吉栗漫，譚顯東，喬翅嵩，魏 琨，陳 楠

（成都信息工程大學，四川 成都 610225）

漆酶是一種多功能的含銅氧化還原酶［1-2］，在自然界中分布于多種植物［3］、真菌［4-5］、細菌［6-7］和少數昆蟲中，它能催化多種芳香族化合物發(fā)生氧化反應，在反應中分子氧作為電子受體被還原成水。目前，漆酶可分為真菌漆酶、細菌漆酶和植物漆酶。其中，真菌漆酶具有更好的熱穩(wěn)定性、金屬離子耐受性和更高的底物催化氧化性，在食品、制漿造紙、紡織工業(yè)以及環(huán)境保護領域有著廣泛的應用［8-11］。

三七渣是三七經乙醇提取有效成分三七皂苷后產生的殘渣，其中含有大量的粗纖維、粗多糖、淀粉、粗蛋白、粗脂肪等有機物和磷、鈣、鎂等礦質元素以及一些微量元素［12］，可作為原料發(fā)酵用于生產蛋白飼料、生防制劑、紅色素、靈芝菌質等產品［13-16］。為了降低漆酶的生產成本，本研究以三七渣為基質，以金地靈芝為菌種固態(tài)發(fā)酵產漆酶，并通過響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，提高產酶效率，以期為其深入研究提供參考。

1 材料

1.1 藥材 三七渣購自成都市某中成藥廠，經過晾曬、粉碎、過篩等工藝后置于干燥器中保存，其主要成分為總糖48.87%、淀粉30.35%、粗纖維27.45%、粗蛋白12.28%、真蛋白9.97%、還原糖2.19%［17］。金地靈芝（審定編號川審菌2003008） 由四川省農業(yè)科學院土壤肥料研究所微生物室提供。

1.2 試劑 酵母浸出粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸銅、硫酸鎂、吐溫80、藜蘆醇、磷酸二氫鈉均為分析純，購自成都市科龍化工試劑廠； ABTS 為分析純，購自阿拉丁試劑（上海） 有限公司。

1.3 儀器 PYX-250H-C 恒溫恒濕培養(yǎng)箱購自韶關市科力實驗儀器有限公司； THZ-92A 氣浴恒溫振蕩器購自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司； BSA224S 電子分析天平購自賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司； WFJ7200 分光光度計購自尤尼柯（上海） 儀器有限公司； LDZX-50KB 高壓滅菌鍋購自上海申安醫(yī)療器械廠。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基培養(yǎng)

2.1.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （PDA） 培養(yǎng)基 取馬鈴薯20.00 g、葡萄糖2.00 g、酵母粉0.30 g、蛋白胨0.20 g、磷酸二氫鉀0.10 g、硫酸鎂0.06 g、瓊脂粉2.0 g，置于100 mL 蒸餾水中混勻，121 ℃滅菌30 min，即得。

2.1.2 種子液培養(yǎng)基 取馬鈴薯20.00 g、葡萄糖2.00 g、酵母粉0.30 g、蛋白胨0.20 g、磷酸二氫鉀0.10 g、硫酸鎂0.06 g，置于100 mL 蒸餾水中混勻，即得。

2.1.3 三七渣固體培養(yǎng)基 取三七渣10.0 g，過60 目篩，加入酵母浸出粉8%、硫酸銅0.07%、磷酸二氫鈉0.4%、硫酸鎂0.4%、吐溫80 0.05%、藜蘆醇0.025%、水60%，121 ℃滅菌30 min，即得。

2.2 種子液制備 將金地靈芝菌種接入PDA 培養(yǎng)基中，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)5～6 d，用打孔器在培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)皿邊緣打取0.25 cm2菌絲塊，接入裝有150 mL 種子液培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于氣浴恒溫振蕩器上，在180 r/min、28 ℃下培養(yǎng)6 d。

2.3 漆酶粗酶液制備 待培養(yǎng)結束后將發(fā)酵物剪碎，向錐形瓶中加入150 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，在40 ℃下水浴振蕩1 h，結束后用紗布過濾，濾液置于高速離心機中，5 000 r/min 離心15 min，離心后取上清液，即得。

2.4 漆酶活性測定 參照文獻［18-19］ 報道，采用ABTS法。將0.05 mL 漆酶粗酶液與1 mL 1 mmol/L ABTS、2.95 mL 緩沖液混合后加入試管中，35 ℃水浴3 min，在420 nm波長處測定吸光度，平行3 次，取平均值。

2.5 單因素試驗

2.5.1 發(fā)酵溫度 將金地靈芝種子液接入三七渣固體培養(yǎng)基的錐形瓶中進行恒溫培養(yǎng)，接種量20%，發(fā)酵時間13 d，裝樣量10.0 g，發(fā)酵溫度分別為24、26、28、30、32 ℃，按“2.4” 項下方法測定漆酶活性。由圖1 可知，發(fā)酵溫度為28 ℃時漆酶活性最高； 低于28 ℃時金地靈芝生長緩慢，產漆酶效果較差； 高于28 ℃時漆酶活性降低，這主要是因為固體發(fā)酵過程中的聚熱現象容易引起菌體死亡。Pablo等［20］研究發(fā)現，在28 ℃時以稻谷和農業(yè)殘余物固態(tài)發(fā)酵靈芝菌產漆酶酶活最高。

圖1 發(fā)酵溫度對漆酶活性的影響

2.5.2 接種量 將金地靈芝種子液接入三七渣固體培養(yǎng)基的錐形瓶中進行恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間13 d，裝樣量10.0 g，接種量分別為10%、15%、20%、25%、30%、35%，按“2.4” 項下方法測定漆酶活性。接種量大小會直接影響菌種在培養(yǎng)基中的發(fā)酵速度和產酶效率［21］。由圖2 可知，接種量為25% 時漆酶活性最高； 為10%時漆酶活性較低，這可能是因為接種量偏小致使菌絲量較少，漆酶的合成減少； 大于25%時漆酶活性隨接種量的增大而降低，說明過高的接種量不利于分泌漆酶，可能是接種量過大使培養(yǎng)基中生物量大，致使營養(yǎng)物質消耗過快，靈芝代謝提前進入衰亡期，漆酶活性隨之降低。

圖2 接種量對漆酶活性的影響

2.5.3 發(fā)酵時間 將金地靈芝種子液接入三七渣固體培養(yǎng)基的錐形瓶中進行恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵溫度28 ℃，接種量20%，裝樣量10.0 g，發(fā)酵時間分別為6、8、10、12、14、16、18、20 d，按“2.4” 項下方法測定漆酶活性。由圖3可知，發(fā)酵時間為12 d 時漆酶活性最高； 隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵體系中的微生物逐漸由適應期、對數生長期、穩(wěn)定期步入衰亡期，所以其代謝產物漆酶的酶活也隨之呈現先逐漸升高，而后又降低的趨勢，這是由于隨著發(fā)酵時間的增加，靈芝代謝產物在培養(yǎng)基中不斷積累，產生抑制作用，影響了漆酶的分泌［21］。

圖3 發(fā)酵時間對漆酶活性的影響

2.6 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗基礎上，以發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C） 為影響因素，漆酶活性（Y） 為評價指標，采用Design-Expert 8.0.6 軟件建立三因素三水平試驗，因素水平見表1，結果見表2。

表1 Box-Behnken 響應面法因素水平

表2 Box-Behnken 響應面法設計與結果

將表2 數據導入Design-Expert 8.0.6 軟件進行多元二次回歸擬合，得方程為Y＝3.35-0.016A＋0.11B＋0.36C-0.11AB＋0.095AC＋0.081BC-0.47A2-0.28B2-0.11C2，方差分析見表3。由此可知，接種量和發(fā)酵時間對漆酶活性的影響極顯著（P＜0.01），發(fā)酵溫度不顯著（P＞0.05）；F值越大，對響應值的影響越大［22-23］，各因素影響程度依次為發(fā)酵時間（C） ＞接種量（B） ＞發(fā)酵溫度（A）； 模型P＜0.000 1，具有高度顯著性； 失擬項P＝0.228 6，表明模型擬合度較高，誤差較小，可用于預測分析； 因素AB、AC、BC、A2、B2、C2對漆酶活性影響呈極顯著程度（P＜0.01）。

表3 Box-Behnken 響應面法方差分析結果

響應面分析見圖4。參考文獻［24-26］ 報道，當發(fā)酵時間固定時，隨著接種量的增加和發(fā)酵溫度的升高，漆酶活性呈現先升高后降低的趨勢，等高線圖呈橢圓形且響應面呈凸形，表明發(fā)酵溫度和接種量有較顯著的交互作用；當接種量固定時隨著發(fā)酵時間的延長，漆酶活性呈現逐漸升高的趨勢，而隨著發(fā)酵溫度的升高，漆酶活性呈現先升高后降低的趨勢； 當發(fā)酵溫度固定時，接種量和發(fā)酵時間存在極顯著的交互作用，而隨著發(fā)酵時間和接種量的增加，漆酶活性呈現逐漸升高的趨勢。

圖4 各因素響應面圖

3 結論

最佳條件為發(fā)酵時間14 d，發(fā)酵溫度28.09 ℃，接種量26.65%，在此條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)時漆酶活性為3.644 U/g。因此表明，利用響應面法優(yōu)化靈芝固態(tài)發(fā)酵三七渣非常有效，可為后續(xù)三七渣固態(tài)發(fā)酵的工業(yè)化提供基礎依據。