張弛 胡賽 王靜 夏鳳強 程曉英 甘澤英

長沙市第四醫(yī)院（湖南師范大學附屬長沙醫(yī)院）重癥醫(yī)學科（長沙 410006）

膿毒癥是一種全球性的致命疾病，并導致住院患者死亡，主要是由于感染引起的過度炎癥［1］。由于宿主對感染的防御失調(diào)，膿毒癥會導致器官功能障礙［2］。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是導致膿毒癥發(fā)病和死亡的重要因素［3］。研究［4］表明，大約10%的膿毒癥患者死亡；但膿毒癥休克患者病死率一般超過40%。雖然已經(jīng)提出了幾種機制來促進ARDS的改善，包括炎癥、活性氧累積以及轉(zhuǎn)錄和代謝失調(diào)，但是沒有成功應用于對抗這些機制的具體措施［5］。考慮到呼吸功能的核心作用以及膿毒癥患者缺乏特異性和因果性治療方法，了解潛在機制并確定預防ARDS和治療該患者群體的適當治療策略至關(guān)重要。通常，先天免疫和獲得性免疫都參與介導對組織損傷的反應，這是由于病原體相關(guān)的分子模式通過核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化和隨后肺中促炎細胞因子的產(chǎn)生，表明免疫細胞中的NF-κB活化是ARDS發(fā)展的關(guān)鍵［6］。此外，越來越多的證據(jù)［7］表明肺泡上皮細胞中的NF-κB信號也與ARDS有關(guān)。因此，免疫細胞和肺泡上皮細胞中的NF-κB信號傳導是ARDS的潛在治療靶點。盡管NF-κB信號受泛素化調(diào)節(jié)，泛素化在膿毒癥ARDS中的作用尚未被研究［8］。環(huán)指蛋白99（Ring finger protein 99，RNF99）是E3連接酶三聚體家族的新成員。有研究［9］發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞中RNF99參與調(diào)節(jié)NF-κB介導的炎癥反應。重要的是，據(jù)報道［10］，RNF99可以負調(diào)節(jié)NFκB介導的神經(jīng)炎癥，減輕神經(jīng)元損傷。然而，肺泡上皮細胞中RNF99在膿毒性ARDS發(fā)展中的作用尚未得到全面的研究。為了闡明RNF99在膿毒性ARDS發(fā)展中的潛在作用，我們在肺泡上皮細胞中進行了RNF99過度表達和敲除研究，并使用LPS在小鼠中誘導膿毒性ARDS。本研究的目的是檢測：（1）RNF99是否抑制肺泡上皮細胞中的NF-κB信號；（2）RNF99特異性表達是否改善LPS誘導的小鼠肺部炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和處理小鼠肺泡上皮細胞系MLE12購自美國ATCC，并在37 ℃下在含有2%新生小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco公司）中培養(yǎng)。用LPS處理（5 μg/mL，美國Sigma公司）刺激不同時間（0、2、6、12、24 h）誘導MLE12損傷。使用Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司）進行質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染以過表達或敲低RNF99。在轉(zhuǎn)染前，MLE12在Opti-MEM（美國Invitrogen公司）中孵育2 h。孵育后，用質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染MLE12，并孵育4 ～ 6 h。更換培養(yǎng)基后，將MLE12保存在含有2%新生小牛血清的DMEM/F12中孵育24 h，用于后續(xù)實驗。

為了考察RNF99轉(zhuǎn)染對MLE12細胞中磷酸p65和p65蛋白表達的影響，將MLE12細胞分為：載體組（Vector）、RNF99組、LPS+Vector組、LPS+RNF99組。各組MLE12細胞分別轉(zhuǎn)染Vector或RNF99質(zhì)粒，LPS+Vector組、LPS+RNF99組細胞在轉(zhuǎn)染后用LPS（5 μg/mL）刺激24 h。為了考察si-RNF99轉(zhuǎn)染對MLE12細胞中磷酸p65和p65蛋白表達的影響，將MLE12細胞分為：陰性組（si-NC）、si-RNF99組、LPS+si-NC組、LPS+si-RNF99組。各組MLE12細胞分別轉(zhuǎn)染si-NC或si-RNF99，LPS+si-NC組、LPS+si-RNF99組細胞在轉(zhuǎn)染后用LPS（5 μg/mL）刺激24 h。

1.2 蛋白質(zhì)印跡分析通過蛋白質(zhì)印跡分析從肺組織或MLE12細胞提取的蛋白質(zhì)表達。將左上肺勻漿并在RIPA緩沖液（北京Solarbio公司）中溶解。用BCA蛋白檢測試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）測量蛋白濃度。等量的蛋白質(zhì)通過10% SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（美國Millipore公司）后，室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后與第一抗體在4 ℃孵育過夜。在室溫下與過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體（1∶5 000，英國Abcam公司）孵育1 h后，通過ECL化學發(fā)光系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）觀察條帶。實驗使用的第一抗體如下：小鼠單克隆抗-TAK1、兔多克隆抗IκBα和小鼠單克隆抗-TRAF6購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；小鼠單克隆RNF99購自美國BD Biosciences公司；兔單克隆抗p65、兔單克隆抗磷酸p65（Ser536）和兔多克隆抗β-微管蛋白購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 免疫沉淀將來自MLE12細胞的300 μg全細胞裂解物用蛋白A/G珠預澄清30 min。預清除的細胞提取物以4 500g離心2 min，上清液與2 μg抗體在4 ℃孵育過夜。小鼠單克隆抗TAK1、小鼠單克隆抗TRAF6用于免疫沉淀。正常兔或小鼠IgG用作陰性對照。孵育后，將上清液與蛋白A/G珠混合，并在4 ℃孵育2 h。對樣品進行8% SDSPAGE分離，并用小鼠抗RNF99抗體進行免疫印跡。采用Signal-SeekerTM泛素化檢測試劑盒（美國Cytoskeleton公司）進行泛素化蛋白的選擇性分離。使用抗TRAF6抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析來評估泛素化蛋白。

1.4 實驗動物治療本研究中使用的成年雄性C57BL/6J小鼠（6周齡，體質(zhì)量22 ～ 24 g）購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)在濕度為50% ～ 60%、溫度為24 ～ 26 ℃且光照/黑暗周期為12 h的受控環(huán)境中。

將40只小鼠隨機分成WT+PBS、WT+LPS、RNF99特異性表達（TG）+PBS和TG+LPS組，每組10只。WT+LPS組和TG+LPS組小鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg，美國Sigma公司）進行麻醉，通過腹膜內(nèi)注射30 mg/kg LPS誘導膿毒癥［11］。WT+PBS組、TG+PBS組小鼠腹膜內(nèi)注射相同劑量的PBS。TG+LPS組小鼠和TG+PBS組小鼠在腹膜內(nèi)注射LPS前3 d，將基于AAV的RNF99過表達質(zhì)粒（1 × 1012μg/mL，60 μL）滴注到小鼠的肺中，用于特異性表達RNF99。在施用LPS后12 h處死小鼠，并通過蛋白質(zhì)印跡分析和組織學分析進行評估。

1.5 組織學分析將小鼠的整個左肺固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蠟中，并切成4 μm的切片。然后將切片進行H&E染色和CD68（武漢Servicebio公司）IHC染色。對于IHC染色，組織切片首先在60 ℃烘烤2 h，然后用二甲苯脫蠟，并通過乙醇梯度再水合。然后通過在檸檬酸鹽緩沖液中于95 ℃加熱30 min并冷卻至室溫，對載玻片進行抗原修復。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性和血清封閉后，將切片與適當?shù)囊豢购投挂黄鸱跤?，然后用DAB顯色溶液進行DAB顯色反應。細胞核復染和脫水后，用倒置顯微鏡拍攝組織切片圖像。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標準差。兩組之間的統(tǒng)計比較采用t檢驗。多組間比較采用重復測量方差分析或單因素方差分析，隨后通過Bonferroni校正進行兩兩比較測試。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激MLE12細胞后RNF99的表達圖1A所示，在LPS刺激后，MLE12細胞中RNF99的蛋白表達水平連續(xù)下降（F= 12.75，P＜ 0.001）。為了檢測RNF99和NF-κB通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之間的相互作用，在MLE12細胞中進行了內(nèi)源性免疫沉淀。見圖1B，RNF99與TRAF6和TAK1相互作用。

2.2 RNF99過表達抑制MLE12細胞NF-κB信號通路與Vector組相比，RNF99組MLE12細胞中TRAF6和TAK1的蛋白表達水平顯著降低（P＜ 0.05）（圖2A）。泛素化TRAF6蛋白在RNF99敲低的MLE12細胞中增加（圖2B）。與LPS+Vector組相比，在LPS+RNF99組MLE12細胞中p65的磷酸化水平明顯降低（P＜ 0.05，圖2C）。

圖2 RNF99過表達抑制MLE12細胞NF-κB信號通路Fig.2 RNF99 overexpression inhibits NF-κB signaling pathway in MLE12 cells

2.3 RNF99基因敲除加劇MLE12細胞NF-κB信號的激活與si-NC組相比，si-RNF99組MLE12細胞中RNF99、IκBα的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）（圖3A）。與LPS+si-NC組相比，在LPS+si-RNF99組MLE12細胞中p65的磷酸化水平明顯增加（P＜ 0.05，圖3B）。

圖3 RNF99敲低增強LPS刺激后MLE12細胞的NF-κB信號通路Fig.3 RNF99 knockdown enhances NF-κB signaling pathway in MLE12 cells stimulated by LPS

2.4 小鼠肺組織中RNF99與NF-κB信號調(diào)節(jié)因子的相互作用與WT組小鼠相比，TG組小鼠肺組織中RNF99的蛋白水平顯著增加（P＜ 0.05），TRAF6和TAK1的蛋白表達水平顯著降低（P＜ 0.05，圖4A）。進行免疫沉淀以闡明肺組織中RNF99和TAK1/TRAF6之間的相互作用。如圖4B所示，RNF99與肺組織中的TRAF6和TAK1相互作用。接下來，我們檢查了LPS注射（50 mg/kg）后RNF99的內(nèi)源性表達水平的變化，并發(fā)現(xiàn)RNF99的蛋白表達水平降低（圖4C）。

圖4 RNF99與體內(nèi)NF-κB信號傳導的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子相互作用Fig.4 Interaction between RNF99 and key regulatory factors of NF-κB signal transduction in vivo

2.5 RNF99過度表達減輕腹腔注射LPS誘導的小鼠肺部炎癥損傷與WT+PBS組小鼠相比，WT+LPS組小鼠肺組織中出現(xiàn)中性粒細胞浸潤、隔膜增厚、肺泡水腫，CD68巨噬細胞染色百分比顯著增加（P＜ 0.05）。TG+LPS組小鼠肺組織中中性粒細胞浸潤、隔膜增厚、肺泡水腫較WT+LPS組減輕，并且CD68巨噬細胞染色百分比顯著降低（P＜ 0.05）。此外，TG+LPS組小鼠肺組織中p65的磷酸化水平顯著低于WT+LPS組小鼠（P＜ 0.05，圖5）。

圖5 RNF99過度表達減輕腹腔注射LPS誘導的小鼠肺部炎癥和損傷（n = 6）Fig.5 Overexpression of RNF99 reduces lung inflammation and injury induced by intraperitoneal injection of LPS in mice（n = 6）

3 討論

泛素化在NF-κB介導的炎癥性疾病中起著關(guān)鍵作用，許多E3泛素連接酶都參與其中，如RNF99［8，12-13］。以前對RNF99的研究主要集中在腫瘤進展中涉及的生物學過程［14］。然而，對RNF99在膿毒性ARDS炎癥免疫反應中的作用的認識仍然有限。本研究的主要發(fā)現(xiàn)如下：（1）MLE12細胞對LPS的反應性降低了RNF99蛋白的表達；（2）RNF99與TRAF6和TAK1相互作用，并在體內(nèi)外調(diào)節(jié)它們的蛋白表達；（3）TG小鼠表現(xiàn)出比WT小鼠更低的TRAF6和TAK1蛋白表達水平，并減輕腹腔注射LPS誘導的小鼠肺部炎癥損傷。我們的結(jié)果表明，RNF99在膿毒性ARDS的發(fā)展中起著保護作用。

RNF99首先在具有異常免疫表型的突變小鼠中被鑒定，并被報道通過抑制免疫細胞中的NF-κB途徑在炎癥停止中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。因此，RNF99蛋白的表達可能在炎癥中起重要作用。據(jù)報道［15］，RNF99的E3連接酶活性受其表達水平和磷酸化的調(diào)節(jié)，通過與銜接蛋白如c-Jun N-末端激酶相互作用，緩解了WW-接頭對RNF99 HECT結(jié)構(gòu)域的自身抑制性構(gòu)象。研究［16］發(fā)現(xiàn)，在巨噬細胞細胞中，通過自身泛素化，RNF99在氧化應激（如阿霉素和過氧化氫刺激）的反應中下調(diào)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在LPS刺激后，MLE12細胞中RNF99蛋白的表達水平連續(xù)下降。此外，體內(nèi)腹腔注射LPS后，RNF99蛋白表達水平降低。這些結(jié)果表明RNF99在膿毒性ARDS中下調(diào)。

已證實許多機制可以激活NF-κB途徑。其中，LPS與Toll樣受體4結(jié)合后可通過TRAF6傳導信號激活NF-κB途徑［17］。TRAF6是一種環(huán)型E3連接酶，與TAK1復合并催化K-63多泛素鏈，后者可以作為連接信號蛋白復合物的支架［17］?；罨腡AK1通過磷酸化IκB激酶（IKK）β導致NF-κB活化［18］。因此，TRAF6和TAK1是LPS誘導的NF-κB信號通路的關(guān)鍵成分［19］。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)RNF99抑制了MLE12細胞中TRAF6的蛋白表達水平。有研究［20］表明，通過抑制TRAF6蛋白表達和隨后的NF-κB活化，膿毒性ARDS得到改善，表明TRAF6蛋白表達的重要性。因此，TRAF6表達減少可能有助于抑制LPS誘導的RNF99過表達小鼠的NF-κB活化。

TAK1是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員，能夠磷酸化NF-κB信號通路的下游靶標，包括IKKβ［21］。包含TAK1結(jié)合蛋白1、2和3的TAK1復合物通過E3連接酶與K-63連接的泛素鏈連接，并在細胞刺激后被激活，表明泛素化在調(diào)節(jié)TAK1激活中的重要性［22］。研究［9］已經(jīng)證明，RNF99順序催化TAK1上K48連接的泛素鏈，并在CYLD去除K63連接的泛素化后通過蛋白酶體途徑將其降解。在目前的研究中，我們證明了RNF99過度表達可以抑制肺部中TAK1的表達。據(jù)報道，NF-κB激活會引發(fā)炎癥風暴，并通過增加細胞因子分泌來促進肺部炎癥損傷［6］。LPS刺激后，WT和TG小鼠之間的肺組織中中性粒細胞浸潤、隔膜增厚、肺泡水腫和巨噬細胞浸潤存在顯著差異。因此，RNF99可能通過降低TAK1的蛋白表達水平來抑制NF-κB信號的激活，進而減輕肺損傷。

綜上所述，RNF99通過與NF-κB信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（TRAF6/TAK1）相互作用來調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，并改善小鼠腹腔注射LPS后肺損傷。因此，RNF99可能成為膿毒癥患者預防膿毒性ARDS的一個新的治療靶點。然而，本研究沒有對TRAF6和TAK1的泛素化進行完全評估，因為其涉及K63-連接和K48-連接的泛素化和去泛素化的復雜過程。需要進一步的研究來揭示RNF99抑制膿毒性ARDS的確切機制。