陳甜夢(mèng)，蔡彤璇，王嘉璐，田牧野，趙寶華，劉 東

（河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種淡水、兼性厭氧、化學(xué)有機(jī)異養(yǎng)細(xì)菌，可引起魚類、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類和哺乳動(dòng)物的疾病，尤其可引起魚類細(xì)菌性敗血癥[1]，由于其高發(fā)病率和死亡率，給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。抗生素治療是對(duì)抗嗜水氣單胞菌感染的主要措施。然而，由于抗生素耐藥性發(fā)展和傳播的嚴(yán)峻形勢(shì)，以及藥物殘留和環(huán)境污染，迫切需要抗生素的替代品[3]。疫苗免疫是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)疾病防控中重要的、有效的方式，在抗生素減少和替代的背景下，疫苗開發(fā)和應(yīng)用的意義更加突出[4]。

Tol-Pal 系統(tǒng)是由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的一組蛋白質(zhì)復(fù)合物。這一系統(tǒng)由內(nèi)膜相關(guān)亞單位TolA、TolQ、TolR 3 種蛋白質(zhì)以及外膜錨定亞單位TolB 和Pal 蛋白組成[5]。Tol-Pal 系統(tǒng)首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，隨后在許多其他細(xì)菌屬中也有報(bào)道。對(duì)于革蘭氏陰性菌來說，Tol-Pal系統(tǒng)具有重要而多樣的生物學(xué)功能[6]。tol-pal基因的突變對(duì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和細(xì)菌致病性具有重要作用。目前，關(guān)于Tol-Pal系統(tǒng)在細(xì)菌致病機(jī)制中的作用主要體現(xiàn)在：tol-pal基因突變體細(xì)胞壁及包膜完整性被破壞，某些細(xì)菌毒力蛋白如毒素和鞭毛蛋白的功能減低或產(chǎn)生缺陷[7]。tol-pal基因?qū)δ承┲虏∥⑸锏纳L(zhǎng)或存活是至關(guān)重要的，tol-pal基因突變體不能在宿主體內(nèi)存活等[8]。

革蘭氏陰性菌細(xì)胞表面外膜蛋白（Outer membrane protein，OMP）在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)方面發(fā)揮重要作用[9-11]。革蘭氏陰性細(xì)菌外膜蛋白TolB 是一種周質(zhì)蛋白，它與外膜脂蛋白Pal 相互作用以介導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)外層之間的接觸。TolB 還可以與位于外膜的幾種蛋白質(zhì)相互作用，包括OmpA、OmpF和Lpp[5]。研究表明，TolB位于細(xì)胞膜表面，廣泛與外界接觸，而且又是病原菌轉(zhuǎn)運(yùn)毒素的必要裝置，有較好的免疫原性和免疫保護(hù)性，是亞單位疫苗的潛在候選[12]。

嗜水氣單胞菌外膜蛋白表面的抗原決定簇可使其極易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而引起機(jī)體的特異性免疫[13-15]。目前，未見關(guān)于嗜水氣單胞菌Tol-Pal 系統(tǒng)致病性的研究報(bào)道，對(duì)嗜水氣單胞菌外膜蛋白TolB 特性的研究，將有助于嗜水氣單胞菌減毒疫苗或抗菌藥物的開發(fā)。為了深入研究嗜水氣單胞菌外膜蛋白TolB 的免疫功能，表達(dá)純化得到TolB 蛋白，并借助生物信息學(xué)軟件分析了TolB 的蛋白質(zhì)序列相似性，預(yù)測(cè)和分析了其基本理化性質(zhì)、信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)，磷酸化與糖基化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及優(yōu)勢(shì)的B 細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，以期為TolB 蛋白亞單位疫苗的制備奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）ATCC 7966、大 腸 桿 菌（Escherichia coli）DH5α 和BL21（DE3）。A.hydrophila與E.coli均使用LB培養(yǎng)基，在37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。使用的抗生素終質(zhì)量濃度：氨芐青霉素（Amp）為100 μg/mL，卡那霉素（Kan）為50 μg/mL。

1.2 主要試劑

Taq酶、DNA 連接酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶和IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）購(gòu)自Takara 公司；DNA 片段回收試劑盒購(gòu)自生工公司；Ni-NTA agarose 樹脂購(gòu)自Qiagen 公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自天根公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 引物

本研究所用引物為tolB-up：CGCCATATGTCTTCTTCTGATTCTGACG；tolB-down：AAACTCGAGGTAAACCAGAACCGCA。酶切位點(diǎn)分別為NdeⅠ和XhoⅠ。引物合成由金唯智公司完成。

1.4 嗜水氣單胞菌tolB基因的克隆

以A.hydrophilaATCC 7966 基因組DNA 為模板，tolB-up 和tolB-down 為 引 物，PCR 反 應(yīng) 條 件：95 ℃2 min；95 ℃30 s，56 ℃1 min，72 ℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃1 h。使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，4 ℃保存。

1.5 嗜水氣單胞菌tolB基因異源表達(dá)載體的構(gòu)建

將所得的tolB基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，純化回收目的片段，與經(jīng)過酶切的表達(dá)載體pET-22b（+）連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化入E.coliBL21（DE3），挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序。

1.6 嗜水氣單胞菌TolB蛋白的原核異源表達(dá)

將篩選到的陽(yáng)性克隆接種到含有50 μg/mL 卡那霉素的100 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)到0.4～0.6 后，添加IPTG 使其終濃度達(dá)到0.5 mmol/L，16 ℃180 r/min 過夜誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌液，經(jīng)4 ℃、8 000 r/min 離心10 min 收集菌體沉淀，將沉淀用20 mL裂解液重懸，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞（電壓：16 V；時(shí)間：20 min；脈沖周期：pulse on：8 s；pulse off：8 s）。將細(xì)胞裂解液于4 ℃、15 000 r/min離心10 min，收集上清。

1.7 嗜水氣單胞菌TolB蛋白的純化

將收集到的上清液用鎳柱進(jìn)行純化。把上清液加到Ni-NTA agarose 樹脂中輕輕混勻，4 ℃結(jié)合1 h，用含75 mmol/L咪唑的洗滌液洗去未結(jié)合蛋白，再用含300 mmol/L 咪唑的溶液洗脫目的蛋白，收集各個(gè)組分，用SDS-PAGE 分析純化效果。具體操作參照Qiagen公司蛋白質(zhì)純化手冊(cè)。

1.8 嗜水氣單胞菌TolB的生物信息學(xué)分析

1.8.1 TolB 的理化性質(zhì)和修飾位點(diǎn)分析 采用ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)絡(luò)在線軟件對(duì)嗜水氣單胞菌TolB 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、親水性、等電點(diǎn)、脂肪指數(shù)和穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；采用ProtScale analysis（https：//web.expasy.org/protscale/）方法預(yù)測(cè)親水性圖譜。利用在線網(wǎng)站YinOYang-1.2（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/YinOYang-1.2/）和 NetNGlyc-1.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）分別分析TolB蛋白的O糖基化和N糖基化位點(diǎn)。

1.8.2tolB基因序列測(cè)定、序列相似性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹繪制 測(cè)序分析由金唯智生物科技有限公司完成。使用生物信息網(wǎng)站NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和DNAMAN 軟件拼接基因的全長(zhǎng)序列，并推導(dǎo)編碼的氨基酸序列。利用NCBI 網(wǎng)站下載嗜水氣單胞菌（A.hydrophila，GenBank 登錄號(hào)：WP_011707363.1）、殺 鮭 氣 單 胞 菌（Aeromonas salmonicida，GenBank 登錄號(hào)：RSM27999.1）、簡(jiǎn)氏氣單 胞 菌（Aeromonas jandaei，GenBank 登 錄 號(hào)：BCS50541.1）、舒氏氣單胞菌（Aeromonas schubertii，GenBank 登 錄 號(hào)：QCG49071.1）、豚 鼠 氣 單 胞 菌（Aeromonas caviae，GenBank 登錄號(hào)：BDC85372.1）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，GenBank 登錄號(hào)：QLH68355.1）、產(chǎn) 堿 普 羅 維 登 斯 菌（Providencia alcalifaciens，GenBank 登錄號(hào)：CAG9413353.1）以及愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri，GenBank 登錄號(hào)：QPW30779.1）的tolB基因編碼的氨基酸序列，使用GeneDoc 軟件進(jìn)行相似性分析，并計(jì)算出序列相似度，采用MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8.3 TolB 的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用Signal P4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）軟件對(duì)TolB 蛋白進(jìn)行信號(hào) 肽 預(yù) 測(cè)。 利 用TMHMM serverv.2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）隱馬爾科夫模型（Hidden Markov Model，HMM）對(duì)TolB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html） 和 SWISS-MODEL （https://swissmodel.expasy.org/）在線軟件，分別對(duì)TolB 蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

1.8.4 TolB 的的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 采用NetPhosBac-1.0server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhosBac-1.0/）預(yù)測(cè)TolB 蛋白的磷酸化位點(diǎn)。通過String蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)網(wǎng)站（https：//cn.string-db.org/），預(yù)測(cè)TolB蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.8.5 TolB 的細(xì)胞抗原表位分析 采用ABCpred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/index.html）和 BepiPred-2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）方法預(yù)測(cè)TolB 蛋白的B 細(xì)胞表位，分析其肽段位置分布情況。細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）抗原表位采用nHLAPred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/nhlapred/）進(jìn) 行 預(yù) 測(cè)，選 擇HLA-A*020l、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205 四 類 限制表型。采用在線軟件ProPred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/propred/index.html）對(duì)TolB 蛋白進(jìn)行Th 抗 原 表 位 預(yù) 測(cè)，選 用HLA-DRBl_0101、HLADRBl_0102、HLA-DRBl_030l 三種不等位基因類型進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 A.hydrophila tolB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

TolB 信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，嗜水氣單胞菌TolB蛋白的信號(hào)肽序列由N 端的21 個(gè)氨基酸殘基組成（1—21 位），切割位點(diǎn)在第21—22 個(gè)氨基酸殘基，分值是0.946。因此，本研究根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)中嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）ATCC 7966 的tolB核苷酸序列（登錄號(hào)：NC_008570）設(shè)計(jì)得到去除信號(hào)肽的特異性PCR 引物，從基因組中擴(kuò)增1 條大小約為1 263 bp 的DNA 單一條帶，與預(yù)期基因大小一致。將擴(kuò)增基因產(chǎn)物命名為AHtolB，將目的基因與克隆載體連接并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，AHtolB與A.hydrophilaATCC 7966tolB基因（GenBank 登錄號(hào)：WP_017412185.1）相似度100%。

2.2 TolB蛋白的異源表達(dá)與純化

以pET-22b（+）為載體成功構(gòu)建pET-22b-tolB重組質(zhì)粒，NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）進(jìn)行異源表達(dá)。重組菌株經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni 柱純化后超濾濃縮，將產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，得到分子質(zhì)量約46 ku的目的蛋白，這與根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)出的TolB 蛋白分子質(zhì)量相近（圖1）。

圖1 親和層析純化TolB 蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified TolB protein

2.3 TolB蛋白理化性質(zhì)分析

TolB 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，蛋白的分子質(zhì)量為45.78 ku；相對(duì)分子質(zhì)量為86.26，理論等電點(diǎn)為8.75。TolB 蛋白全長(zhǎng)序列氨基酸數(shù)量為441個(gè)，含量較多的氨基酸是甘氨酸（39個(gè)，占8.8%）、絲氨酸（39 個(gè)，占8.8%）和丙氨酸（38 個(gè)，占8.6%）；TolB 只含有一個(gè)半胱氨酸，不含有二硫鍵。帶負(fù)電荷的氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）共有41個(gè)，帶正電荷的氨基酸（精氨酸和賴氨酸）共有44個(gè)，其分子式為C2137H3392N594O647S14，原子總數(shù)6 784。假設(shè)TolB所有的胱氨酸殘基以半胱氨酸的形式出現(xiàn)，即形成二硫鍵，消光系數(shù)為60 850 mol/cm，A280為1.262；假設(shè)二硫鍵全部打開，消光系數(shù)為60 850 mol/cm，A280為1.262。TolB 在哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)半衰期大于10 h。TolB不穩(wěn)定指數(shù)為34.14，表明嗜水氣單胞菌TolB 蛋白屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)是86.26，平均親水性（GRAVY）為-0.194，表明嗜水氣單胞菌TolB蛋白為親水性蛋白。

2.4 嗜水氣單胞菌tolB基因序列相似性比較

序列相似性比對(duì)結(jié)果表明，TolB 氨基酸序列在氣單胞菌間具有高度的同源性，分別為99.3%（維氏氣單胞菌）、98.4%（簡(jiǎn)氏氣單胞菌）、97.5%（豚鼠氣單胞菌）、96.6%（殺鮭氣單胞菌）和90.9%（舒氏氣單胞菌），而在不同屬間菌株也具有一定的同源性，如32.5%（產(chǎn)堿普羅維登斯菌）和33.6%（愛德華氏菌）（圖2）。以MEGA 5.0 軟件構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，幾種不同的氣單胞菌親緣關(guān)系均較近，且不同種屬間也有一定的親緣關(guān)系（圖3）。因而，TolB 蛋白免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體可能對(duì)不同種屬的細(xì)菌具有交叉免疫的作用。

圖2 氣單胞菌屬菌株間TolB蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.2 Alignment of amino acid sequences from A.hydrophila and other Aeromonas strains

圖3 不同菌株間TolB蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic relationships of TolB among different strains

2.5 TolB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TolB 蛋白沒有跨膜區(qū)，所有區(qū)域都在細(xì)胞膜外，是一種外膜蛋白。

TolB 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4 所示。TolB蛋白包含的二級(jí)結(jié)構(gòu)分別為α 螺旋（藍(lán)色）66個(gè)，占14.97%；β 片層（紅色）129 個(gè)，占29.25%；β 轉(zhuǎn)角（綠色）52 個(gè)，占11.79%；無規(guī)則卷曲（紫色）194 個(gè)，占43.99%。無規(guī)則卷曲是TolB 蛋白含量最豐富的結(jié)構(gòu)原件。

圖4 TolB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 The secondary structure prediction of TolB

利用SWISS-MODEL 進(jìn)行同源建模，得到了以PDB ID：3iax.1.A 為模板的預(yù)測(cè)模型。比對(duì)結(jié)果顯示，模板與TolB 同源性最高為48.72%，基于模板構(gòu)建了TolB 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖（圖5），全局模型質(zhì)量評(píng)估分?jǐn)?shù)（GMQE）為0.79，GMQE 值在0～1，數(shù)字越高表明可靠性越高。TolB 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型覆蓋率最高為97%，說明模型的質(zhì)量和匹配度較好，可靠性較高。從TolB 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型可以看出，其α 螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)數(shù)量較多，推測(cè)α螺旋和無規(guī)則卷曲對(duì)TolB蛋白生物學(xué)功能具有重要作用。

圖5 TolB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 The 3-D structure prediction of TolB

2.6 TolB蛋白翻譯后的修飾

2.6.1 磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè) NetPhosBac 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，TolB 蛋白的磷酸化位點(diǎn)有12 個(gè)，全部為絲氨酸磷酸化位點(diǎn)。包括第18、33、103、134、141、208、247、277、187、296、410、428位氨基酸。

2.6.2 糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè) 利用NetNGlyc-1.0 服務(wù)器預(yù)測(cè)TolB 蛋白存在1 個(gè)N 糖基化位點(diǎn)，位于395位。應(yīng)用在線軟件YinOYang-1.2預(yù)測(cè)該蛋白可能存在1個(gè)O糖基化位點(diǎn)，位于294位。

2.7 TolB蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

TolB 蛋白相互作用預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TolB 蛋白與10 種蛋白質(zhì)存在相互作用，其中與Tol-Pal 系統(tǒng)中的Pal 蛋白、TolQ 蛋白、TolA 蛋白、TolR 蛋白以及外膜蛋白CpoB 蛋白、BamD 蛋白和BamA 蛋白之間的相互作用更加緊密（圖6）。

圖6 TolB蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of TolB protein interaction

2.8 TolB蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

通過ABCpred 軟件預(yù)測(cè)TolB 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位，序列的得分越高，表明作為抗原表位的概率越高。預(yù)測(cè)得到的抗原表位評(píng)分大于0.85 的表位有10 條，分別 為190—205、301—427、74—89、167—182、334—349、352—367、346—361、422—437、256—277、131—147 aa。利用BepiPred-2.0 方法預(yù)測(cè)獲得的細(xì)胞優(yōu)勢(shì)B 抗原表位共有13條，其中長(zhǎng)度大于6 aa的共有11條，分別為43—67、69—95、123—156、160—173、199—205、242—252、287—295、334—342、380—387、419—425 aa。使用在線軟 件Vaxi-Jen 2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）進(jìn)一步對(duì)抗原性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示，潛在B 細(xì)胞抗原表位數(shù)量為9 個(gè)（表1）。

表1 TolB蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)Tab.1 B-cell epitope prediction results of TolB

2.9 TolB蛋白T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

2.9.1 TolB 蛋白CTL 抗原表位預(yù)測(cè) 通過nHLAPred 在線軟件預(yù)測(cè)CTL 抗原表位，選擇HLAA_020l、HLA-A_0202、HLA-A_0203、HLA-A_0205四類限制表位，篩選出表位肽共20 條。屬于HLAA2 表 位 有7—21、138—146、364—372 aa，屬 于HLA-A_0201 表位有49—57、388—396 aa。屬于HLA-A_0202 表 位 的 有49—57、99—107、388—396 aa。屬于HLA-A_0203 表位有121—129、150—158、185—293 aa。屬于HLA-A_0205 表位有1—9、34—46、110—122、150—158、166—180、260—268、359—367、426—434、442—450 aa。將預(yù)測(cè)得到的CTL抗原表位應(yīng)用Vaxi-Jen 2.0軟件進(jìn)一步評(píng)估，最終確定8個(gè)CTL細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位（表2）。

表2 TolB蛋白CTL抗原表位預(yù)測(cè)Tab.2 CTL peptide prediction results of TolB

2.9.2 TolB 蛋白Th 抗原表位預(yù)測(cè) 分別選擇等位基因HLA-DRB1_0101、HLA-DRB1_0102 和HLADRB1_0301 預(yù)測(cè)Th 細(xì)胞抗原表位。預(yù)測(cè)得到HLA-DRB1_0101 的 表 位 為6—22、25—33、226—234 aa。預(yù)測(cè)得到HLA-DRB1_0102 的表位6 條，分別 為6—22、25—33、100—108、252—260、356—364、278—386 aa。預(yù)測(cè)得到HLA-DRB1_0301的表位8 條,分 別 為25—33、57—70、100—108、137—145、206—214、281—289、349—370、414—422 aa。將預(yù)測(cè)得到的Th抗原表位應(yīng)用Vaxi-Jen 2.0軟件進(jìn)一步評(píng)估，最終確定2 個(gè)HLA-DRB1_0101 優(yōu)勢(shì)表位，1個(gè)HLA-DRB1_0102 優(yōu)勢(shì)表位和4 個(gè)HLADRB1_0301優(yōu)勢(shì)表位（表3）。

表3 TolB蛋白Th抗原表位預(yù)測(cè)Tab.3 Th peptide prediction results of TolB

3 結(jié)論與討論

疫苗免疫是水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防控的重要手段。嗜水氣單胞菌滅活疫苗通過誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，對(duì)水生動(dòng)物具有較好的免疫保護(hù)作用，因此被廣泛研究和應(yīng)用[16]。嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）幼魚表現(xiàn)出顯著的免疫保護(hù)作用，免疫后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體[17]。通過腹腔注射或浸泡接種嗜水氣單胞菌滅活疫苗可顯著上調(diào)細(xì)鱗鯧（Piaractus mesopotamicus）血清和皮膚黏液中溶菌酶和特異性抗體水平，從而提高感染后的存活率[18]。然而，由于嗜水氣單胞菌來源廣泛、血清型多，限制了滅活疫苗的免疫保護(hù)作用和應(yīng)用范圍。雖然嗜水氣單胞菌減毒活疫苗和核酸疫苗也表現(xiàn)出很好的免疫保護(hù)作用，但這些研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段[19]。

外膜蛋白TolB 在不同菌株之間高度保守，它在維持菌株外膜的完整性方面起關(guān)鍵作用，是制備亞單位疫苗的理想抗原[20，21]。KHAN 等[22]通過針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌疫苗開發(fā)的基因組學(xué)與反向疫苗學(xué)發(fā)掘到TolB 蛋白等3 個(gè)靶向蛋白可以作為潛在疫苗靶點(diǎn)。外膜蛋白TolB 作為一種候選疫苗，具有參與代謝途徑簡(jiǎn)單、與其他蛋白質(zhì)相互作用緊密、與人類微生物菌群蛋白相似度低且有較高抗原性的特點(diǎn)。本研究分析了嗜水氣單胞菌TolB 蛋白的理化特性，發(fā)現(xiàn)TolB 蛋白是一個(gè)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的親水性外膜蛋白。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，TolB 蛋白具有多個(gè)可以形成表位的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果都與嗜肺軍團(tuán)菌外膜蛋白TolB 的生物信息學(xué)分析結(jié)果極為相近。可見，嗜水氣單胞菌TolB 蛋白也極有可能是一種潛在的候選疫苗。

生物信息學(xué)是隨著人類基因組計(jì)劃的發(fā)展而出現(xiàn)的一門新學(xué)科，現(xiàn)已成為基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具[23]。通過分析氨基酸序列、基本理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、三維結(jié)構(gòu)和抗原性，能夠篩選出潛在的抗原表位，從而加快疫苗的研究，避免浪費(fèi)的重復(fù)工作和無效的試驗(yàn)過程[24]。生物信息學(xué)因其高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、蛋白質(zhì)功能研究和抗原表位預(yù)測(cè)等領(lǐng)域。SONG 等[12]利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）TolB 蛋白的結(jié)構(gòu)，表明TolB 是一種親水性好、可塑性強(qiáng)、可及性高、抗原性指數(shù)高、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞表位多的潛在的疫苗抗原。對(duì)4 株鮑曼不動(dòng)桿菌的tolb基因片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，TolB 蛋白的相似性為96.2%。前人對(duì)TolB氨基酸序列上的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位進(jìn)行了篩選和重組，設(shè)計(jì)了1個(gè)優(yōu)秀的表位，并驗(yàn)證了免疫效果[9，25]。本研究利用生物信息學(xué)軟件分析了TolB 蛋白的基本理化性質(zhì)和翻譯后修飾及二維和三維結(jié)構(gòu)，利用專用的預(yù)測(cè)軟件對(duì)TolB 蛋白潛在的B 細(xì)胞表位和T 細(xì)胞表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，表明TolB 蛋白具有豐富的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞抗原表位，可以開發(fā)成為診斷及治療嗜水氣單胞菌感染的新型表位疫苗。