，純化效果顯著。

天麻素提取純化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：（1）通過預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)證超聲輔助酶提取天麻素效果優(yōu)于單純超聲提取和酶提??；（2）與傳統(tǒng)雙水相體系先配制分層后再加提取液不同，本研究采用先鹽析，待除去鹽析出的雜質(zhì)后再加醇進(jìn)行雙水相萃取，分離效果更佳；（3）天麻素高效、可工業(yè)化純化始終是個難點(diǎn)。采用其他方法，如硅膠色譜法、分子印跡法等進(jìn)行純化，可能取得更理想化成果，從而為天麻素成分深入研究和應(yīng)用提供技術(shù)支持。