張東方，魯曉光

（南陽(yáng)市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河南 南陽(yáng) 473000）

健肝樂(lè)顆粒源于東漢張仲景《傷寒論·太陽(yáng)篇》，由白芍、甘草組成，為經(jīng)典名方發(fā)展而來(lái)的現(xiàn)代制劑。該組方具有養(yǎng)血護(hù)肝，解毒止痛的功效。具有降低轉(zhuǎn)氨酶，消褪黃疸以及改善各類肝炎臨床癥狀的作用，臨床用于治療急慢性病毒性肝炎?，F(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［1］中無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，無(wú)法滿足中藥現(xiàn)代化的發(fā)展需求。目前，該復(fù)方制劑研究主要集中在臨床方面［2-5］，其質(zhì)量控制研究［6］較少。且目前尚未見有關(guān)健肝樂(lè)顆粒指紋圖譜及化學(xué)模式識(shí)別的研究報(bào)道。在查閱文獻(xiàn)［7-14］ 的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)該制劑雖然只有2 味藥材，但化學(xué)成分多而復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)以中藥指紋圖譜結(jié)合聚類分析（HCA） 方法、主成分分析法（PCA） 以及正交偏最小二乘判別分析法（OPLS-DA） 將指紋圖譜提供的信息進(jìn)行再評(píng)價(jià)。再根據(jù)不同入血成分保肝作用強(qiáng)弱不同，再經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選，選取芍藥中沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷，甘草中甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨作為指標(biāo)成分，以期為提高健肝樂(lè)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，為優(yōu)化生產(chǎn)工藝達(dá)到藥效最佳提供基礎(chǔ)。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；BP211D 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）； WT-1200 型超聲波清洗器（濟(jì)寧萬(wàn)通超聲儀器設(shè)備廠）。異甘草苷（批號(hào)17042102，純度98%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)19121705，純度99.28%）、芹糖甘草苷（批號(hào)20081705，純度98%）對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司）； 芍藥苷（批號(hào)110736-201539，純度96.4%）、甘草酸銨 （批號(hào)110731-202021，純度96.2%）、沒食子酸 （批號(hào)110831-200803，純度 90.1%）、甘草苷 （ 批號(hào) 111610-201908，純度92.0%） 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。健肝樂(lè)顆粒購(gòu)于武漢康樂(lè)藥業(yè)有限公司，批號(hào)1322014、1323014、1322004、1323003、1323002、1322008、1220037、1222036、1222035、1222061、1322013、1322008、1323001、1323002、1220035、1220034，編號(hào)S1 ～S16，其中S1 ～S6、S11 ～S14 規(guī)格為15 g/袋，含蔗糖； S7 ～S10、S15～S16 規(guī)格為6 g/袋，無(wú)蔗糖。白芍、甘草購(gòu)于市場(chǎng)，經(jīng)南陽(yáng)市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心魯曉光副主任藥師鑒定為正品。甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)GIOVINI Chemical 公司）； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Welchrom C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.3%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～10 min，10% ～20% A； 10 ～22 min，20% A； 22 ～35 min，20% ～40%A； 35～50 min，40%A）； 體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，甲醇溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為25.21、24.71、92.84、11.86、12.69、3.74、46.95 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，混勻研細(xì)，精密稱取0.5 g （S7～S10 各取0.2 g），精密加入25 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按處方和工藝，分別制備缺白芍、缺甘草的陰性樣品，按 “2.2.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取本品（S1） 適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得各成分相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積（以峰8甘草苷為參照） RSD 均小于1.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（S1） 適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積（以峰8 為參照） RSD 均小于1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品（S1） 適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積 （以峰8 為參照） RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立

2.4.1 圖譜生成 取16 批樣品，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012） ”，設(shè)置S1為參照，時(shí)間窗寬度為0.3 min，生成方法為中位數(shù)法，全峰匹配結(jié)合多點(diǎn)校正，得到共有指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R），見圖1A。通過(guò)與對(duì)照品色譜圖（圖1B） 比對(duì)，確認(rèn)峰1 為沒食子酸，峰4 為芍藥內(nèi)酯苷，峰5 為芍藥苷，峰7 為芹糖甘草苷，峰8 為甘草苷，峰15 為異甘草苷，峰20 為甘草酸銨，并選取分離度好、峰面積穩(wěn)定、保留時(shí)間適宜的甘草苷（峰8） 作為參照峰。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.4.2 色譜峰歸屬 依據(jù)單味藥材、對(duì)照品溶液的紫外光譜信息和保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖1C～1D。由此可知，色譜峰1～5、9～10 歸屬于白芍，6～8、11～21 歸屬于甘草。

2.4.3 相似度評(píng)價(jià) 16 批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.986、0.985、0.996、0.996、0.995、0.996、0.974、0.992、0.991、0.989、0.985、0.985、0.997、0.997、0.985、0.992，表明不同批次、工藝樣品成分組成基本一致，質(zhì)量均一性良好。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1 聚類分析 （HCA） 采用SPSS 26.0 軟件，以Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)組間對(duì)比法，以16 批樣品共有峰峰面積與相對(duì)峰面積為變量進(jìn)行系統(tǒng)聚類［15-20］，結(jié)果見圖2。由此可知，以共有峰面積為變量時(shí)，16 批樣品聚為2 類，S1 ～S6、S8、S9、S11 ～S14、S16 為一類，S7、S10、S15 為一類，表明它們?cè)诔煞趾可险w一致，但也具有一定的差異性，可能與生產(chǎn)工藝、投料量不同有關(guān)，但總體上不大； 以相對(duì)峰面積為變量時(shí)，16 批樣品可聚為2 類，S1～S5、S7～S16 為一類，S6 為一類。綜上所述，不同批次、規(guī)格、劑型樣品成分組成相似度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

圖2 16 批健肝樂(lè)顆粒聚類分析圖

2.5.2 主成分分析（PCA） 采用SIMCA 14.0 軟件對(duì)16批樣品共有峰峰面積進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果見圖3A。由此可知，21 個(gè)共有峰分成4 個(gè)主成分，16 批樣品分為2 類，S1～S6、S11～S14 為一類，S7～S10、S15～S16 為一類。

圖3 16 批健肝樂(lè)顆粒OPLS-DA 分析圖

2.5.3 正交偏最小二乘判別分析 （OPLS-DA） 采用SIMCA 14.0 軟件對(duì)16 批樣品進(jìn)行OPLS-DA 分析，結(jié)果見圖3。由此可知，VIP 大于1 的成分有11 種，峰號(hào)分別為5～9、11、13、15、16、18、21；R2Y為0.992，Q2為0.977，均不小于0.50，表明模型穩(wěn)定性、預(yù)測(cè)性良好［19-23］； 經(jīng)200 次置換檢驗(yàn)后Q2回歸線與縱軸的相交點(diǎn)小于零，表明模型不存在過(guò)擬合，可用于預(yù)測(cè)分析。

2.5.4 指標(biāo)成分篩選 中藥質(zhì)量標(biāo)志物［21］（Q-marker） 可反映中藥安全性和有效性，并能進(jìn)行定性定量分析。研究中藥質(zhì)量標(biāo)志物可提高質(zhì)量一致性、可控性和溯源性，更好地控制中藥生產(chǎn)過(guò)程、進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)管。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)［7-14］ 報(bào)道及上述結(jié)果，確定沒食子酸（峰1）、芍藥內(nèi)酯苷（峰4）、芍藥苷（峰5）、芹糖甘草苷（峰7）、甘草苷（峰8）、異甘草苷（峰15）、甘草酸銨（峰20） 作為指標(biāo)成分。

2.6 指標(biāo)成分含量測(cè)定 采用HPLC 法。

2.6.1 溶液制備 同“2.2” 項(xiàng)。

2.6.2 色譜條件 同“2.1” 項(xiàng)。

2.6.3 系統(tǒng)適用性考察和專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品（S1）、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各指標(biāo)成分分離度符合要求，理論塔板數(shù)均大于4 000，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.6.4 線性關(guān)系考察 分別取對(duì)照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各指標(biāo)成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各指標(biāo)成分線性關(guān)系

2.6.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD 分別為1.8%、1.6%、1.0%、0.41%、0.92%、1.8%、1.2%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（S1），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨峰面積RSD 分別為2.0%、0.82%、1.4%、1.3%、1.1%、2.0%、2.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液（S1） 6 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨含量RSD 分別為1.5%、1.4%、0.9%、2.0%、0.9%、0.5%、1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的樣品（S1） 0.25 g，共6 份，加入對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨平均加樣回收率分別為98.41%、97.51%、96.13%、95.59%、96.16%、97.62%、98.09%，RSD 分別為2.0%、1.9%、1.3%、1.6%、1.1%、1.1%、1.1%。

2.6.9 測(cè)定方法 取出16 批樣品內(nèi)容物，混勻后研細(xì)，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 各指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/袋，n＝3）

3 討論

3.1 提取方法選擇 先進(jìn)行了提取溶劑的篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在甲醇溶液中，待測(cè)成分提取較充分。進(jìn)一步考察提取方式，分別比較了加熱回流30、120、150 min 及超聲處理30、40、60、90 min，結(jié)果顯示甲醇超聲處理30 min 時(shí)目標(biāo)成分有效溶出。

3.2 色譜條件考察 考察了不同流動(dòng)相，包括乙腈-水、甲醇-0.3%磷酸、乙腈-0.3% 磷酸、乙腈-0.3% 甲酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.3%磷酸梯度洗脫時(shí)分離效果良好，保留時(shí)間適宜，色譜峰峰形佳。通過(guò)紫外掃描，發(fā)現(xiàn)7 種成分分別在258、230、360 nm 處得到最大吸收，230 nm 處7 種成分均有較強(qiáng)的紫外吸收，且基線最穩(wěn)定。通過(guò)與文獻(xiàn)［22-26］ 及本實(shí)驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)切換法和230 nm 單波長(zhǎng)測(cè)出的結(jié)果差異不大，考慮到基線穩(wěn)定性和重復(fù)性，選擇230 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 指紋圖譜在復(fù)方中藥制劑分析中的應(yīng)用及其作用 中藥質(zhì)量影響因素包括植物種屬、采收期、栽培區(qū)域、貯藏條件、加工工藝等，進(jìn)而造成成分差異，使其藥理活性及臨床應(yīng)用也存在差異，并使中藥質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)成為復(fù)雜難題。指紋圖譜能夠與中醫(yī)“整體” 的傳統(tǒng)理論呼應(yīng)，將多指標(biāo)成分定量法與指紋圖譜結(jié)合，同時(shí)提供定性和定量信息，將是一種更適合、更有吸引力的用于復(fù)方中藥制劑的分析方法，能更好地揭示不同廠家批次間中藥制劑的細(xì)微差異。

在指標(biāo)成分篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該色譜系統(tǒng)還可同時(shí)分離測(cè)定芍藥、甘草中另外幾種具有保肝作用的指標(biāo)成分丹皮酚、槲皮素、異鼠李素，但在該制劑中含量過(guò)低，暫不進(jìn)行定量研究。中藥現(xiàn)代化的發(fā)展離不開對(duì)有效成分量效關(guān)系的深入研究，經(jīng)典名方尤其應(yīng)注重多組分的含量研究，以改進(jìn)生產(chǎn)工藝，使制劑療效達(dá)到最佳。