符顯昭，申亞亞，陳佳俊，蔣曉鳳，黃光明

（右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533099）

心肌病變是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，其主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞丟失及纖維組織增生等病理改變引發(fā)的心肌重塑，導(dǎo)致心室擴(kuò)大及心力衰竭[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）作為多種應(yīng)激源的共同通路，可通過未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）信號(hào)與炎癥反應(yīng)偶合，連接代謝異常和凋亡反應(yīng)過程[2]。過度或持久發(fā)生ERS，導(dǎo)致自噬水平持續(xù)增加和過度激活，最終導(dǎo)致自噬無能，甚至自噬性細(xì)胞死亡（也稱為Ⅱ型程序性死亡），致使心肌細(xì)胞數(shù)量減少，促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[3]。根據(jù)中醫(yī)理論，“氣陰兩虛，瘀毒內(nèi)蘊(yùn)”為糖尿病心肌病變的主要病機(jī)[4]。前期研究結(jié)果表明，以“滋陰益氣、活血解毒”為治法治則的降糖舒心方能抑制胰島素抵抗，減輕氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，降低ERS標(biāo)志性分子的mRNA及其功能蛋白的表達(dá)，減輕“氧化應(yīng)激-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-細(xì)胞凋亡”的偶聯(lián)反應(yīng)，抑制ERS相關(guān)凋亡的通路，減少心肌細(xì)胞凋亡，從而對心肌組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)起到保護(hù)作用[5-6]。本研究側(cè)重糖尿病合并心力衰竭的防治研究，采用腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)方法，增加壓力負(fù)荷，導(dǎo)致糖尿病合并慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）產(chǎn)生，引發(fā)過度或持久的ERS，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬之間的交互作用由適應(yīng)性、保護(hù)性，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)性、破壞性，最終使心肌細(xì)胞自噬無能而死亡，從而建立糖尿病心肌病變大鼠模型。同時(shí)本研究利用降糖舒心方進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步研究其對糖尿病心肌病變的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡SPF級雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量220～250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2020-0003，大鼠健康狀況均良好，飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20～23 ℃，相對濕度40%～50%，自然采光，不限飲食、水。本實(shí)驗(yàn)已通過右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，倫理編號(hào)：2019030701。

1.2 藥物與試劑 降糖舒心方，方藥組成：人參10 g，五味子8 g，麥冬15 g，黃芪15 g，生地黃15 g，山藥15 g，山茱萸10 g，大黃5 g，黃連8 g，丹參10 g。上述中藥購自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。將上述中藥置于約4倍體積量超純水中，室溫浸泡2.0 h后，用不銹鋼提桶煎煮1.5 h，濃縮烘干制成浸膏，每1 g浸膏劑量相當(dāng)于原生藥10 g，用保鮮膜密封，放入-20 ℃冰箱保存，灌胃給藥時(shí)室溫下解凍。格列喹酮（批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H10940258，北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司）、貝那普利（批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20044840，上海新亞藥業(yè)閔行有限公司）均購自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；鏈脲佐菌素（STZ，批號(hào)：10099-141）購自北京華越洋生物科技有限公司；水合氯醛（批號(hào)：6037004-1）、HE染色試劑盒（批號(hào)：H1120）均購自上海碧云天生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：K1622）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（批號(hào)：C0038）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；引物糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulate drotein 78，GRP78）、肌醇需求酶1（inositol requiring enzyme 1，IRE-l）、腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子-2（tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF2）均由康為世紀(jì)生物科技有限公司合成；LC3-Ⅱ抗體（批號(hào)：ab32441）、Beclin 1抗體（批號(hào)：ab76039）均購自美國Abcam公司；高脂飼料（普通飼料78.2%，豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1.5%，豬膽鹽0.3%）購自江蘇省協(xié)同生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 飛利浦IE33型超聲心動(dòng)儀（上海繼圣醫(yī)療器械有限公司）；外科手術(shù)器械（德州藍(lán)索醫(yī)療器械有限公司）；ABI-7500型熒光定量PCR儀（美國羅氏公司）；BX53M型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；5418/5418R型臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf AG公司）；Leica EM UC7型切片機(jī)（德國Thermo scientific公司）；CL-32L型全自動(dòng)熱蒸汽滅菌器（日本ALP公司）；HistoCore PEARL型組織脫水機(jī)（德國徠卡公司）；SJ-CJ-2FDQ型超凈工作臺(tái)（中國蘇州醫(yī)療設(shè)備廠）；SIMF140AY65型制冰機(jī)（上海金畔生物科技有限公司）。

1.4 造模與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后按隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、西藥組、降糖舒心方低劑量組、降糖舒心方高劑量組、假手術(shù)組，每組20只。模型組、西藥組、降糖舒心方低劑量組、降糖舒心方高劑量組大鼠腹腔單次注射STZ（用檸檬酸緩沖液制備成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液），劑量為50 mg/kg。72 h后，用血糖試紙檢測大鼠尾靜脈血糖，以連續(xù)2次空腹血糖≥16.7 mmol/L為成功構(gòu)建糖尿病模型的標(biāo)準(zhǔn)，隨后用高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月。假手術(shù)組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，后用普通飼料喂養(yǎng)。糖尿病模型大鼠禁食8 h后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，打開腹腔，暴露分離腹主動(dòng)脈，在腹主動(dòng)脈旁放置7號(hào)針，用4-0絲線結(jié)扎腹主動(dòng)脈和7號(hào)針，然后再拔針，縮窄腹主動(dòng)脈60%～70%，術(shù)后抗感染治療，繼續(xù)高脂飼料飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎，普通喂養(yǎng)。術(shù)后第28天，大鼠麻醉后備皮，臥位，超聲檢測心臟功能。射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）≤45%則判定為心力衰竭[7]。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 降糖舒心方給藥劑量依據(jù)人與大鼠體表面積折算，成人臨床用量的5.4倍為低劑量，并設(shè)高劑量為低劑量的1.2倍原生藥量，用已制成的藥物流浸膏加入生理鹽水進(jìn)行配制，降糖舒心方低、高劑量組大鼠灌胃給予降糖舒心方藥液，劑量分別為1.0、1.2 g/（kg·d）；西藥組大鼠分別灌胃給予格列喹酮（9.80 mg/kg）和貝那普利（3.30 mg/kg）（按臨床用量的5.4倍計(jì)算），假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃給予等容積蒸餾水，1次/d，連續(xù)2個(gè)月。給藥過程中，模型組、西藥組、降糖舒心方低劑量組、降糖舒心方高劑量組大鼠繼續(xù)進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)，假手術(shù)組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 樣品采集 給藥2個(gè)月后，禁食8 h，各組大鼠吸入2%異氟烷麻醉后，仰臥固定，超聲心動(dòng)儀探頭頻率控制在1.0～5.0 MHz，檢測心臟左室射血分?jǐn)?shù)（1eft ventricular ejection fraction，LVEF）、舒張末期室間隔厚度（interventricular septal depth，IVSd）、收縮末期室間隔厚度（interventricular septal thickness at end-systole，IVSs）、收縮末期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall systole，LVPWs）與舒張末期左心室后壁厚度（1eft ventricular posterior wall diastole，LVPWd），每一數(shù)據(jù)均測量3次取平均值。隨后處死大鼠，在冰上迅速取心臟，分3部分，一部分心肌組織浸入3%的戊二醛溶液中，置4 ℃冰箱保存，用作電鏡觀察心肌細(xì)胞自噬及心肌組織超微結(jié)構(gòu)的變化；一部分用4%多聚甲醛固定，用于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)；其余組織放入液氮于-80 ℃冷藏，用于RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子GRP78 mRNA、IRE-l mRNA、TRAF2 mRNA相對表達(dá)量，同時(shí)采用Western blotting法檢測心肌組織自噬蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平。

1.6.2 HE染色觀察心肌病理學(xué)改變情況 心肌組織經(jīng)逐級乙醇脫水，石蠟包埋，切4 μm薄片，60 ℃烘箱烘烤，二甲苯脫蠟，逐級乙醇脫水，蘇木素染色5 min，自來水沖洗5 min，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，自來水沖洗，逐級乙醇脫水，使用200倍顯微鏡進(jìn)行圖像采集。HE半定量分析。0分：無炎癥細(xì)胞浸潤，無心肌壞死；1分：炎癥細(xì)胞浸潤范圍、心肌壞死面積＜25%；2分：炎癥細(xì)胞浸潤范圍、心肌壞死面積為25%～＜50%；3分：炎癥細(xì)胞浸潤范圍、心肌壞死面積為50%～＜75%；4分：炎癥細(xì)胞浸潤范圍、心肌壞死面積≥75%。

1.6.3 透射電鏡觀察心肌自噬超微結(jié)構(gòu)變化 將心肌從3%戊二醛固定液中取出，用1%鋨酸溶液固定心肌組織，再吸干鋨酸固定液，用0.1 mol/L的PBS（pH=7.0）漂洗心肌樣品3次，每次15 min，梯度濃度乙醇溶液（50%、70%、80%、90%和95%）對心肌樣品進(jìn)行脫水，用純丙酮處理20 min處理，使用812環(huán)氧樹脂包埋心肌組織，制成心肌組織超薄切片（50～70 nm），用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液雙重染色15 min，透射電鏡在加速電壓為60～80 kV下使用30 000放大倍率下調(diào)節(jié)物鏡聚焦旋鈕至圖片清晰，觀察拍照。

1.6.4 RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子GRP78 mRNA、IRE-1 mRNA、TRAF2 mRNA相對表達(dá)量 目的基因：GRP78的上游引物為5'-CTTGGTATTGAAACTGTGGG-3'，下游引物為5'-TGTTACGGTGGGC TGAT TAT-3'，擴(kuò)增長度為117 bp；IRE-1的上游引物ATGGGTGGCGTTCATCATCA，下游引物GTAAGGTCTCCGTGTGGGTG，擴(kuò)增長度為148 bp；TRAF2的上游引物為TCACCATCACACAGACAGGC，下游引物為GCCCTTTCTGA GTACCCCAC，擴(kuò)增長度為234 bp。內(nèi)參基因：GAPDH上游引物為5'-GATG GTGAA GGT CGGTGTGA-3'，下游引物為5'-TGAACTTGCCGTGGG TAGAG-3'，擴(kuò)增長度114 bp。從-80 ℃冰箱取出心肌組織，在研缽中加入Trizol裂解液研磨，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳，檢測其完整性；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作：42 ℃，15 min；85 ℃，5 min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后將獲得的cDNA擴(kuò)增為目的基因，步驟按照PCR試劑盒操說明進(jìn)行，設(shè)3個(gè)復(fù)孔點(diǎn)樣，在Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃，10 min變性；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；40次循環(huán)。利用溶解曲線檢測引物的特異性，記錄達(dá)到所設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即CT值，采用2-△△Ct計(jì)算表達(dá)量，△Ct=Ct目的基因-CtGAPDH，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-CtGAPDH）-假手術(shù)組（Ct目的基因-CtGAPDH），2-△△Ct=2-△Ct實(shí)驗(yàn)組/2-△Ct假手術(shù)組，具體計(jì)算以假手術(shù)組表達(dá)量為1，比值為實(shí)驗(yàn)組相對表達(dá)量。

1.6.5 Western blotting法檢測心肌組織中Beclin 1、LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)量 取出心肌，解凍，剪碎，加入1 mL冷Lysis Buffer液，在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，冰上靜置，裂解15 min。將勻漿液放入離心管中，12 000 r/min（離心半徑為15 cm）離心5 min，取上清液，用BCA試劑盒檢測其濃度。在SDS-PAGE進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜后，把PVDF膜放入孵育盒中，用5%脫脂奶粉封閉，搖床振蕩1.5 h，用TBST洗膜3次，將膜放入含一抗稀釋液的孵育盒中，4 ℃搖床振蕩孵育過夜。第2天，室溫振蕩30 min，吸棄一抗，TBST洗3次，再用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫?fù)u床振蕩1 h，回收二抗后，用TBST洗膜3次。在PVDF膜滴加發(fā)光試劑混合液，使用ECL成像儀拍照，存儲(chǔ)圖片，使用Image J軟件測定并分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，如果方差齊，采用LSD法，方差不齊用采用Tambanes T2法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd均明顯升高（P＜0.01），LVEF明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠LVPWs、LVPWd、IVSs、IVSd均明顯降低（P＜0.05），LVEF均明顯升高（P＜0.05），且降糖舒心方存在劑量依賴性；降糖舒心方低、高劑量組大鼠LVEF明顯高于西藥組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠心功能比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥組比較，cP＜0.05。

給藥劑量格列喹酮/（mg/kg） 貝那普利/（mg/kg） 降糖舒心方/（g/kg）假手術(shù)組 20 0.301±0.004 0.216±0.013 0.341±0.016 0.187±0.017 88.5±7.7模型組 20 0.447±0.006a 0.344±0.014a 0.397±0.015a 0.247±0.015a 61.4±4.0a西藥組 20 9.80 3.30 0.341±0.006ab 0.229±0.022ab 0.340±0.021ab 0.209±0.012ab 68.8±1.4ab降糖舒心方低劑量組 20 1.0 0.344±0.005ab 0.236±0.024ab 0.336±0.026ab 0.217±0.011ab 70.7±3.6abc降糖舒心方高劑量組 20 1.2 0.364±0.007ab 0.241±0.021ab 0.351±0.023ab 0.221±0.013ab 72.2±1.7abc F 1 802.654 142.802 29.878 49.494 106.355 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別 n LVPWs/cm LVPWd/cm IVSs/cm IVSd/cm LVEF/%

2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變情況 假手術(shù)組大鼠心肌組織、心肌纖維形態(tài)正常，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞質(zhì)豐富，無間質(zhì)出血，無壞死，無肌絲融解。模型組、西藥組、降糖舒心方低劑量組和降糖舒心方高劑量組大鼠心肌組織損傷嚴(yán)重，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞腫脹和壞死，肌肉纖維模糊，部分肌絲壞死，形成空泡。與模型組比較，降糖舒心方低劑量組和降糖舒心方高劑量組大鼠心肌損害程度較低，心肌細(xì)胞形態(tài)較正常，心肌細(xì)胞排列較整齊，心肌組織損傷減輕。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織病理學(xué)積分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織病理學(xué)積分均明顯降低（P＜0.05）；降糖舒心方低、高劑量組大鼠心肌組織病理學(xué)積分均明顯低于西藥組（P＜0.05），且具有劑量依賴性。（見表2、圖1）

圖1 各組大鼠心肌組織病理切片圖 （HE，×400）

表2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)積分比較 （±s）

表2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)積分比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥組比較，cP＜0.05。

給藥劑量格列喹酮/（mg/kg）貝那普利/（mg/kg）降糖舒心方/（g/kg）假手術(shù)組 20 0.22±0.05模型組 20 3.51±0.55a西藥組 20 9.80 3.30 2.67±0.42a b降糖舒心方低劑量組 20 1.0 1.95±0.31a b c降糖舒心方高劑量組 20 1.2 1.58±0.27a b c F 233.522 P 0.000組別 n 積分/分

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞自噬及心肌組織超微結(jié)構(gòu)比較 假手術(shù)組大鼠心肌肌原纖維清晰整齊，線粒體形狀正常，排列整齊，無間質(zhì)增生，細(xì)胞形態(tài)正常，光滑完整，自噬小體少，細(xì)胞連接緊密可見，胞體內(nèi)多見含量不等的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。模型組大鼠心肌細(xì)胞外形不規(guī)則，心肌肌原纖維模糊，排列紊亂，橫紋不清晰，線粒體增生且變形，間質(zhì)纖維增生嚴(yán)重，自噬小體增加，突向腔面或脫落，細(xì)胞間連接擴(kuò)大，內(nèi)有多個(gè)空泡，細(xì)胞漿內(nèi)充滿腫脹的線粒體，呈空泡樣改變。西藥組大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量有所減少，細(xì)胞間連接有所擴(kuò)大，細(xì)胞體積部分縮小，部分不規(guī)則，有自噬小體和空泡形成，細(xì)胞間有纖體增生。降糖舒心方低劑量組大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量基本正常，但細(xì)胞體積部分縮小，有自噬小體和空泡形成，胞體部分變形，有纖體增生。降糖舒心方高劑量組大鼠心肌肌原纖維排列整齊，間質(zhì)增生少，部分細(xì)胞形態(tài)有所縮小，但胞體大部分光滑完整，胞內(nèi)有少量自噬小體和空泡。（見圖2）

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞自噬及心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化 （電鏡，×15 000）

2.4 各組大鼠心肌組織GRP78 mRNA、IRE-1 mRNA、TRAF2 mRNA相對表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織GRP78 mRNA、IRE-1 mRNA、TRAF2 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織GRP78 mRNA、IRE-1 mRNA、TRAF2 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；降糖舒心方高劑量組大鼠心肌組織GRP78 mRNA、IRE-1 mRNA、TRAF2 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于西藥組（P＜0.05）。（見表3、圖3）

圖3 各組大鼠心肌組織GRP78、IRE-1 和TRAF2 的擴(kuò)增曲線和融解曲線圖

表3 各組大鼠心肌組織GRP78 mRNA、IRE-1 mRNA、TRAF2 mRNA 相對表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組大鼠心肌組織GRP78 mRNA、IRE-1 mRNA、TRAF2 mRNA 相對表達(dá)量比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥組比較，cP＜0.05。

給藥劑量格列喹酮/（mg/kg） 貝那普利/（mg/kg） 降糖舒心方/（g/kg）假手術(shù)組 20 1.04±0.20 1.05±0.25 1.07±0.27模型組 20 7.83±0.26a 7.62±0.31a 7.45±0.35a西藥組 20 9.80 3.30 4.82±0.44a b 4.84±0.42a b 4.35±0.41a b降糖舒心方低劑量組 20 1.0 4.81±0.82a b 4.64±0.84a b 4.30±0.51a b降糖舒心方高劑量組 20 1.2 3.31±0.26a b c 3.15±0.25a b c 3.11±0.35a b c F 590.182 528.207 719.619 P 0.000 0.000 0.000組別 n GRP78 mRNA IRE-1 mRNA TRAF2 mRNA

2.5 各組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白相對表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；降糖舒心方低、高劑量組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白相對表達(dá)量均明顯低于西藥組（P＜0.05），且具有劑量依賴性。（見圖4～7）

圖4 各組大鼠心肌組織Beclin 1 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖5 各組大鼠心肌組織Beclin 1 蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=20）

圖6 各組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)Western blotting圖

圖7 各組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)量比較（±s，n=20）

3 討 論

自噬是一個(gè)高度保守的由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器再循環(huán)過程，可給細(xì)胞提供降解物質(zhì)，維持細(xì)胞正常代謝，清除細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)，消化受損的細(xì)胞器，提高細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的生存能力，使受損的細(xì)胞得到功能修復(fù)[8]。自噬可被細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，如被細(xì)胞內(nèi)壓力、饑餓、缺氧、應(yīng)激等因子誘導(dǎo)。失控的過度自噬在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[9]。心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)又稱肌漿網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激常常發(fā)生于代謝旺盛組織細(xì)胞，如心肌細(xì)胞等，并常常引起這些細(xì)胞功能障礙。這些細(xì)胞需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理大量的能量和細(xì)胞成分物質(zhì)，因此對細(xì)胞內(nèi)代謝改變和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動(dòng)態(tài)平衡高度敏感。脂肪堆積、葡萄糖濃度增加和免疫細(xì)胞因子堆積等均容易產(chǎn)生ERS[10]。ERS發(fā)生時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力，自噬就會(huì)被誘導(dǎo)激活，作為次級反應(yīng)降解累積的蛋白質(zhì)，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷[11]。ERS與自噬的適度激活形成了機(jī)體內(nèi)適應(yīng)性、保護(hù)性的交互作用。而過度或持久發(fā)生ERS，ERS與自噬可發(fā)生交互作用，保護(hù)作用機(jī)制將逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N持續(xù)性、破壞性的作用[12]。ERS激活UPR，導(dǎo)致活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激酶（PRK-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和IRE-l 3個(gè)跨膜蛋白從GRP78中解離，隨后解離的這3個(gè)跨膜蛋白激活自噬信號(hào)通路。IRE-1激活后，與TRAF2結(jié)合，形成IRE1α-TRAF2復(fù)合物，募集凋亡信號(hào)調(diào)控激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1），隨后激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK），進(jìn)而磷酸化B淋巴細(xì)胞瘤-2基因分子（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），促進(jìn)自噬基因Beclin 1與Bcl-2的分離[13]。在自噬的過程中，被降解的蛋白或細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)至具有雙層囊泡結(jié)構(gòu)的自噬體中。Beclin l是自噬體形成過程中的一個(gè)重要分子，可介導(dǎo)自噬蛋白的定位及吞噬泡的形成，調(diào)控自噬體的形成，是參與自噬調(diào)控的重要基因。微管相關(guān)蛋白LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，1LC3）的表達(dá)強(qiáng)度與自噬泡數(shù)量呈正相關(guān)[14]。1LC3前體在蛋白水解酶的作用下剪切C末端形成1LC3-I，最后經(jīng)泛素樣加工修飾過程成為與磷脂酰乙醇胺結(jié)合的MAP1LC3-1I，靶向定位于自噬體膜[15]。

糖尿病狀態(tài)導(dǎo)致機(jī)體糖代謝正常途徑受損，致使代謝旁路過度激活，增強(qiáng)了還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶的活性，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量活性氧簇（ROS）。ROS的蓄積影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)折疊受阻致使未折疊蛋白蓄積，誘發(fā)ERS[16-17]。另外，病理性免疫反應(yīng)也是糖尿病致病機(jī)制之一，2型糖尿病患者早期就存在細(xì)胞免疫失衡。胰島素抵抗和胰島素作用的相對不足是2型糖尿病患者體內(nèi)天然免疫的激活因素，自身免疫系統(tǒng)的激活和慢性炎癥參與了2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展[18]?；颊呖捎捎诿庖呔W(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失控導(dǎo)致糖代謝紊亂。大量因糖代謝紊亂而蓄積的代謝產(chǎn)物又反饋?zhàn)饔糜跈C(jī)體免疫系統(tǒng)，加重免疫功能損傷，而異常的免疫應(yīng)答又進(jìn)一步加重病情發(fā)展，表明免疫紊亂與血糖水平、糖尿病病程有關(guān)[19]。因此，糖尿病CHF患者機(jī)體既受到普通CHF的免疫紊亂的侵害又受到糖尿病狀態(tài)下免疫失衡干擾，致使免疫系統(tǒng)與各種神經(jīng)激素形成的調(diào)節(jié)網(wǎng)路在新的、較高水平上保持著一種致?lián)p性平衡。盡管糖尿病CHF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但氧化應(yīng)激狀態(tài)、高糖、高脂、炎癥反應(yīng)和免疫失衡等病理狀態(tài)均與ERS有關(guān)。ERS作為多種應(yīng)激源的共同通路，將糖尿病狀態(tài)下多種危險(xiǎn)因素與心力衰竭發(fā)展聯(lián)系起來，對心肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬交互作用起推動(dòng)作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的UPR會(huì)被持續(xù)過度激活，并通過UPR與自噬進(jìn)行交互作用產(chǎn)生的持續(xù)性破壞作用，導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失和心臟重構(gòu)，促進(jìn)糖尿病CHF的發(fā)生發(fā)展[20-21]。

糖尿?。ㄖ嗅t(yī)稱消渴病）發(fā)病之初以陰傷為主，遷延日久，陰傷及氣，致氣陰兩虛。燥熱為主要兼夾之邪。氣陰兩虛常貫穿于消渴病發(fā)病的始終。氣為之血帥，血為氣之母，氣虛則易至血瘀；陰虛則加劇燥熱，進(jìn)一步耗傷津液。燥熱、痰瘀內(nèi)蘊(yùn)過久則成毒，因此，治法上應(yīng)在滋陰益氣基礎(chǔ)上，配合活血解毒[4]。降糖舒心方由人參、黃芪、麥冬、山茱萸、生地黃、大黃、黃連、丹參、山藥、五味子等10味中藥組成。其中人參、麥冬、五味子是李杲《內(nèi)外傷辨惑論》中滋陰、益氣、生津、養(yǎng)心的生脈散；山茱萸、山藥、生地黃是《景岳全書》治療真陰不足的左歸丸成分；大黃、黃連清熱解毒，燥濕祛濁；丹參活血化瘀，養(yǎng)心血；黃芪益氣扶正解毒。全方攻補(bǔ)兼施、扶正祛邪，具有滋陰益氣、活血解毒之功。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，降糖舒心方能減輕胰島素抵抗，調(diào)節(jié)心肌能量代謝和抑制心肌重構(gòu)，減輕心室充盈壓，縮小左室舒張期末容積（LVEDV）等形態(tài)學(xué)指標(biāo)，從而改善心功能[22]。

高血壓引起心臟負(fù)荷過重是心力衰竭的一個(gè)重要原因。本研究顯示，腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后，增加壓力負(fù)荷，產(chǎn)生了糖尿病合并慢性心力衰竭，致使造模成功后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子GRP78 mRNA、IRE-1 mRNA、TRAF2 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高，Beclin 1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量均明顯升高，提示心肌細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬被激活。電鏡顯示心肌細(xì)胞自噬小體大量增加，空泡形成增多；病理檢測顯示產(chǎn)生心肌纖維化和心肌重構(gòu)；心臟彩超顯示IVSd、IVSs、LVPWd和LVPWs明顯升高。說明高血壓引發(fā)糖尿病性心肌病變后，心肌細(xì)胞過度自噬導(dǎo)致數(shù)量減少，心肌間質(zhì)代償性增多致使心肌纖維化。降糖舒心方干預(yù)后，自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子GRP78 mRNA、IRE-1 mRNA、TRAF2 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低，心肌過度自噬現(xiàn)象得到抑制，纖維增生減輕，心室重構(gòu)得到改善（IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs均明顯降低），由此心功能得到改善（LVEF升高）。表明調(diào)節(jié)心力衰竭時(shí)失控的心肌細(xì)胞過度自噬，可減輕心肌細(xì)胞因自噬導(dǎo)致的心肌細(xì)胞死亡，并抑制心肌重構(gòu)，有助于心力衰竭的治療，故調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬是治療心力衰竭的新策略。降糖舒心方具有扶正解毒治療作用，能干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的相互作用和聯(lián)系，減輕過度自噬對心肌的損害，從而抑制心肌重構(gòu)，改善心功能，并且療效具有劑量依賴性。