劉偉峰 戴政 周毅彬 封凱文 魏愷 孫古樂 陽東榮 朱進(jìn)

1蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科（江蘇蘇州 215004）；2安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（合肥市第一人民醫(yī)院）泌尿外科（合肥 230001）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）在世界范圍內(nèi)男性惡性腫瘤發(fā)病率中位居第2位，且在中國呈逐年上升趨勢(shì)［1-2］。PCa患者早期發(fā)病一般無明顯癥狀，確診時(shí)往往已進(jìn)入中晚期，此時(shí)已錯(cuò)過最佳的治療時(shí)機(jī)，致殘率、致死率明顯上升［3-4］。血液前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）檢測(cè)聯(lián)合直腸指檢是目前PCa早篩的常用方法，由于其存在一定程度的“灰區(qū)”和假陽性結(jié)果，易造成過度治療和漏診［5-7］。因此，有必要尋找一個(gè)敏感度高且能無創(chuàng)檢測(cè)的PCa早期生物標(biāo)志物。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在高達(dá)52%的前列腺癌中，Y染色體存在完全和部分的缺失，且染色體上相關(guān)基因的缺失將會(huì)促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能和DNA異常甲基化有重要關(guān)系［8-10］。PRKY基因是一個(gè)假基因，位于Yp11.2區(qū)域，主要在皮膚、前列腺等組織中表達(dá)。并且已有研究證實(shí)PRKY基因在PCa組織中表達(dá)明顯下調(diào)［11］。通過前期多個(gè)甲基化數(shù)據(jù)庫分析，筆者發(fā)現(xiàn)PCa組織中PRKY啟動(dòng)子甲基化水平明顯高于正常組織。PRKY啟動(dòng)子所有CpG位點(diǎn)中，cg05163709、cg05618150和cg08045599位點(diǎn)的甲基化水平在PCa組織中明顯高于正常組織。筆者推測(cè)這3個(gè)啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)的高甲基化與PRKY基因在PCa組織中的表達(dá)下調(diào)具有重要聯(lián)系。因此，本研究通過檢測(cè)PCa和BPH患者尿液中PRKY基因3個(gè)啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)（cg05163709 、cg05618150和cg08045599）甲基化水平，來探討尿液蛋白激酶Y基因啟動(dòng)子位點(diǎn)甲基化在PCa早期診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2022年1-12月在蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科行前列腺穿刺活檢的50例患者。研究納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床懷疑PCa擬行前列腺穿刺患者；（2）既往無其他惡性腫瘤；（3）臨床資料包括年齡、總前列腺特異性抗原（total prostate specific antigen，tPSA）、游離前列腺特異性抗原（free prostate specific antigen，fPSA）、游離前列腺特異性抗原百分比（percentage free prostate specific antigen，f/tPSA）、前列腺體積、前列腺特異性抗原密度（prostate specific antigen density，PSAD）、直腸指檢結(jié)果以及穿刺病理報(bào)告，PSAD即血清tPSA值與前列腺體積的比值。本研究已經(jīng)通過蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核與批準(zhǔn)，并且已經(jīng)獲得了患者及家屬的知情同意。該研究的倫理審批文書批號(hào)為JD-LK-2022-059-01。

1.2 尿液的收集符合條件的患者要求近一周無性生活。排尿半小時(shí)后，由同一泌尿外科醫(yī)師對(duì)患者進(jìn)行前列腺按摩，收集按摩后的50 mL初段尿于無菌離心管中，放置4 ℃冰箱保存；4 h內(nèi)將收集到的尿液進(jìn)行離心（離心半徑9 cm，離心速度63.5 r/min，離心力4 000 ×g，離心時(shí)間10 min），收集尿沉渣，將尿沉渣放置于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)病理結(jié)果將入組患者分為PCa組及BPH組，其中PCa組30例，BPH組20例。

1.3 尿液DNA的提取及亞硫酸氫鹽處理取出尿沉渣樣本，按照DNA提取試劑盒（QIAGEN QIAampR DNA Mini Kit）說明書中的步驟提取DNA，將符合標(biāo)準(zhǔn)的DNA樣本放置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。采用DNA亞硫酸氫鹽試劑盒（EZ DNA Methylation-GoldTM Kit）進(jìn)行樣本DNA的亞硫酸氫鹽修飾及純化。

1.4 定量甲基化特異性PCR檢測(cè)（1）針對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換后的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物探針，引物探針由無錫正則精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司設(shè)計(jì)合成。通過特異性引物與探針，對(duì)內(nèi)參基因ACTB及PRKY基因啟動(dòng)子cg05163709、cg08045599及cg05618150進(jìn)行qPCR擴(kuò)增從而確定各位點(diǎn)甲基化的水平。

（2）qPCR擴(kuò)增：①根據(jù)待測(cè)樣品的數(shù)量，按照下表配制qPCR預(yù)混液Mix（cg05163709+cg05618150：n+3、cg05618150+cg08045599：n+3）（其中陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控、RNase-Free ddH2O），振蕩混勻，瞬離備用。qPCR反應(yīng)預(yù)混液體系詳見表1和2。

表1 cg05163709/HOXD3反應(yīng)體系配制表Tab.1 Preparation table of cg05163709/HOXD3 reaction system

表2 HOXA7/cg05618150反應(yīng)體系配制表Tab.2 Preparation table of HOXA7/cg05618150 reaction system

②分裝預(yù)混液：取一個(gè)96孔板，分裝預(yù)混液。cg05163709/cg05618150反應(yīng)體系：每孔中加入15 μL預(yù)混液和10 μL模板；cg08045599/cg05618150反應(yīng)體系：每孔中加入15 μL預(yù)混液和10 μL模板（樣本孔位置做好記錄），封好管蓋，振蕩混勻瞬離。

③設(shè)置ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火/延伸/熒光檢測(cè)1 min，共計(jì)算40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為25 μL，cg05163709和cg05618150位點(diǎn)FAM通道，cg08045599位點(diǎn)CY5通道，ACTB位點(diǎn)VIC通道，將樣品放入PCR儀中，選擇好樣品所擺放的位置，save as指定的文件夾，即可開始運(yùn)行程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。

（3）Ct值確定：ABI7500熒光PCR儀：首先設(shè)定基線，選擇手動(dòng)基線（3 ～ 15個(gè)循環(huán)），閾值線要超過正常陰性質(zhì)控品（NC）擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且處于擴(kuò)增曲線的指數(shù)期內(nèi)。從軟件中讀取各樣本在各位點(diǎn)檢測(cè)的Ct值。

1.5 甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)基因啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化則可檢測(cè)到熒光信號(hào)的增加，且熒光信號(hào)產(chǎn)生的閾值循環(huán)數(shù)（Ct）與CpG位點(diǎn)甲基化的程度相關(guān)。當(dāng)cg05163709 、cg05618150和cg08045599甲基化的Ct值≤ 45，并且內(nèi)參基因（ACTB）的Ct值≤ 25，結(jié)果才有效。甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Ct（CpG位點(diǎn)）與Ct（ACTB）的差值（△Ct）來繪制其診斷PCa的ROC曲線，根據(jù)約登指數(shù)確定各指標(biāo)的最佳截?cái)嘀??！鰿T ≥ 截?cái)嘀禃r(shí)判斷為甲基化，△CT＜ 截?cái)嘀禃r(shí)判斷為未甲基化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用R語言3.6.3軟件處理數(shù)據(jù)。采用Shapiro-walk檢驗(yàn)樣本正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間差異采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney檢驗(yàn)）。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。診斷敏感度和特異度采用受試者工作曲線（ROC）進(jìn)行分析，并計(jì)算其曲線下面積（AUC）。P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCa患者與BPH患者的尿液PRKY甲基化狀態(tài)比較PCa患者的年齡、tPSA及f/tPSA與BPH患者對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），而PCa患者的PSAD顯著高于BPH患者（P= 0.007）；PCa患者與BPH患者尿液中cg08045599甲基化陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.870）；PCa患者尿液中cg05163709和cg05618150甲基化陽性率顯著高于BPH患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.002、0.015）。見表3。

表3 PCa患者與BPH患者的臨床病理參數(shù)比較Tab.3 Comparison of clinical and pathological parameters between PCa and BPH patients ±s

表3 PCa患者與BPH患者的臨床病理參數(shù)比較Tab.3 Comparison of clinical and pathological parameters between PCa and BPH patients ±s

項(xiàng)目年齡（歲）tPSA［M（P25，P75），ng/mL］f/tPSA［M（P25，P75）］PSAD［M（P25，P75）］cg05163709甲基化狀態(tài)［例（%）］甲基化非甲基化cg05618150甲基化狀態(tài)［例（%）］甲基化非甲基化cg08045599甲基化狀態(tài)［例（%）］甲基化非甲基化PCa（n = 30）72.00 ± 5.33 9.31（6.01，15.95）0.12（0.10，0.19）0.20（0.10，0.42）BPH（n = 20）69.75 ± 6.77 7.39（3.39，12.23）0.16（0.13，0.22）0.12（0.05，0.18）Z/χ2值1.25 1.34 1.90 2.68 3.16 P 值0.220 0.181 0.058 0.007 0.002 26（86.67）4（13.33）8（40.00）12（60.00）2.43 0.015 16（53.33）14（46.67）3（15.00）17（85.00）1.45 0.870 7（23.33）23（76.67）2（10.00）18（90.00）

2.2 比較cg05163709甲基化、cg05618150甲基化、tPSA、f/tPSA及PSAD診斷PCa的效能建立受試者f/tPSA、PSAD、cg05163709甲基化、cg05618150甲基化診斷PCa的ROC曲線。結(jié)果顯示，tPSA診斷PCa無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AUC = 0.613，P＞ 0.05）。f/tPSA及PSAD診斷PCa有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AUC = 0.663、0.722，P＜ 0.05），敏感度分別為43.30%、46.70%，特異度分別為90.00%、100%。cg05618150甲基化診斷PCa的AUC為0.692（95%CI：0.540 ～ 0.843，P＜ 0.05），敏感度為53.30%，特異度為85.00%。cg05163709甲基化診斷PCa的AUC為0.763（95%CI：0.629 ～0.898，P＜ 0.05），敏感度為86.70%，特異度為53.30%。見圖1。由以上數(shù)據(jù)可知，尿液PRKY啟動(dòng)子cg05163709及cg05618150位點(diǎn)甲基化診斷PCa具有較高的敏感度和特異度，尤其是cg05163709位點(diǎn)，其敏感度（86.70%）和AUC（0.763）均優(yōu)于tPSA、f/tPSA及PSAD。

圖1 tPSA、f/tPSA、PSAD、cg05163709及cg05618150單獨(dú)診斷PCa的ROC曲線Fig.1 ROC curves for individual diagnosis of PCa using tPSA，f/tPSA，PSAD，cg05163709，and cg05618150

2.3 比較cg05163709甲基化、cg05618150甲基化與tPSA等指標(biāo)聯(lián)合診斷PCa的效能建立受試者cg05163709甲基化、cg05618150甲基化聯(lián)合tPSA、f/tPSA及PSAD指標(biāo)診斷PCa的ROC曲線，根據(jù)約登指數(shù)確定各指標(biāo)的最佳截?cái)嘀?。結(jié)果顯示，cg05163709甲基化聯(lián)合tPSA、f/tPSA及PSAD指標(biāo)診斷PCa有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AUC = 0.788、0.795、0.855，P＜ 0.001）；cg05618150甲基化聯(lián)合tPSA、f/tPSA及PSAD指標(biāo)診斷PCa有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AUC =0.682、0.723、0.785，P＜ 0.01）。見表4、圖2。由以上數(shù)據(jù)可知，尿液cg05163709及cg05618150位點(diǎn)甲基化聯(lián)合tPSA、f/tPSA等指標(biāo)能提高甲基化檢測(cè)單獨(dú)單獨(dú)PCa的效能。

圖2 cg05163709及cg05618150位點(diǎn)甲基化與tPSA等指標(biāo)聯(lián)合診斷PCa的ROC曲線Fig.2 ROC curves for combined diagnosis of PCa using methylation of cg05163709 and cg05618150 sites with tPSA and other indicators

表4 cg05163709及cg05618150位點(diǎn)甲基化與tPSA等指標(biāo)聯(lián)合診斷PCa的效能Tab.4 The efficiency of combined diagnosis of PCa using methylation of cg05163709 and cg05618150 sites with tPSA and other indicators

3 討論

DNA甲基化的表觀遺傳機(jī)制在人類惡性腫瘤的生物學(xué)行為中起著重要作用，許多基因的甲基化狀態(tài)可作為潛在的腫瘤生物標(biāo)志物，用于癌癥的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、診斷、預(yù)后和療效評(píng)估［12-13］。異常DNA甲基化主要包括抑癌基因啟動(dòng)子的高甲基化、癌基因啟動(dòng)子的低甲基化以及晚期惡性腫瘤全基因組DNA的低甲基化［14］。研究顯示［15-16］，PCa發(fā)生發(fā)展過程中抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化常導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)抑制和功能喪失，最常見的基因有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 P1（glutathione s-transferase pi 1，GSTP1）、Ras相關(guān)域家族1（ras association domain family 1，RASSF1）等。DNA異常甲基化在PCa早期就開始出現(xiàn)，異常甲基化的基因是理想的生物標(biāo)記物，其穩(wěn)定性好，易于從尿沉渣等DNA含量有限的患者樣本中檢測(cè)出來，有助于識(shí)別PCa患者［17-18］。PAZIEWSKA等［19］研究發(fā)現(xiàn)，APC、TACC2、RARB、DGKZ和HES5基因啟動(dòng)子甲基化診斷PCa具有很高的敏感度和特異度。HOQUE等［20］在PCa患者尿沉渣檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)RASSF1甲基化陽性率達(dá)到73%，而非PCa者陽性率僅為11%。更有研究發(fā)現(xiàn)［21］，尿液APC和RARβ的異常甲基化與PCa的發(fā)病相關(guān)。這些研究表明DNA甲基化對(duì)于PCa的診斷是有前途的。筆者通過前期多個(gè)甲基化數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PRKY啟動(dòng)子在PCa組織中的甲基化水平明顯高于正常組織，但除了前列腺腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）外，PRKY啟動(dòng)子甲基化水平在其他男性常見惡性腫瘤組織與正常組織之間無顯著差異。這與GSTP1基因是完全不同的，GSTP1啟動(dòng)子甲基化水平在多種癌癥組織中是顯著升高的［22］，說明PRKY基因甲基化可能是PCa特異性指標(biāo)。

qMSP法是將甲基化特異性PCR（methlation specific PCR，MSP）與熒光定量PCR相結(jié)合的一種方法，該方法特異性好且敏感性強(qiáng)，能夠檢測(cè)出非甲基化等位基因超過甲基化等位基因10 000倍的樣品，并與Sanger測(cè)序結(jié)果高度一致［23-24］。通過觀察PCR循環(huán)過程中的擴(kuò)增曲線和Ct值，可以判斷樣品是否發(fā)生甲基化以及甲基化程度。與傳統(tǒng)方法相比，qMSP法操作更簡(jiǎn)便，無需進(jìn)行電泳分析，從而大大增加了臨床體外診斷的應(yīng)用可能性。因此，該方法適用于處理臨床高通量樣本，為甲基化研究和臨床診斷提供了有力工具。本研究利用qMSP法對(duì)PRKY基因啟動(dòng)子位點(diǎn)cg05163709 、cg05618150和cg08045599甲基化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示PCa患者尿液標(biāo)本中cg05163709和cg05618150甲基化率明顯高于BPH患者。結(jié)合既往研究顯示PCa組織PRKY表達(dá)顯著低于正常前列腺組織［11］，而PCa PRKY基因啟動(dòng)子處于高甲基化狀態(tài)，推測(cè)PRKY在PCa的發(fā)生過程中是一種腫瘤抑制相關(guān)基因，啟動(dòng)子甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)降低的相關(guān)機(jī)制之一。

PSA作為PCa早期篩查常用指標(biāo)，由于其在臨床應(yīng)用中的靈敏度和特異度不夠理想，已無法滿足早期、精確診斷的要求，容易造成過度治療和漏診［5-7］。盡管臨床上應(yīng)用f/tPSA、PSAD等PSA衍生物來提高PCa的檢出率，但效果仍不佳［25-26］。本研究中發(fā)現(xiàn)PCa患者的tPSA及f/tPSA與BPH患者對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PCa組的PSAD顯著高于BPH組，且單獨(dú)檢測(cè)f/tPSA及PSAD甲基化診斷PCa的AUC均低于0.75，并且敏感度均不超過60%，這與近年來的研究結(jié)果相似。

本研究結(jié)果顯示，PCa患者尿液標(biāo)本中cg05163709和cg05618150甲基化率明顯高于BPH患者，其中cg05163709甲基化診斷PCa的AUC為0.762，診斷效率較高，敏感度能達(dá)到86.70%，對(duì)于PCa的早篩優(yōu)于tPSA、f/tPSA以及PSAD指標(biāo)。我們將PRKY啟動(dòng)子位點(diǎn)甲基化與tPSA、f/tPSA以及PSAD進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)cg05618150甲基化與PSAD聯(lián)合診斷的AUC為0.787，敏感度能達(dá)到86.70%；cg05163709甲基化與PSAD聯(lián)合診斷PCa的AUC為0.855，特異度能達(dá)到95.00%。這一結(jié)果表明PRKY基因啟動(dòng)子位點(diǎn)甲基化聯(lián)合PSAD等指標(biāo)不僅可以早期診斷PCa，并且95%的特異度提示該指標(biāo)如果應(yīng)用于臨床，可大大減少不必要的穿刺。

本研究存在以下不足，cg05163709和cg05618150位點(diǎn)異常甲基化在PCa的早期篩查中具有一定價(jià)值，但其應(yīng)用推廣還需要臨床多中心及大數(shù)據(jù)的支持和驗(yàn)證。此外本研究發(fā)現(xiàn)cg05163709和cg05618150位點(diǎn)甲基化水平在PCa與BPH之間具有明顯差異，但其甲基化改變?cè)谇傲邢俳M織惡變過程中具體機(jī)制需要進(jìn)一步探究。今后我們將在多中心進(jìn)行臨床試驗(yàn)驗(yàn)證尿液PRKY基因中cg05163709和cg05618150位點(diǎn)的診斷價(jià)值，并進(jìn)一步探究這兩個(gè)位點(diǎn)甲基化改變?cè)谇傲邢俳M織惡變過程中具體機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，尿液PRKY啟動(dòng)子cg05163709和cg05618150位點(diǎn)甲基化診斷PCa具有較高的敏感度和特異度（相較于tPSA、f/tPSA、PSAD指標(biāo)），聯(lián)合PSAD等指標(biāo)可早期識(shí)別PCa。