高麗娜 劉小暉 張玉芳 劉小玲 何曉春 高晶 張莉 孫俊 王秀娟 董燕

甘肅省婦幼保健院產(chǎn)二科 （蘭州 730050）

胎盤植入（placenta accreta，PA）是一種以胎盤異常侵襲植入部位為特征的妊娠并發(fā)癥，是造成產(chǎn)后大出血及孕產(chǎn)婦死亡的主要病因［1］。近來年，雖然PA的確切發(fā)病機制尚不清楚［2］，但滋養(yǎng)細胞過度侵襲遷移是PA發(fā)病的主要原因［3］。然而，滋養(yǎng)細胞過度侵襲遷移的具體潛在分子機制知之甚少。長非編碼RNA（lncRNA）是一種非編碼RNA［4］，其通過多種機制調(diào)控基因表達，包括基因組相互作用、蛋白質(zhì)含量、miRNA競爭和染色質(zhì)修飾等［5］。隨著表觀遺傳的發(fā)展和高通量RNA測序技術(shù)的不斷進步，已經(jīng)明確并驗證了lncRNAs在子癇前期［6］、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)［7］、胎兒生長受限［8］等產(chǎn)科疾病中參與該疾病的分子機制。然而，關(guān)于PA的RNA測序在近幾年才相繼報道［9］，其中l(wèi)ncRNA在PA中的具體機制研究更是鮮為少見。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG8在PA中的異常表達，通過生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)與miR-542-3p的結(jié)合位點，但其生物學(xué)功能和潛在機制尚不清楚。本研究通過體外培養(yǎng)人絨毛膜滋養(yǎng)細胞系，探討lncRNA SNHG8對滋養(yǎng)細胞功能行為影響，闡明PA的關(guān)鍵致病分子，豐富對PA病因的認識，可為臨床防治提供有效的診斷標志物或治療靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會審查批準，批件號：（2023）GSFY倫審［05］號。選取2020年5月至2022年2月本院住院患者納入研究對象。PA組為胎盤植入孕婦30例，診斷標準均符合《胎盤植入診治指南（2015）》診斷標準［10］：分娩前經(jīng)臨床高危因素結(jié)合彩色多普勒超聲和（或）MRI征象評估，且最終確診根據(jù)手術(shù)中或分娩時所見或分娩后的病理學(xué)診斷。對照組（PC組）為同期妊娠單胎孕婦30例，排除標準如下：多胎妊娠、呼吸系統(tǒng)疾病、妊娠期高血壓疾病、慢性腎炎、自身免疫性疾病、血糖異常者、心臟病、血栓性疾病、HELLP綜合征、胎兒畸形等。所有參與者在甘肅省婦幼保健院簽署知情同意書。兩組孕婦年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），孕周、孕次、產(chǎn)次及剖宮產(chǎn)次數(shù)均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 PC組和PA組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between PC and PA groups ±s

表1 PC組和PA組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between PC and PA groups ±s

臨床資料年齡（歲）孕周（周）孕次產(chǎn)次剖宮產(chǎn)次數(shù)PC組30.83 ± 0.83 38.93 ± 0.11 2.40 ± 0.14 1.03 ± 0.10 0.90 ± 0.11 PA組31.9 ± 0.70 37.01 ± 0.08 3.60 ± 0.15 1.53 ± 0.10 1.43 ± 0.10 t值0.97 13.41 5.26 3.43 3.51 P值0.330＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001

1.2 主要試劑人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞（HTR8/SVneo）購于上海蓋寧公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于日本Takara公司；lip2000購于美國Invitrogen公司；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液購于北京索萊寶公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Transwell小室購于美國Corning公司；總RNA提取試劑盒購于北京天根公司；lncRNA SNHG8、GAPDH引物由上海生工公司合成，miR-542-3p、U6引物有廣州銳博公司合成；lncRNA SNHG8干擾片段及過表達質(zhì)粒由上海吉瑪公司構(gòu)建，MMP-2和MMP-9抗體購于美國Abcam。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染在適當(dāng)?shù)臈l件下（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的滋養(yǎng)細胞進行傳代，按說明書添加助轉(zhuǎn)試劑，將細胞分3 組：Control組（空白組）、si-NC組（干擾對照組）、si-SNHG8組（干擾lncRNA SNHG8組）。

1.4 Transell實驗Matrigel基質(zhì)膠加入腔室，轉(zhuǎn)染后的細胞（2 × 104個細胞）用無血清培養(yǎng)液接種于上腔室，對應(yīng)的底腔室加入700 μL含 15%血清培養(yǎng)基，孵育48 h后，用4%多聚甲醛固定下室細胞30 min，結(jié)晶紫染色10～15 min，用顯微鏡拍照。染色細胞使用 Image-J來計數(shù)細胞數(shù)量。

1.5 劃痕實驗預(yù)處理后細胞在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞以達到近100%融合，用1 000 μL無菌槍頭劃痕，無血清培養(yǎng)基沖洗后用顯微鏡拍照，并用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集0 h和 24 h創(chuàng)面愈合情況，傷口愈合率計算公式：（初始面積-最終面積）/初始面積×100%。

1.6 Real-time PCR 檢測按照總RNA提取試劑標準程序，從胎盤樣本和滋養(yǎng)細胞中制備總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后使用qRT-PCR儀進行擴增。GAPDH，上游，5′-TGGCAGGTAGGCGGTTGTGTAGA-3′；下游，5′-ATGGCATCGTGCCTGGTCATAT-3′；U6 上游，5′-GCATATATAACCACGAGTTCAGGAAT-3′；下游，5′-CGCGGAGTTCACTCGCTAGTGCAT-3′；miR-542-3p上游，5′-TCGGGGATCATCATGTCACG-3′；下游，5′-GAGTGGCTCCCAGACCTTTC-3′；lncRNA SNHG8，上游，5′-AAGTTTACAAGCATGCGCGG-3′；下游，5′-TCAAACTGACGGTTCTCGGG-3′。

1.7 Western blot實驗按分組干擾細胞48 h后，嚴格按照細胞蛋白提取試劑盒提取蛋白并測蛋白濃度。配制10%分離膠進行電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。一抗MMP-2抗兔（1∶1 000，Abcam），一抗MMP-9抗兔（1∶1 000，Abcam），一抗GAPDH抗兔（1∶5 000，protrintech），次日取出用PBS洗3次，每次10 min，二抗抗兔（1∶5 000，abmart）s室溫2 h，PBS洗3次，每次10 min，蘸取發(fā)光液在曝光機進行曝光并保存，用Image Lab統(tǒng)計。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法使用 Prism 7.0 統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，兩組間均數(shù)采用獨立樣本t檢驗比較，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA SNHG8在 PA胎盤組織中的表達及與患者產(chǎn)前超聲評分的相關(guān)性qRT-PCR 檢測顯示，與PC組（n= 30）比較，PA 組（n= 30） 胎盤樣本中l(wèi)ncRNA SNHG8的表達水平顯著升高（P＜ 0.01），同時，PA患者的lncRNASNHG8的表達與產(chǎn)前超聲評分呈正相關(guān)（P＜ 0.01），提示lncRNA SNHG8表達異?？赡芘cPA有關(guān)，可作為PA的診斷標志物。見圖1。

圖1 PC組和PA組胎盤中l(wèi)ncRNASNHG8的表達水平及與產(chǎn)前超聲評分的關(guān)系Fig.1 The expression level of lncRNA SNHG8 in placenta of PC group and PA group and its relationship with prenatal ultrasound score

2.2 LncRNA SNHG8干擾片段的自身驗證檢測lncRNA SNHG8干擾片段的效率發(fā)現(xiàn)，si-SNHG8-1和si-SNHG8-2組中l(wèi)ncRNA SNHG8表達均低于si-NC組（P＜ 0.01，P＜ 0.05），見圖2。但si-SNHG8-1干擾效率比si-SNHG8-2更佳，故選用si-SNHG8-1繼續(xù)后續(xù)實驗。

圖2 轉(zhuǎn)染干擾片段后lncRNA SNHG8的表達Fig.2 Expression of lncRNA SNHG8 after transfection of interference fragments

2.3 干擾lncRNA SNHG8后對滋養(yǎng)細胞侵襲能力影響Transwell 侵襲遷移實驗結(jié)果顯示：與si-NC組比較，si-SNHG8組侵襲遷移細胞數(shù)明顯減少（P＜ 0.01）；劃痕實驗結(jié)果示，與si-NC組比較，si-SNHG8組遷移率降低（P＜ 0.05），提示干擾lncRNA SNHG8可抑制滋養(yǎng)層細胞的侵襲能力。見圖3。

圖3 干擾lncRNA SNHG8對滋養(yǎng)細胞侵襲遷移影響Fig.3 Effect of interfering lncRNA SNHG8 on trophoblast invasion and migration

2.4 干擾lncRNA SNHG8后對滋養(yǎng)細胞MMP-2和MMP-9的影響通過瞬時轉(zhuǎn)染lncRNA SNHG8干擾片段后對滋養(yǎng)細胞侵襲遷移相關(guān)蛋白的影響，Western blot檢測顯示：與si-NC組比較，si-SNHG8組的MMP-2和MMP-9蛋白表達明顯降低（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 干擾lncRNA SNHG8后對滋養(yǎng)細胞MMP-2和MMP-9影響Fig.4 Effect of lncRNA SNHG8 interference on MMP-2 and MMP-9 trophoblast cells

2.5 lncRNA SNHG8在滋養(yǎng)細胞的定位及miR-542-3p是lncRNA SNHG8可能作用的靶基因我們利用滋養(yǎng)細胞定位分析，結(jié)果顯示lncRNA SNHG8在滋養(yǎng)細胞中主要定位于胞漿（圖5A），通過Star-Base軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-542-3p具有l(wèi)ncRNA SNHG8的結(jié)合位點（圖5B），利用qRT-PCR檢測在兩組胎盤組織中miR-542-3p的表達，結(jié)果顯示，與PC組相比，PA組中miR-542-3p的表達明顯降低，將其與lncRNA SNHG8做相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈負相關(guān)，提示miR-542-3p可能是lncRNA SNHG8的下游靶基因。

圖5 LncRNA SNHG8在滋養(yǎng)細胞中的定位及與miR-542-3p的預(yù)測結(jié)合位點及表達Fig.5 Localization of lncRNA SNHG8 in trophoblast cells and predicted binding sites and expression of miR-542-3p

2.6 lncRNA SNHG8與miR-542-3p的靶向關(guān)系雙熒光素酶報告結(jié)果顯示，過表達miR-542-3p可以明顯減低野生型lncRNA SNHG8的熒光素酶活性（P＜ 0.01），而突變型lncRNA SNHG8的熒光素酶活性未見改變，見圖6。

圖6 雙熒光素酶報告結(jié)果Fig.6 Double luciferase reports results

2.7 抑制miR-542-3p可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA SNHG8對滋養(yǎng)細胞侵襲遷移的影響si-SNHG8與miR-542-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染后，與si-SNHG8+inhibitor-NC組相比，Transwell實驗結(jié)果顯示滋養(yǎng)細胞侵襲遷移能力（P＜ 0.05，P＜ 0.01）；同時，劃痕實驗結(jié)果顯示遷移率增加（P＜ 0.05），見圖 7。

圖7 抑制miR-542-3p可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA SNHG8對滋養(yǎng)細胞侵襲遷移的影響Fig.7 Inhibition of miR-542-3p could reverse the effect of interfering lncRNA SNHG8 on trophoblast invasion and migration

3 討論

PA的發(fā)病率逐年增加，據(jù)報道在0.13% ～0.18%之間，但其確切的發(fā)病機制尚未完全清楚［11］。目前提出較為公認假說包括原發(fā)性蛻膜或基板缺失、滋養(yǎng)細胞異常持續(xù)侵襲以及母體血管重塑異常等，其中，滋養(yǎng)細胞異常持續(xù)侵襲貫穿了整個發(fā)病過程［12］。滋養(yǎng)細胞與腫瘤細胞的行為學(xué)相似，但與腫瘤細胞不同的是，子宮內(nèi)的絨毛滋養(yǎng)層細胞侵襲受到嚴格控制，以防止過度入侵［13］。然而，PA的滋養(yǎng)細胞侵襲是一個獨特的分子轉(zhuǎn)換，類似于腫瘤細胞從良性到惡性進化的機制［14］，這種機制使滋養(yǎng)細胞可以更深入地侵入子宮肌層，完全穿過子宮肌層甚至達子宮漿膜及以上［15］。因此，分娩時胎盤與子宮內(nèi)膜不可能正常分離，易導(dǎo)致產(chǎn)婦大出血和產(chǎn)婦死亡的風(fēng)險。目前，還不清楚滋養(yǎng)細胞是利用其正常的侵襲機制深入子宮，還是PA胎盤差異表達基因所致。為了解決這個問題，本課題組前期取PA組胎盤植入部和正常胎盤進行RNA測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與妊娠年齡匹配的對照組相比，PA組樣本中存在大量lncRNAs失調(diào)。其中l(wèi)ncRNA SNHG8在PA胎盤植入組織中上調(diào)明顯的lncRNA之一，且尚未見在PA中報道，其可能是一個與胎盤植入相關(guān)的新特異性lncRNA。

LncRNAs是非編碼RNA中的大亞群，在腫瘤、心血管疾病及產(chǎn)科疾病中已成為關(guān)鍵調(diào)控因子和診斷及預(yù)后標志物［16-19］。小核仁RNA宿主基因8（small nucleolar RNA host gene 8，SNHG8）屬于小核仁RNA宿主基因（small nucleolar RNA host genes，SNHGs）家族，全長1 062個核苷酸。lncRNA SNHG8在癌癥中異常表達并影響腫瘤進展［20］。例如，在食管鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)SNHG8的表達升高，發(fā)現(xiàn)SNHG8可以通過海綿化miR-411上調(diào)KPNA2的表達［21］，從而影響癌癥的進展。在胃癌中，SNHG8在癌組織和細胞中表達增加，在體外中發(fā)現(xiàn)其敲除可抑制癌細胞增殖和侵襲［22］。此外，F(xiàn)AN等［23］報道SNHG8在乳腺癌組織和細胞中也表達上調(diào)。此外，敲除SNHG8對乳腺癌細胞生長、遷移和侵襲有明顯的抑制作用。近期研究［3］發(fā)現(xiàn)，無論是從分子機制還是表型，PA與腫瘤極其相似。由此，我們推測lncRNA SNHG8可能參與PA滋養(yǎng)細胞侵襲遷移調(diào)節(jié)機制。為了明確其在PA的作用機制，我們的結(jié)果驗證發(fā)現(xiàn)在PA胎盤組織中l(wèi)ncRNA SNHG8高表達，并與PA患者的產(chǎn)前超聲評分呈正相關(guān)，這表明lncRNA SNHG8可能是一個潛在的生物標志物。為了確定lncRNA SNHG8是否通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移參與PA，我們體外培養(yǎng)HTR8/SVneo細胞，干擾lncRNA SNHG8后可降低滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力，同時，侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表達也明顯降低，提示lncRNA SNHG8可能是PA的一個潛在致病因子。越來越多的證據(jù)證實，lncRNAs與miRNAs結(jié)合，負向調(diào)控miRNAs的表達，從而調(diào)控滋養(yǎng)細胞的侵襲遷移［24］。例如，lncRNA SNHG22下調(diào)通過miR-128-3p/PCDH1抑制子癇前期滋養(yǎng)細胞的增殖、遷移和侵襲［25］。本研究通過亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG8主要位于滋養(yǎng)細胞的胞漿中，故我們通過生物軟件預(yù)測lncRNA SNHG8和miR-542-3p之間存在一個假定的結(jié)合位點。同時，在兩組胎盤中驗證miR-542-3p的表達，與對照組相比，miR-542-3p在PA中呈低表達且與lncRNA SNNG8呈負相關(guān)。通過雙熒光素酶實驗報告證實了miR-542-3p與SNHG8 3′-UTR結(jié)合。最后，我們通過恢復(fù)實驗顯示，miR-542-3p inhibitor與si-SNHG8共轉(zhuǎn)染后，滋養(yǎng)細胞侵襲遷移增加，提示抑制miR-542-3p可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA SNHG8對滋養(yǎng)細胞侵襲遷移的影響。上述結(jié)果表明lncRNA SNHG8可以通過負向調(diào)控miR-542-3p增強滋養(yǎng)細胞侵襲遷移能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG8在PA胎盤組織中上調(diào)，而miR-542-3p下調(diào)，lncRNA SNHG8通過靶向海綿吸附miR-542-3p增強滋養(yǎng)層細胞的侵襲和遷移能力，其可能是PA診斷和治療的有效靶點。然而，本研究局限性在于miR-542-3p是如何調(diào)控下游靶基因尚不清楚；其次，臨床樣本較少。因此，本課題組后期將進一步擴大臨床樣本量，探究miR-542-3p的調(diào)控機制，更進一步明確lncRNA SNHG8在PA進展中的分子機制，將為進一步完善lncRNA在PA中的研究奠定基礎(chǔ)。