易玉君 翟曉明 劉慧玲 陶金

中山大學附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科 （廣州 510630）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種累及結(jié)直腸的慢性炎癥性疾病?；颊咄ǔ１憩F(xiàn)為腹痛、腹瀉和黏液血便［1］。腸上皮細胞（IECs）的異常死亡會導致腸屏障的破壞，腸道內(nèi)的微生物入侵腸道，機體釋放大量促炎因子進一步促進腸道內(nèi)的免疫反應(yīng)，導致更多的IECs死亡。這可能是UC難以治愈和復發(fā)的原因之一［2］。焦亡是炎癥細胞死亡的過程，主要功能是誘導強烈的炎癥反應(yīng)，以保護宿主免受微生物感染。在病理條件下，NLRP3炎癥小體被激活。然后，激活的NLRP3炎癥小體通過其連接環(huán)將蛋白GasderminD全長段（GSDMD-F）切割成GSDMD-N，GSDMD-N結(jié)合在細胞膜上形成孔，釋放大量的IL-1β和IL-18［3］，最終導致嚴重的炎癥和細胞死亡。過度激活的炎癥反應(yīng)有助于宿主抵御致病性感染，但也可能導致各種炎癥性疾病，如膿毒癥和尋常痤瘡等［4-5］。焦亡在IBD的作用也越來越受到關(guān)注。有研究［6］表明，在DSS誘導的實驗性結(jié)腸炎小鼠模型中，小鼠的腸道黏膜組織中NLRP3炎癥小體的激活增加。然而，關(guān)于焦亡在UC中的詳細作用機制尚缺乏報道。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1（PTTG1）是一種垂體衍生的轉(zhuǎn)化基因［7］，在正常成人睪丸、胸腺、結(jié)腸中表達，具有促細胞存活及抗細胞死亡的特性，參與調(diào)節(jié)細胞周期、細胞存活和增殖［8］。一項研究［9］發(fā)現(xiàn)在急性酒精性肝損傷中，PTTG1可以通過抑制肝細胞焦亡來減輕損傷。目前尚未有關(guān)于PTTG1在結(jié)腸炎癥中的作用的研究報道。本研究通過建立PTTG1 WT和PTTG1 KO小鼠急性結(jié)腸炎模型以及在HCoEpiC細胞中沉默PTTG1的表達，探討PTTG1是否通過調(diào)控IECs焦亡水平在結(jié)腸炎癥中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物SPF級別的C57BL/6J小鼠10只，雄性，6 ～ 8周齡，體質(zhì)量20 ～ 25 g，購自廣東藥康生物科技有限公司。PTTG1 KO小鼠10只，雄性，6 ～ 8周齡，體質(zhì)量20 ～ 25 g，來自南京賽業(yè)生物技術(shù)有限公司。本動物實驗倫理經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物倫理委員會審批通過（編號：2022d060）。

1.1.2 實驗細胞系HCoEpiC細胞系由中山大學附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室凍存保種。

1.1.3 主要試劑與抗體DSS（MP Biomedicals，美國）、HE染液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）、β-actin抗體（Santa Cruz，美國）、PTTG1抗體（abcam，美國）、NLRP3抗體（proteintech，中國）、ASC抗體（proteintech，中國）、TNF-α（proteintech，中國）、PTTG1 shRNA（吉凱基因，中國）。

1.1.4 主要儀器顯微鏡（Leica，德國）、SDS-PAGE電泳槽（BIO-RAD，美國）、半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD，美國）、PCR儀（BIO-RAD，美國）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性結(jié)腸炎模型構(gòu)建小鼠隨機分為PTTG1 WT對照組、PTTG1 WT實驗組、PTTG1 KO對照組和PTTG1 KO實驗組，每組5只。WT對照組和KO對照組小鼠給予無菌雙蒸水自由飲用，WT實驗組和KO實驗組小鼠自由飲用含3%DSS的無菌雙蒸水6 d。

1.2.2 疾病活動指數(shù)評分從造模第1天起，每天觀察小鼠的體質(zhì)量、糞便性狀和糞便隱血情況，計算小鼠DAI。具體評分標準如下：體質(zhì)量正常為0分，體質(zhì)量下降1% ～ 5%為1分，下降5% ～ 10%為2分，下降10% ～ 20%為3分，下降＞ 20%為4分；大便成形為0分，呈糊狀或半成形為1分，稀便為4分；糞便潛血陰性為0分，大便潛血陽性為2分，肉眼血便為4分。

1.2.3 小鼠結(jié)腸標本收集使用3%DSS造模6 d后，對小鼠深度麻醉后行頸椎脫臼處死。剖開腹部暴露腹腔，游離小鼠全結(jié)腸，沿腸系膜對面縱行剖開結(jié)腸，用預冷的生理鹽水沖洗結(jié)腸。部分結(jié)腸組織置于組織固定液中后續(xù)制成石蠟標本，部分結(jié)腸組織用玻片刮取腸黏膜用于蛋白質(zhì)提取。

1.2.4 HE染色及組織病理學評分將制備好的蠟塊切片，進行脫蠟和梯度水化處理后，HE染色，封片，拍照。組織病理學評分標準：炎癥細胞浸潤：黏膜層輕度浸潤為1分，黏膜層及黏膜下層中度浸潤為2分，透壁中度浸潤為3分；腸上皮結(jié)構(gòu)：上皮局部糜爛為1分，＜ 50%的局部潰瘍形成為2分，廣泛潰瘍形成和（或）肉芽組織形成和（或）假息肉形成為3分?？偡譃? ～ 6分。

1.2.5 免疫組織化學（IHC）染色石蠟切片經(jīng)過處理，與相應(yīng)的一抗、二抗孵育好后，用PBST沖洗，顯微鏡下用DAB顯色，蘇木素染核后，封片，拍照。

1.2.6 結(jié)腸黏膜組織和細胞總蛋白提取及蛋白免疫印跡（WB）根據(jù)總蛋白提取裂解液說明書對結(jié)腸黏膜和細胞總蛋白進行提取和定量。取蛋白樣品進行電泳，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉2 h。用TBST洗滌后，一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后，用對應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，用化學發(fā)光法顯像，采用Image J圖像分析軟件進行灰度分析。

1.2.7 結(jié)腸組織和細胞RNA提取按照RNA快速提取試劑盒的操作說明對結(jié)腸黏膜和細胞進行總RNA提取后，根據(jù)TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將所得的cDNA用無酶水稀釋10倍。應(yīng)用SYBR Green法對目的基因及內(nèi)參基因進行特異性擴增。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8 shRNA沉默PTTG1基因的表達取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，根據(jù)吉凱公司慢病毒轉(zhuǎn)染說明書，慢病毒轉(zhuǎn)染公式，確定每孔慢病毒用量。轉(zhuǎn)染12 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染3 d后加入嘌呤霉素進行細胞抗性篩選。待篩選穩(wěn)定后，繼續(xù)培養(yǎng)細胞，擴增，并提取細胞蛋白及RNA，根據(jù)qPCR明確轉(zhuǎn)染效率。

1.2.9 流式液相多重蛋白定量技術(shù)（CBA）檢測炎癥因子分泌水平收集細胞培養(yǎng)上清，根據(jù)試劑盒說明書進行操作，當天用流式細胞儀上機進行檢測，流式數(shù)據(jù)用Biolegend LEGENDplex?數(shù)據(jù)分析軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism9.0軟件進行統(tǒng)計學分析和作圖。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準誤表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，同一對象不同時間點的測量指標比較采用重復測量的方差分析，后行Bonferroni校正。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性結(jié)腸炎模型構(gòu)建與評估使用3%DSS造模6 d后，小鼠出現(xiàn)急性結(jié)腸炎癥狀，具體表現(xiàn)為體質(zhì)量下降（P＜ 0.05）、結(jié)腸長度縮短（P＜0.000 1）、DAI升高（P＜ 0.01）、結(jié)腸組織病理學評分增加（P＜ 0.001），與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。小鼠結(jié)腸組織切片HE染色顯示，對照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體排列規(guī)則，未見中性粒細胞浸潤；實驗組小鼠結(jié)腸黏膜上皮糜爛，腺體缺失，潰瘍形成，黏膜層及黏膜下層大量炎癥細胞浸潤。以上結(jié)果均表明，3%DSS誘導小鼠急性結(jié)腸炎造模成功。見圖1。

圖1 小鼠急性結(jié)腸炎模型構(gòu)建與評估Fig.1 Model construction and evaluation of acute colitis in mice

2.2 PTTG1在急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜組織中表達減少IHC結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組小鼠結(jié)腸黏膜PTTG1蛋白表達水平明顯下降。WB結(jié)果顯示，實驗組小鼠結(jié)腸黏膜PTTG1表達水平低于對照組（P＜ 0.01）。實驗組小鼠結(jié)腸黏膜PTTG1mRNA水平也低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。以上結(jié)果說明PTTG1在急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜組織中表達減少。見圖2。

圖2 PTTG1在急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜組織中表達減少Fig.2 The expression of PTTG1 was decreased in colonic mucosal tissue in mice with acute colitis

2.3 PTTG1缺失加重小鼠急性結(jié)腸炎為進一步研究PTTG1在結(jié)腸炎中的作用，我們構(gòu)建了PTTG1全敲除的小鼠模型。HE染色結(jié)果顯示，與PTTG1 WT實驗組比較，PTTG1 KO實驗組結(jié)腸炎癥嚴重程度明顯加重，腺體結(jié)構(gòu)破壞更為明顯，炎癥細胞的浸潤增加，組織病理學評分明顯升高（P＜ 0.01）。從造模第4天起，PTTG1 KO實驗組的體質(zhì)量低于PTTG1 WT實驗組小鼠（P＜ 0.05）。且從造模第3天起，PTTG1 KO實驗組DAI高于PTTG1 WT實驗組（P＜ 0.001）。與PTTG1 WT實驗組比較，PTTG1 KO實驗組造模后結(jié)腸長度縮短更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。以上結(jié)果說明PTTG1缺失會加重小鼠急性結(jié)腸炎。見圖3。

圖3 PTTG1缺失加重小鼠急性結(jié)腸炎Fig.3 PTTG1 deletion aggravates acute colitis in mice

2.4 TNF-α誘導結(jié)腸上皮細胞炎癥發(fā)生和PTTG1表達的下調(diào)在動物實驗中證實急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜PTTG1表達下降的研究基礎(chǔ)上，我們利用HcoEpic進一步探究急性結(jié)腸炎與PTTG1表達的關(guān)系。結(jié)果顯示，隨著TNF-α刺激濃度的增加，細胞的PTTG1蛋白表達水平逐漸下降。CBA檢測細胞培養(yǎng)上清，結(jié)果顯示TNF-α刺激后，細胞分泌的促炎因子IL-6、IL-1β增加。以上結(jié)果證實TNF-α誘導HcoEpic炎癥發(fā)生的同時，下調(diào)其PTTG1的表達。見圖4。

圖4 TNF-α誘導結(jié)腸上皮細胞炎癥發(fā)生和PTTG1表達的下調(diào)Fig.4 TNF-α induces inflammation and downregulation of PTTG1 expression in HCoEpiC

2.5 PTTG1缺失加重了結(jié)腸炎腸上皮細胞的焦亡IHC結(jié)果顯示，PTTG1缺失上調(diào)了結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜中NLRP3、ASC的表達水平。WB結(jié)果顯示，PTTG1缺失增加了結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜中GSDMD-N的表達（P＜ 0.05）。同樣地，在細胞實驗中也得到一致的結(jié)論，沉默PTTG1增加了TNF-α刺激的HcoEpic中GSDMD-N的表達（P＜ 0.05）。此外，沉默PTTG1的HcoEpic在TNF-α刺激后分泌的IL-1β和IL-18水平更高。以上結(jié)果表明PTTG1缺失加重了結(jié)腸炎腸上皮細胞的焦亡。見圖5。

圖5 PTTG1缺失加重了結(jié)腸炎腸上皮細胞的焦亡Fig.5 PTTG1 deletion aggravates IECs pyroptosis in colitis

3 討論

UC是一種病因不明的慢性炎癥性腸?。?0］。目前認為一些因素可能參與UC的發(fā)生發(fā)展，包括免疫反應(yīng)失調(diào)、腸道微生物群改變、遺傳易感性和環(huán)境因素［1］。對UC潛在機制的進一步研究對于尋找新的治療技術(shù)和藥物具有重要意義。本研究利用3%DSS建立小鼠急性結(jié)腸炎模型和HcoEpic探索UC的發(fā)生機制。

IECs的異常死亡在UC的發(fā)病機制中起著重要作用［2］。既往研究［11-13］發(fā)現(xiàn)，與UC有關(guān)的細胞異常死亡形式主要有自噬、凋亡、鐵死亡等。最近，文獻報道了一種程序性炎癥性細胞死亡的新形式-焦亡。典型的焦亡途徑依賴于caspase-1來裂解GSDMD。裂解后，GSDMD-N形成跨膜孔，引起細胞裂解死亡，同時也作為炎癥因子分泌的通道，釋放促炎因子IL-1β和IL-18［14-15］，參與多種炎癥疾病。文獻報道，發(fā)育期大鼠海馬組織中微小RNA-223［16］及糖尿病腎病中腎小球足細胞長鏈非編碼RNA H19［17］過表達均可能通過抑制NLRP3/Caspase-1通路來減輕相應(yīng)細胞的焦亡，從而減輕細胞炎癥損傷。既往有研究顯示，上皮源性的GSDMD在IBD患者和實驗性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中均表達增加［18-19］。盡管傳統(tǒng)觀點認為全長段的GSDMs不發(fā)揮生物效應(yīng)，但是一些研究發(fā)現(xiàn)全長段的GSDMs（如IECs中的GSDMB-FL和GSDMDFL）可能具備生物活性［19］。與上述研究相一致，在DSS誘導的急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜組織和TNF-α刺激的HCoEpiC細胞中，我們也發(fā)現(xiàn)了GSDMD-F和GSDMD-N表達的增加。

PTTG1在各種生物過程中發(fā)揮著重要作用，如細胞復制、DNA損傷修復和代謝調(diào)控［7］。此外，PTTG1已被證明參與了基因毒性應(yīng)激后的DNA損傷修復、對抗細胞凋亡和促進細胞存活［20］。一項研究［9］發(fā)現(xiàn)了PTTG1在焦亡中的作用，PTTG1可抑制酒精誘導的肝細胞焦亡，從而緩解酒精性肝損傷。目前尚未有關(guān)于PTTG1在結(jié)腸炎中的作用的研究。在本研究中，我們在急性結(jié)腸炎模型的小鼠結(jié)腸黏膜組織中發(fā)現(xiàn)PTTG1表達水平下調(diào)。我們建立了PTTG1 WT和PTTG1 KO小鼠急性結(jié)腸炎模型以及沉默PTTG1在HCoEpiC細胞中的表達來觀察PTTG1的作用，結(jié)果顯示，PTTG1 KO實驗組小鼠的結(jié)腸炎癥程度明顯加重，PTTG1的缺失可以促進腸上皮細胞焦亡的發(fā)生。

綜上所述，PTTG1的缺失上調(diào)結(jié)腸炎腸上皮細胞焦亡的水平，加重腸道的炎癥反應(yīng)，可能為UC的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)，為UC的治療提供新的靶點。