吳 丹，李潔芳，劉 君

（長沙市第四醫(yī)院，湖南 長沙 410006）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫疾病，可能與自身免疫、遺傳、感染、吸煙等因素有關(guān)，但確切病因還不明確，尚無有效的預(yù)防措施[1]。臨床主要采用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物對RA進行治療，但胃腸道反應(yīng)、肝功能損傷等副作用明顯[2]。其中甲氨蝶呤是治療RA的一線藥物。烏頭湯（Wutou decoction，WTD）可通過減少炎癥因子的釋放，調(diào)節(jié)血液免疫因子水平，來減輕關(guān)節(jié)疼痛。WTD治療RA的臨床療效佳，但其作用機制尚未完全闡明[3]。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）通路是決定滑膜炎癥嚴重程度的重要因素[4]。故本研究擬探討WTD聯(lián)合甲氨蝶呤治療大鼠RA的療效及其與p38MAPK通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 75只6周齡雄性Wistar大鼠，購自湖南師范大學(xué)動物中心，動物生產(chǎn)許可證批號：SYXK（湘）2019-0008，體質(zhì)量為（210.65±25.56）g。實驗過程中所有大鼠均處在無病原體條件下，恒溫（25±2）℃，相對濕度（45%～55%），12 h光/12 h暗循環(huán)飼養(yǎng)籠，大鼠可隨意飲食。本研究通過長沙市第四醫(yī)院倫理委員會審核批準（倫理審查批號：2018-0224）。

1.2 藥物與試劑 WTD：制川烏，白芍，麻黃，炙甘草，黃芪。中藥飲片均于本院中藥房采購，由藥學(xué)部鄧菲藥師鑒定為正品。制川烏、白芍、麻黃、炙甘草、黃芪的質(zhì)量比例為6∶9∶9∶9∶9。上述藥物混合，進行2次煎煮，煎煮時間均為1.5 h，過濾，合并2次濾液。旋蒸濃縮至所需體積，質(zhì)量濃度為0.4 g/mL，藥液放入4°C冰箱備用。甲氨蝶呤（湖南正清制藥集團股份有限公司，批號：20210405）。將甲氨蝶呤片磨研成粉末，加入無菌蒸餾水混合均勻，配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的藥物混懸液。

牛Ⅱ型膠原（北京博蕾德生物科技有限公司，批號：20021）；完全弗氏佐劑（上海偉進生物科技有限公司，批號：08642852）；一抗（兔抗）（批號：HZ-001）、二抗（羊抗兔）（批號：HZ-E5230）均購自上海滬震實業(yè)有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELIAS）試劑盒（批號：ER1393）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號：EY-18442）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液（批號：AR1071）、二甲苯（批號：SA2024）均購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol試劑（批號：488008）；細胞質(zhì)和核RNA純化試劑盒（批號：2692521）、RevertAid H Minus First Strand cDNA合成試劑盒（批號：K1651）、SYBR Green PCR Master Mix（批號：14001013）均購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 主要儀器 500 g天平（上海浦春設(shè)備有限公司，型號：JY502）；精密天平（上海精密科學(xué)儀器公司，型號：JA31002）；足趾容積測量儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，型號：ZS-TVM）；超速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號：H-2050R）；酶標儀（美國BIOTEK公司，型號：ELX-800）；雙垂直蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DN）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-time PCR）儀（美國Biosystems公司，型號：Q5-7500型）。

1.4 分組與造模 75只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白組（15只）、RA模型組（15只）、甲氨蝶呤組（15只）、WTD組（15只）、WTD+甲氨蝶呤組（15只）。除空白組外的大鼠均進行膠原誘導(dǎo)造模。參照文獻中方法[5]并進行改良，將牛Ⅱ型膠原（10 mg）與0.1 mol/L醋酸水（5 mL）混合均勻，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶劑，置于4 ℃的環(huán)境下過夜，將5 mL上述溶劑與5 mL完全弗氏佐劑（CFA）混合均勻，置于4 ℃環(huán)境中直至完全乳化，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的乳化液，給大鼠注射乳化液進行初次免疫，分別從尾根部選取1個點、后足掌選取1個點、背部選取3個點進行皮下注射，0.2 mL/只。初次免疫后第7天再次進行皮下注射乳化液?？瞻捉M大鼠在相同的時間皮下注射等劑量的生理鹽水。造模成功標準：四肢足爪顯現(xiàn)嚴重腫脹，其踝關(guān)節(jié)直徑增長幅度大于2 mm，后爪體積增大≥0.8 mL。各組大鼠均造模成功。

1.5 實驗給藥 參照《藥理實驗方法學(xué)》[6]中的等效劑量系數(shù)折算法進行藥物灌胃。甲氨蝶呤組大鼠灌胃甲氨蝶呤，1mg/（kg·d），1次/d，持續(xù)28 d；WTD組大鼠灌胃WTD，9.8 g/（kg·d），1次/d，持續(xù)28 d；WTD+甲氨蝶呤組分別予WTD[9.8 g/（kg·d）]和甲氨蝶呤[1 mg/（kg·d）]灌胃，1次/d，持續(xù)28 d；空白組及RA模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，1次/d，持續(xù)28 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 大體觀察和組織學(xué)觀察 （1）大體觀察：取大鼠右后踝關(guān)節(jié)，用顯微鏡觀察關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)情況，進行Pelletier大體評分[7]。關(guān)節(jié)面完整，色澤正常為0分；關(guān)節(jié)面粗糙并有小的裂隙為1分；關(guān)節(jié)面糜爛并有軟骨缺損為2分；關(guān)節(jié)面潰瘍形成并有缺損達軟骨深層為3分；軟骨剝脫及軟骨下骨質(zhì)暴露為4分。（2）關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察：使用10%水合氯醛溶液腹腔注射（0.3 mL/100g）麻醉大鼠，使用皮剪剝離大鼠膝關(guān)節(jié)皮毛，并逐層暴露其膝關(guān)節(jié)，隔斷周圍韌帶，暴露其膝關(guān)節(jié)腔，在盡量保證其完整的情況下用手術(shù)刀片分離膝關(guān)節(jié)滑膜后，放入液氮中保存?zhèn)溆?，并切下大鼠踝關(guān)節(jié)，將取出的組織均放入4%多聚甲醛中室溫保存。對組織進行HE染色切片，觀察其病理改變情況，并通過光鏡軟骨檢測評價標準（Mankin）[8]對大鼠的踝關(guān)節(jié)進行組織學(xué)評分。①軟骨結(jié)構(gòu)：正常計0分，表面不規(guī)則計1分，血管翳形成和表面不規(guī)則計2分，裂隙進入過渡層計3分，裂隙進入輻射層計4分，裂隙進入鈣化層計5分，結(jié)構(gòu)完全破壞計6分；②軟骨細胞：正常計0分，彌漫性細胞增加計1分，局部細胞增加計2分，細胞數(shù)目明顯減少計3分；③軟骨基質(zhì)染色：正常計0分，輕度減少計1分，中度減少計2分，重度減少計3分，無著色計4分；③潮線完整性：完整計0分，被血管破壞計1分。

1.6.2 大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA及p38MAPK mRNA表達水平 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測Ⅱ型膠原mRNA及P38MAPK mRNA表達。使用TRIzol試劑從大鼠軟骨細胞中分離總RNA。使用細胞質(zhì)和核RNA純化試劑盒提取RNA。然后通過苯酚-氯仿提取純化RNA，并使用RevertAid H Minus First Strand cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix在PCR儀中進行定量實時PCR。β-actin為參照表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.3 滑膜組織p38MAPK蛋白表達水平 采用Western blotting法檢測滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量。取出“1.6.1”中保存的滑膜組織，在各組滑膜組織中加入組織裂解液（4 ℃預(yù)冷）；Vortex混勻，冰上裂解30 min；4 ℃，12 000 r/min（離心半徑為10 cm）離心30 min后，取上清液，采用Bradford方法測蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩DS-PAGE電泳：20 μg總蛋白進行12%SDS-PAGE電泳分離，100 V電泳2 h。Bio-Rad：100 V，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜。印跡膜用5%脫脂牛奶（封閉液）室溫封閉2 h。印跡膜與一抗（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。將膜與HRP標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1h，TBST緩沖液洗膜3次，10min/次。ECL試劑發(fā)光，顯影及定影。以β-actin（1∶800）為內(nèi)參。實驗重復(fù)3次。用Quantity one軟件分析p38MAPK在大鼠滑膜組織中的表達，計算相對表達量。

1.6.4 血清TNF-α、IL-6的水平 各組大鼠給藥28 d后，取尾靜脈血2 mL，3 500 r/min（離心半徑為10 cm）離心15 min，吸取上層血清標本。采用ELIAS試劑盒檢測血清TNF-α、IL-6的水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗或SNK-q檢驗，相關(guān)分析采用Pearson線性相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)Pelletier評分和Mankin評分比較 空白組大鼠踝關(guān)節(jié)未出現(xiàn)腫脹；RA模型組大鼠踝關(guān)節(jié)明顯腫脹，并伴有跛行；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹情況較模型組輕，未見跛行。RA模型組、甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠踝關(guān)節(jié)Pelletier和Mankin評分均高于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠踝關(guān)節(jié)Pelletier和Mankin評分均低于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤組大鼠踝關(guān)節(jié)Pelletier和Mankin評分低于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)Pelletier評分和Mankin評分比較（±s，n=15）

2.2 各組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量比較 RA模型組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量低于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量高于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量高于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量比較（±s，n=15）

2.3 各組大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量比較RA模型組大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量高于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量均低于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量低于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖3）

圖3 各組大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量比較（±s，n=15）

2.4 各組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量比較 RA模型組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量高于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量均低于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量低于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖4～5）

圖4 各組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量比較（±s，n=15）

圖5 大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白表達Western blotting圖

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 RA模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平高于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均低于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-6水平低于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖6）

圖6 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 （±s，n=15）

2.6 血清TNF-α、IL-6水平與軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量相關(guān)性分析 各組血清TNF-α、IL-6與軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量呈正相關(guān)（P＜0.05）。（見表2、圖7～8）。

表2 血清TNF-α、IL-6水平與軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量的相關(guān)分析

圖7 血清TNF-α水平與p38MAPK mRNA相對表達量相關(guān)分析散點圖與直線擬合

圖8 血清IL-6水平與P38MAPK mRNA相對表達量相關(guān)分析散點圖與直線擬合

3 討 論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理基礎(chǔ)的自身免疫疾病，其關(guān)節(jié)病理表現(xiàn)為滑膜細胞大量增生。近年數(shù)據(jù)顯示其致殘率較高，產(chǎn)生心血管疾病等合并癥的概率較高[9]。甲氨蝶呤治療RA可取得較好的療效，但仍存在由于藥物不耐受而導(dǎo)致療效不佳的情況，因此探索更好的治療藥物對RA患者的預(yù)后具有積極意義[10]。近年來，中醫(yī)學(xué)在RA的治療上有頗多進展，可通過祛邪通絡(luò)、補益肝腎等治法調(diào)節(jié)機體陰陽平衡，達到控制關(guān)節(jié)癥狀的目的[11-12]。WTD出自《金匱要略》，主治寒濕歷節(jié)，可改善RA患者關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等癥狀[13]。目前WTD治療RA的作用機制尚不明確。p38MAPK信號通路是參與RA炎癥發(fā)展的重要途徑，p38MAPK信號通路在RA慢性炎癥的誘導(dǎo)及維持中起重要作用，故本研究旨在探討WTD聯(lián)合甲氨蝶呤治療大鼠RA的療效及其與p38MAPK通路的相關(guān)性。

中醫(yī)學(xué)將RA歸屬為“尪痹”“痹病”等范疇，治療以“寒者熱之”“治寒以熱”為主要原則[14]。WTD的溫經(jīng)散寒力強，并能祛風(fēng)除濕?！督饏T要略》指出：“病歷節(jié)，不可屈伸，疼痛，烏頭湯主之?！逼湓接纱?、麻黃、黃芪、白芍和甘草組成，具有溫經(jīng)散寒、祛風(fēng)除濕之效[15]。方中烏頭為君藥，能升能降，通經(jīng)絡(luò)，利關(guān)節(jié)，有溫經(jīng)散寒、除濕止痛之功；麻黃為臣藥，有宣散透表、祛寒濕之效。二者配伍，同氣相求，藥力專宏，外能宣表通陽達邪，內(nèi)可透發(fā)凝結(jié)之寒邪，外攘內(nèi)安，痹痛自無。白芍宣痹行血，黃芪益氣固衛(wèi)。兩者合用既助麻黃、烏頭溫經(jīng)止痛，亦制麻黃過散之性，為佐藥。炙甘草為使藥，緩急止痛。諸藥相伍，使寒濕去而陽氣宣通，關(guān)節(jié)疼痛解除而屈伸自如。烏頭具有鎮(zhèn)痛作用，可以減輕疼痛[16]；炙甘草中的甘草酸和黃芪中的黃芪苷具有抗炎作用，可以減輕炎癥反應(yīng)，并且炙甘草中的甘草酸還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，促進機體免疫力恢復(fù)[17]；白芍中的芍藥苷可以抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和炎癥反應(yīng)，從而減輕關(guān)節(jié)腫脹和疼痛[18]；黃芪中的黃芪苷具有抗氧化作用，可以減輕氧化應(yīng)激對關(guān)節(jié)的損傷[19]；麻黃中的麻黃堿可以促進關(guān)節(jié)的血液循環(huán)，加速關(guān)節(jié)的康復(fù)[20]。

研究[21]發(fā)現(xiàn)，烏頭湯與西藥聯(lián)用可有效改善關(guān)節(jié)炎活動期的臨床癥狀和相關(guān)生化指標，療效優(yōu)于單用西藥，且副作用較小，安全性較高。Ⅱ型膠原在維持軟骨生物力學(xué)性能方面具有重要作用。軟骨細胞Ⅱ型膠原減少，會導(dǎo)致軟骨結(jié)構(gòu)破壞，影響軟骨細胞生長微環(huán)境，進而使得軟骨細胞凋亡，因此Ⅱ型膠原的合成在RA的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[22-23]。本研究結(jié)果顯示，WTD+甲氨蝶呤組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA表達水平高于WTD組、甲氨蝶呤組，體現(xiàn)了WTD與甲氨蝶呤聯(lián)用可在維持關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用[24-25]。

p38MAPK信號通路在RA滑膜中可被強烈激活。研究[26-27]表明，阻斷或減少p38MAPK的表達會對軟骨起到保護作用。本研究結(jié)果顯示，WTD+甲氨蝶呤組p38MAPK mRNA、p38MAPK蛋白相對表達量均低于WTD組、甲氨蝶呤組，提示W(wǎng)TD+甲氨蝶呤可抑制p38MAPK信號通路，阻斷和減少p38MAPKA的表達，保護大鼠軟骨。WTD+甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-6水平低于WTD組、甲氨蝶呤組，說明WTD聯(lián)合甲氨蝶呤可有效減輕炎癥。RA的發(fā)病與細胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有重要聯(lián)系。如TNF-α、IL-6對軟骨細胞和滑膜細胞中的膠原酶和前列腺素E2活性具有刺激作用，還可進一步促進細胞產(chǎn)生更多炎癥因子，從而加重炎癥反應(yīng)，促使滑膜增生[28-29]。炎癥小鼠全身TNF過度表達會導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織中p38MAPK活化[30]。Pearson相關(guān)分析顯示，大鼠血清TNF-α、IL-6與p38MAPK mRNA相對表達量呈正相關(guān)，提示W(wǎng)TD和甲氨蝶呤可能是通過抑制p38MAPK mRNA的表達，抑制RA的炎癥發(fā)展。但本研究未考察WTD量效關(guān)系，以及其單獨對RA進行用藥是否與抑制p38MAPK信號通路有關(guān)，應(yīng)進行深入研究分析。

綜上所述，WTD聯(lián)合甲氨蝶呤治療大鼠RA的效果佳，其作用機制可能與抑制p38MAPK信號通路有關(guān)。