黃華花，鄭姍姍，許燕瑜，鄭淑文，陳泓旭

（廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系/廈門市中藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省中藥精加工與健康產(chǎn)品開發(fā)重點(diǎn)研究室，福建 廈門 361023）

昆布為海帶科植物海帶Laminaria japonica Aresch.的干燥葉狀體[1]，藥食兩用，多分布于遼寧、山東、浙江、福建等地?，F(xiàn)代研究表明，昆布具有抗氧化[2-3]、抗腫瘤[4-5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等藥理作用，其含有的多糖類[7]、類胡蘿卜素類[8]、多酚類[9]活性成分可能是其發(fā)揮上述藥理作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。關(guān)于昆布的抗氧化研究目前主要集中在昆布多糖[10]、昆布多酚[9]，而抗氧化活性成分研究?jī)H證實(shí)了巖藻黃質(zhì)的抗氧化作用[11]。因此，本研究在現(xiàn)有昆布指紋圖譜研究[12]的基礎(chǔ)上，對(duì)不同產(chǎn)地昆布化學(xué)成分和自由基清除活性進(jìn)行譜效關(guān)系研究，篩選昆布自由基清除活性的有效成分群，為后期昆布抗氧化活性成分的篩選提供參考。

1 材 料

1.1 儀器 多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GO1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；ME204型電子天平、XPE105型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥材與試劑 11批昆布樣品產(chǎn)地信息見表1，經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院鮑紅娟副教授鑒定為昆布Laminaria japonica Aresch.正品。2,2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（批號(hào)：H09N11B130256）、1,1-二苯基-2-苦基肼（批號(hào)：W27F10E81251）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；維生素C（VC）（批號(hào)：1140552011）購(gòu)于石藥集團(tuán)維生藥業(yè)（石家莊）有限公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）（批號(hào)：B2124221）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、過(guò)硫酸鉀均為分析純，購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司。

表1 樣品產(chǎn)地信息

2 方 法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取昆布樣品適量，粉碎，過(guò)40目篩，取2.5 g，精密稱定，精密加入甲醇10 mL，超聲（功率：900 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，濾過(guò)，即得[12]。

2.1.2 陽(yáng)性對(duì)照液的制備 取VC、Trolox對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.500 0、0.415 0 mg/mL的陽(yáng)性對(duì)照液，即得。

2.1.3 DPPH溶液的制備 取DPPH適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的DPPH儲(chǔ)備液，陰暗處放置。

2.1.4 ABTS溶液的制備 取ABTS、K2S2O4適量，精密稱定，加蒸餾水制成濃度分別為7、140 mmol/L的溶液。取K2S2O4溶液440 μL與ABTS溶液25 mL混合，搖勻，陰暗處反應(yīng)12～16 h，用甲醇稀釋至734 nm處吸光值為0.6～0.8。

2.2 自由基清除活性測(cè)定

2.2.1 DPPH自由基清除活性測(cè)定及IC50的計(jì)算 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液及“2.1.2”項(xiàng)下VC陽(yáng)性對(duì)照液，加甲醇按一定比例稀釋成5個(gè)系列濃度的溶液。按要求精密吸取各溶液，分別混勻，陰暗處反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算清除率：

其中，Ai為各溶液100 μL+DPPH溶液100 μL的吸光度，Aj為各溶液100 μL+甲醇100 μL的吸光度，A0為甲醇100 μL+DPPH溶液100 μL的吸光度。

運(yùn)用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行probit回歸，預(yù)測(cè)樣品的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（The half inhibiting concentration，IC50），其值越小，表明自由基清除活性越強(qiáng)。

2.2.2 ABTS自由基清除活性測(cè)定及IC50的計(jì)算 按“2.2.1”項(xiàng)下方法，以Trolox為陽(yáng)性對(duì)照液，于734 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算ABTS自由基清除率并預(yù)測(cè)樣品的IC50。

2.3 譜效關(guān)系分析

2.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析法 利用Excel 2019[13]，使用均值法對(duì)各批昆布樣品特征峰的峰面積和清除自由基作用的IC50進(jìn)行無(wú)量綱化處理；將變換后的清除自由基作用的IC50作為母序列記為Y0（m），特征峰峰面積作為子序列記為Yi（m）；求母序列與子序列的絕對(duì)差值Δoi（m），Δoi（m）=|Yo（m）-Yi（m）|，其中1≤i≤m；計(jì)算相應(yīng)的關(guān)聯(lián)系數(shù)Loi（k），Loi（k）=（Δmin+ρΔmax），其中ρ為分辨系數(shù)，本試驗(yàn)中ρ取0.5；再計(jì)算關(guān)聯(lián)度其中N為子序列數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)；最后將關(guān)聯(lián)度排列，形成關(guān)聯(lián)序。關(guān)聯(lián)度反映了母序列和子序列的相關(guān)性，其中關(guān)聯(lián)度＞0.6時(shí)，表明有關(guān)聯(lián)性；關(guān)聯(lián)度＞0.8時(shí)，表明有較大關(guān)聯(lián)性。因此可根據(jù)關(guān)聯(lián)度排序結(jié)果篩選出與自由基清除活性相關(guān)的特征峰。

2.3.2 偏最小二乘回歸分析法 將各批昆布樣品特征峰的峰面積作為自變量（X），清除自由基作用的IC50作為因變量（Y），利用SIMCA-P 14.1軟件，建立偏最小二乘回歸方程，分別篩選出與自由基清除活性相關(guān)的特征峰。

3 結(jié) 果

3.1 指紋圖譜研究 前期研究建立了11批昆布樣品的超高效液相（Ultra performance liquid chromatography, UPLC）指紋圖譜[12]，確定了33個(gè)共有峰。（見圖1～2、表2）

圖1 樣品UPLC 疊加指紋圖譜

圖2 樣品UPLC 對(duì)照指紋圖譜

表2 各共有峰的峰面積

3.2 自由基清除活性測(cè)定結(jié)果 11批昆布樣品對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基均表現(xiàn)出良好清除活性。DPPH自由基清除活性的強(qiáng)弱依次為S1＞S8＞S3＞S6＞S5＞S11＞S2＞S4＞S9＞S7＞S10，ABTS自由基清除活性的強(qiáng)弱依次為S1＞S8＞S7＞S5＞S3＞S2＞S11＞S6＞S10＞S4＞S9。（見圖3～4）

圖3 樣品DPPH 自由基與ABTS 自由基清除活性比較

圖4 樣品清除自由基作用的IC50 比較

3.3 譜效關(guān)系分析

3.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析法 按“2.3.1”項(xiàng)下方法計(jì)算關(guān)聯(lián)度，昆布樣品UPLC指紋圖譜與清除DPPH自由基活性關(guān)聯(lián)度見表3。排序結(jié)果為：X24＞X21＞X22＞X4＞X27＞X28＞X23＞X29＞X9＞X18＞X17＞X12＞X25＞X20＞X10＞X2＞X33＞X31＞X5＞X19＞X6＞X3＞X13＞X14＞X16＞X32＞X15＞X11＞X26＞X8＞X1＞X30＞X7，其中X24、X21、X22、X4、X27、X28、X23、X29、X9、X18、X17、X12、X25、X20、X10的關(guān)聯(lián)度＞0.8[14]，因此認(rèn)為這些特征峰對(duì)清除DPPH自由基的貢獻(xiàn)程度較大。

表3 樣品UPLC指紋圖譜與清除DPPH自由基活性關(guān)聯(lián)度

昆布樣品UPLC指紋圖譜與清除ABTS自由基活性關(guān)聯(lián)度見表4。排序結(jié)果為：X18＞X22＞X9＞X4＞X24＞X12＞X17＞X27＞X20＞X33＞X21＞X10＞X28＞X2＞X29＞X6＞X19＞X3＞X16＞X30＞X23＞X13＞X5＞X25＞X14＞X31＞X3＞X11＞X15＞X1＞X26＞X8＞X7，其中X18、X22、X9、X4、X24、X12、X17、X27的關(guān)聯(lián)度＞0.8，因此這些特征峰對(duì)清除ABTS自由基的貢獻(xiàn)程度較大。

表4 樣品UPLC 指紋圖譜與清除ABTS 自由基活性關(guān)聯(lián)度

3.3.2 偏最小二乘回歸分析法 按“2.3.2”項(xiàng)下方法建立回歸方程，昆布樣品清除DPPH自由基的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)結(jié)果見圖5A，得偏最小二乘回歸方程：

圖5 樣品清除DPPH 自由基的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)圖和VIP 貢獻(xiàn)圖

Y=-0.180 2X1+0.403 8X2+0.030 3X3+0.239 8X4-0.324 2X5+0.221 8X6-0.289 7X7-0.538 0X8+0.575 3X9-0.151 8X10+0.028 7X11+0.3533X12+0.0719X13+0.3891X14+0.0071X15+0.0887X16-0.0569X17-0.1244X18-0.0032X19+0.6002X20-0.1663X21+0.0658X22+0.6027X23-0.561 3X24+0.016 4X25+0.017 0X26-0.123 4X27-0.456 0X28-0.132 8X29-0.098 6X30+0.126 5X31+0.561 5X32+0.131 6X33?；貧w系數(shù)的絕對(duì)值越大，表明對(duì)因變量（IC50）的影響越大[15]。因IC50值越小，DPPH自由基清除活性越強(qiáng)。其中X1、X5、X7、X8、X10、X17、X18、X19、X21、X24、X27、X28、X29、X30的回歸系數(shù)＜0，表明這些特征峰對(duì)昆布清除DPPH自由基作用有貢獻(xiàn)。

與此同時(shí)，變量重要性投影（Variable importance in the projection，VIP）越大，說(shuō)明其對(duì)因變量的解釋能力越強(qiáng)[16]。VIP分析結(jié)果見圖5B。其中X23、X28、X32、X33、X2、X14、X20、X24、X27、X31、X26、X25、X29、X30、X8、X18的VIP值＞1，且X28、X24、X27、X29、X30、X8、X18的相關(guān)系數(shù)＜0，表明這些特征峰所代表的化學(xué)物質(zhì)可能是昆布清除DPPH自由基作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

按“2.3.2”項(xiàng)下方法建立回歸方程，昆布樣品清除ABTS自由基的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)結(jié)果見圖6A，得偏最小二乘回歸方程：Y=0.017 5X1+0.180 1X2-0.023 3X3+0.167 2X4-0.044 1X5-0.024 6 X6-0.110 2X7-0.106 7X8+0.189 4X9+0.132 8X10+0.043 4X11+0.103 2 X12-0.0349X13+0.1054X14-0.0840X15+0.0672X16-0.0051X17-0.2144 X18+0.0830X19+0.2776X20+0.0698X21+0.0872X22+0.3375X23-0.6773 X24-0.0644X25+0.0795X26+0.0797X27+0.0290X28-0.0576X29-0.465 1 X30+0.320 2X31+0.778 8X32-0.400 1X33。其中X3、X5、X6、X7、X8、X13、X15、X17、X18、X24、X25、X29、X30、X33的回歸系數(shù)＜0，表明這些峰對(duì)昆布清除ABTS自由基作用有貢獻(xiàn)。

圖6 樣品清除ABTS 自由基的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)圖和VIP 貢獻(xiàn)圖

VIP分析結(jié)果見圖6B，其中X23、X31、X32、X30、X25、X1、X2、X18、X14、X24、X33、X17、X28的VIP值＞1，且X30、X25、X18、X24、X33、X17的相關(guān)系數(shù)＜0，表明這些特征峰所代表的化學(xué)物質(zhì)可能是昆布清除ABTS自由基作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 討 論

4.1 抗氧化方法的選擇 目前常用的抗氧化評(píng)價(jià)方法有DPPH法、ABTS法、FRAP法、超氧陰離子自由基清除法、羥自由基清除法等[17-18]。DPPH法用于體外測(cè)定物質(zhì)總抗氧化能力，是目前使用最為廣泛的檢測(cè)自由基清除能力的方法之一；ABTS法簡(jiǎn)單快捷，不僅可測(cè)定水溶性及脂溶性天然產(chǎn)物抗氧化活性，還可測(cè)定酸性、中性及弱堿性化合物的自由基清除能力。本研究采用這兩種方法來(lái)綜合評(píng)價(jià)昆布樣品的自由基清除活性，能夠獲得比較客觀真實(shí)的自由基清除活性評(píng)價(jià)。

4.2 分析方法的選擇 目前常用的數(shù)據(jù)分析方法有偏最小二乘回歸分析法、灰色關(guān)聯(lián)度分析法、多元線性回歸分析法、主成分分析法、聚類分析法等[19]。偏最小二乘回歸分析法融合了主成分分析、典型相關(guān)分析和多元線性回歸分析3種分析手段，能夠在模型自變量存在嚴(yán)重多重相關(guān)性且樣本量較少的情況下進(jìn)行回歸分析[20]；灰色關(guān)聯(lián)度分析法來(lái)源于灰色系統(tǒng)理論，因其具有模糊性的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于中藥譜效關(guān)系、質(zhì)量評(píng)價(jià)研究中[21-22]。本研究采用灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)合偏最小二乘回歸分析法，可以較為科學(xué)、合理地篩選出與昆布自由基清除活性相關(guān)的成分。

本研究在前期已建立的昆布UPLC指紋圖譜基礎(chǔ)上，通過(guò)DPPH與ABTS法測(cè)定11批昆布樣品自由基清除活性的IC50，并采用灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)合偏最小二乘回歸分析法構(gòu)建昆布自由基清除活性譜效關(guān)系?；疑P(guān)聯(lián)度法和偏最小二乘回歸法結(jié)果均表明特征峰X18、X24對(duì)昆布清除自由基作用有貢獻(xiàn)，其代表的成分可能為昆布清除自由基作用的主要活性成分。