葉莉瑩，潘廣輝，趙 平，王澤鵬，柳 成，李穎穎，張法榮*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250012； 3.泰安市中醫(yī)院，山東 泰安 271000； 4.北大醫(yī)療淄博醫(yī)院，山東 淄博 255000）

慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF） 是一種腎功能進(jìn)行性減退直至衰竭的臨床綜合征，病情危重，病死率高，嚴(yán)重威脅患者生命健康［1-2］。腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF） 是各種原因引起的CRF 進(jìn)展為終末期腎衰的共同途徑［3］。胰島素樣生長因子-1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1） 是重要的促生長因子，在腎小管以及腎小球上均有IGF-1 受體（IGF-1R） 的表達(dá)，IGF-1 能夠刺激各種腎臟細(xì)胞生長，與纖維化密切相關(guān)［4］。目前臨床治療CRF 以腹膜透析等為主［5］，但隨著透析時間延長，患者代謝紊亂、微炎癥狀態(tài)隨之加重，給預(yù)后帶來嚴(yán)重影響［6］。因此，臨床迫切需要安全有效的藥物來防治CRF 腎纖維化的進(jìn)展。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為CRF 屬本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛為脾腎虧虛，標(biāo)實(shí)為濕濁、血瘀，需以健脾補(bǔ)腎、活血化瘀、解毒化濕之法治之［7］。黑地黃丸出自劉完素《素問病機(jī)氣宜保命集》，由熟地黃、蒼術(shù)、干姜、大棗4 味中藥組成，具有補(bǔ)腎健脾、燥濕化濁之效［8-9］。課題組前期研究證實(shí)黑地黃丸能夠延緩CRF 進(jìn)展，且發(fā)現(xiàn)CRF 大鼠血清IGF-1 變化明顯［10］?；诖耍緦?shí)驗(yàn)重點(diǎn)探究黑地黃丸對CRF大鼠腎纖維化的影響以及IGF-1 在其中的作用，以期為黑地黃丸臨床研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（180±20） g，由北京維通利華動物技術(shù)有限公司提供［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （京） 2016-0006］，飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度（24±2）℃，相對濕度（60±5）%，12 h/12 h光/暗循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)過程中所有操作均符合山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動物倫理原則（倫理號AWE-2019-015）。

1.2 藥物 黑地黃丸由熟地黃32 g、蒼術(shù)32 g、干姜2 g、大棗34 g 組成，中藥飲片購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，經(jīng)該院中藥師谷明舉主任鑒定為正品，在本院煎藥室進(jìn)行藥物制備。將4 味藥加10 倍量水浸泡30 min，煎煮2 次，每次2 h，紗布過濾后合并濾液，濃縮至最終質(zhì)量濃度為1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 IGF-1R 阻斷劑JB1 （貨號T6017） 購自上海陶術(shù)生物科技有限公司； BCA 蛋白定量試劑盒（貨號P0010） 購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司； TGF-β （貨號ab215715）、GAPDH （貨號ab181602） 抗體均購自英國Abcam 公司； IGF-1R 抗體（貨號20254-1-AP）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG （貨號20536-1-AP） 均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司； α-SMA 抗體 （貨號GB11364）、HIF-1α 抗體（貨號GB13031）、免疫組化試劑盒DAB 顯色劑（貨號G1211） 均購自武漢賽維爾生物科技有限公司； ECL 發(fā)光試劑盒（貨號MA0186）、組織固定液（貨號MA0192） 均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司； 快速RNA 提取試劑盒 （貨號AC0202）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （貨號AG0304）、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Realtime PCR） 試劑（貨號AH0104） 均購自青島浩賽科技股份有限公司。

1.4 儀器 BX53 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）； 5404 離心機(jī) （ 德國 Eppendorf 公司）；RM2235 切片機(jī)（德國Leica 公司）； FluorChemQ顯影儀（美國Protein-Simple 公司）； 5424R 型低速離心機(jī)（美國Thermo Fisher 公司）； DK-8D 型電熱恒溫水浴鍋 （上海比朗儀器制造有限公司）；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）； SIM-F124 制冰機(jī)（日本SANYO公司）； CascadaI 型純化水系統(tǒng)（美國PALL 公司），Axiovert40 型倒置顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司）。

2 方法

2.1 CRF 大鼠模型的建立 60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)取12 只大鼠作為空白組，剩余大鼠采用5/6 腎切除法復(fù)制CRF 模型［11］。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg） 麻醉，俯臥位固定，常規(guī)消毒皮膚，暴露右腎，剝離腎被膜，結(jié)扎腎門，切除右腎（保留腎上腺），逐層縫合皮膚。第1 次手術(shù)后10 d，同樣方法麻醉后切除左腎上、下極腎實(shí)質(zhì)，以明膠海綿壓迫止血，關(guān)閉腹腔。各組大鼠于第2 次術(shù)后4 周，斷尾取血，并檢測血清中肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN） 水平，以Scr、BUN 水平較空白組均顯著升高表明模型復(fù)制成功［12］（本實(shí)驗(yàn)共剔除死亡和未成模大鼠8 只）。

2.2 分組及給藥 將造模成功的大鼠隨機(jī)分成模型組（14 只）、黑地黃丸組（13 只） 及黑地黃丸＋JB1 組（13 只），另設(shè)空白組（12 只）。根據(jù)體表面積法換算等效劑量，黑地黃丸組大鼠每天皮下注射生理鹽水； 黑地黃丸＋JB1 組大鼠每天9： 00 皮下注射18 ng/g IGF-1R 阻斷劑JB1 （50 ng/μL），連續(xù)7 d。注射7 d 后，黑地黃丸組和黑地黃丸＋JB1 組大鼠均灌胃給予10.43 g/kg 黑地黃丸藥液，空白組和模型組均灌胃給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)8 周。

2.3 大鼠腎功能檢測 給藥8 周后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg） 麻醉，腹主動脈取血，靜置30 min 后離心取血清，于-80 ℃冰箱保存。采用全自動生化分析儀檢測血清Scr、BUN 水平。

2.4 腎組織病理學(xué)觀察 將殘余腎臟沿腎蒂剪下，以10%多聚甲醛溶液固定后，流水沖洗過夜，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，展片，烤片，再進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE） 和馬松（Masson） 染色。HE 染色切片在光鏡下觀察腎臟組織的改變；Masson 染色切片在光學(xué)顯微鏡下觀察腎纖維化改變。在200 倍鏡下隨機(jī)選取10 個不同視野，將呈現(xiàn)為藍(lán)色區(qū)域的膠原纖維作為陽性目標(biāo)，以陽性區(qū)域面積與整個視野總面積的比值為腎纖維化指數(shù)。采用Image Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行半定量分析。

磨礦是選礦過程中的一個重要環(huán)節(jié)，尤其是對硫化礦來說，磨礦會使其礦漿性質(zhì)(如礦漿電位、pH)產(chǎn)生較大的改變[1]，這些改變對浮選回收率起著至關(guān)重要的作用。因此，磨礦對方鉛礦礦漿電位及浮選行為影響的研究十分必要。

2.5 免疫組化法檢測腎組織TGF-β、HIF-1α、α-SMA 蛋白表達(dá) 腎組織石蠟切片采用免疫組織化學(xué)染色測定腎小管間質(zhì)TGF-β、HIF-1α、α-SMA蛋白表達(dá)。

2.6 Western blot 法檢測腎組織IGF-1R、TGF-β 蛋白表達(dá) 取腎組織，在冰上用RIPA 細(xì)胞裂解液裂解，提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液煮沸10 min 進(jìn)行變性。取40 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF） 膜上，用50 g/L 脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后采用電化學(xué)發(fā)光（ECL） 法使蛋白條帶顯色，以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 分析軟件對各組條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2.7 RT-qPCR 法檢測腎組織IGF-1R、TGF-βmRNA表達(dá) 收集各組腎組織后，使用快速RNA 提取試劑盒提取腎組織總RNA，按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，采用RT-qPCR 系統(tǒng)檢測關(guān)鍵靶點(diǎn)IGF-1R和TGF-β的表達(dá)。PCR 擴(kuò)增以GAPDH為內(nèi)照，引物序列見表1。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40 次。PCR 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次3 個復(fù)孔，根據(jù)RT-qPCR 原始數(shù)據(jù)CT值，以2-ΔΔCT法分析樣本的相對表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著性差異法（LSD）。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CRF 造模后大鼠腎功能指標(biāo)比較 以血清Scr、BUN 水平為指標(biāo)，通過對比造模前后指標(biāo)變化，評價CRF 模型是否建立成功。如表2 所示，與空白組比較，CRF 造模組大鼠血清Scr、BUN 水平均升高（P＜0.05），表明大鼠CRF 模型復(fù)制成功。

表2 造模后大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）Tab.2 Comparison of renal function indexes levels in rats after modeling （±s）

表2 造模后大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）Tab.2 Comparison of renal function indexes levels in rats after modeling （±s）

注： 與空白組比較，＃P＜0.05。

組別動物數(shù)/只Scr/（μmol·L-1）BUN/（mmol·L-1）空白組1220.00±0.126.92±0.72造模組4038.29±14.58＃12.81±4.91＃

3.2 黑地黃丸對CRF 大鼠血清Scr、BUN 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清Scr、BUN水平升高（P＜0.05），表明模型組大鼠腎功能衰退； 與模型組比較，黑地黃丸組大鼠血清Scr、BUN 水平降低（P＜0.05），黑地黃丸＋JB1 組大鼠血清BUN 水平降低（P＜0.05），Scr 水平無明顯變化（P＞0.05），見表3。結(jié)果表明，連續(xù)給藥8 周后，CRF 大鼠腎功能好轉(zhuǎn)，而此效應(yīng)被JB1 減弱。

表3 黑地黃丸對CRF 大鼠血清Scr、BUN 水平的影響（±s）Tab.3 Effects of Heidihuang Pills on serum Scr and BUN levels in CRF rats （±s）

表3 黑地黃丸對CRF 大鼠血清Scr、BUN 水平的影響（±s）Tab.3 Effects of Heidihuang Pills on serum Scr and BUN levels in CRF rats （±s）

注： 與空白組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別動物數(shù)/只 Scr/（μmol·L-1） BUN/（mmol·L-1）空白組1223.00±2.659.57±0.69模型組1459.67±12.70＃16.30±0.80＃黑地黃丸組1341.67±2.52*11.94±0.06*黑地黃丸＋JB1 組1348.00±10.4414.00±1.50*

圖1 各組大鼠腎組織HE 染色（×200）Fig.1 HE staining of rat renal tissue for each group （×200）

圖2 各組大鼠腎組織Masson 染色（×200）Fig.2 Masson staining of rat renal tissue for each group （×200）

表4 黑地黃丸對CRF 大鼠腎臟纖維化的影響（±s，n ＝6）Tab.4 Effects of Heidihuang Pills on renal fibrosis in CRF rats （±s，n＝6）

表4 黑地黃丸對CRF 大鼠腎臟纖維化的影響（±s，n ＝6）Tab.4 Effects of Heidihuang Pills on renal fibrosis in CRF rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別纖維化陽性面積占比/%空白組5.43±0.63模型組25.25±3.02＃黑地黃丸組16.15±1.20*黑地黃丸＋JB1 組18.39±1.03*

3.4 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織TGF-β、α-SMA、HIF-1α 蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β、α-SMA、HIF-1α 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）； 與模型組比較，黑地黃丸組和黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織TGF-β、α-SMA、HIF-1α 蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）； 與黑地黃丸組比較，黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織TGFβ、α-SMA 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。結(jié)果表明，黑地黃丸可以下調(diào)CRF 大鼠腎組織中TGF-β、α-SMA 及HIF-1α 蛋白表達(dá)，而此效應(yīng)會被IGF-1R阻斷劑JB1 所抑制。

圖3 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織TGF-β、α-SMA、HIF-1α 蛋白表達(dá)的影響（×200，±s，n＝3）Fig.3 Effects of Heidihuang Pills on the renal protein expressions of TGF-β，α-SMA and HIF-1α in CRF rats （×200，±s，n＝3）

3.5 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-β蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織IGF-1R 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），TGF-β 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，黑地黃丸組和黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織IGF-1R蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），TGF-β 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 與黑地黃丸組比較，黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織IGF-1R 表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，黑地黃丸可以上調(diào)CRF 大鼠腎組織IGF-1R 蛋白表達(dá)，下調(diào)TGF-β 蛋白表達(dá)，而聯(lián)用JB1 后，可減弱黑地黃丸對腎組織IGF-1R、TGF-β 的調(diào)控作用。

圖4 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-β 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.4 Effects of Heidihuang Pills on the renal protein expressions of IGF-1R and TGF-β in CRF rats （±s，n＝3）

3.6 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-βmRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織IGF-1RmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），TGF-βmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）； 與模型組比較，黑地黃丸組和黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織IGF-1RmRNA 表達(dá)均升高（P＜0.05），TGF-βmRNA 表達(dá)均降低（P＜0.05）； 與黑地黃丸組比較，黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織IGF-1RmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），而TGF-βmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），見表5。結(jié)果表明，黑地黃丸能夠上調(diào)CRF 大鼠腎組織IGF-1RmRNA 表達(dá)，抑制TGF-βmRNA 表達(dá)，而聯(lián)用JB1 后，黑地黃丸對腎組織IGF-1R、TGF-βmRNA 表達(dá)的調(diào)控作用被抑制。

表5 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-β mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝3）Tab.5 Effects of Heidihuang Pills on the renal mRNA expressions of IGF-1R and TGF-β in CRF rats（±s，n＝3）

表5 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-β mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝3）Tab.5 Effects of Heidihuang Pills on the renal mRNA expressions of IGF-1R and TGF-β in CRF rats（±s，n＝3）

注： 與空白組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05； 與黑地黃丸組比較，▲P＜0.05。

組別IGF-1R mRNATGF-β mRNA空白組1.00±0.001.00±0.00模型組0.32±0.12＃1.94±0.76＃黑地黃丸組0.95±0.41*1.18±0.33*黑地黃丸＋JB1 組0.77±0.36*▲1.52±0.67*▲

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為CRF 應(yīng)歸于“腎勞” “癃閉” “水腫” 等范疇，其病程纏綿，且反復(fù)發(fā)作，根本病機(jī)當(dāng)屬于脾腎虧虛，濕濁血瘀之證。黑地黃丸是針對CRF 病機(jī)特點(diǎn)而設(shè)制劑，主治脾腎不足證。課題組前期研究表明，黑地黃丸能夠通過調(diào)控氧化應(yīng)激、微炎癥狀態(tài)以及鈣磷代謝等途徑提高大鼠腎功能，延緩CRF 進(jìn)展［13-15］，證實(shí)了黑地黃丸在CRF中具有一定的治療潛力。

RIF 的病理改變主要為腎單位的進(jìn)行性破壞，同時伴有大量成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生堆積導(dǎo)致腎小球硬化，從而加重RIF，最終引起CRF［16］。因此，抑制RIF 的發(fā)展，對CRF 的治療有十分重要的意義。研究表明，TGF-β 是公認(rèn)的體現(xiàn)腎纖維化的特效性指標(biāo)，α-SMA 也被作為早期纖維化的標(biāo)志，而HIF-1α 在RIF 的發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用，三者是腎間質(zhì)纖維化的重要指標(biāo)［17-19］。本研究通過5/6 腎切除構(gòu)建CRF 大鼠模型，結(jié)果顯示，CRF 大鼠Scr、BUN 水平升高，腎組織出現(xiàn)纖維化，TGF-β、α-SMA 和HIF-1α 表達(dá)升高； 使用黑地黃丸干預(yù)后，可以有效調(diào)節(jié)上述指標(biāo)，改善CRF 大鼠腎功能。

IGF-1 是一類促進(jìn)細(xì)胞生長，抑制細(xì)胞凋亡，具有胰島素樣代謝效應(yīng)的因子，能夠刺激各種腎臟細(xì)胞生長，進(jìn)而對腎損傷大鼠腎小管上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用［20］。有研究報(bào)道，IGF-1 的缺失會導(dǎo)致高血壓小鼠進(jìn)一步加重左室功能障礙和腎功能損傷［21］； 注射IGF-1 后能夠下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞凋亡達(dá)38%，下調(diào)腎間質(zhì)膠原沉積達(dá)44%，因此，IGF-1 是重要的腎臟保護(hù)性因子［22］。但也有學(xué)者持有不同的觀點(diǎn)，目前兩者的關(guān)系存在爭議［23］，IGF-1 在腎臟疾病發(fā)展過程中的作用及機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠腎小管間質(zhì)僅少量表達(dá)HIF-1α、α-SMA 及TGF-β，而模型組大鼠腎小管間質(zhì)中上述指標(biāo)表達(dá)增多且與腎功能下降相平行； 同時發(fā)現(xiàn)IGF-1 表達(dá)增加和HIF-1α、α-SMA 及TGF-β 的表達(dá)成反比，使用IGF-1R 抑制劑并沒有使HIF-1α、α-SMA 及TGF-β 蛋白表達(dá)下調(diào)，且IGF-1 表達(dá)量與腎間質(zhì)纖維化成反比，提示IGF-1 可能對損傷的腎上皮細(xì)胞起到了保護(hù)作用。其中黑地黃丸組IGF-1 表達(dá)升高，HIF-1α、α-SMA及TGF-β 表達(dá)均降低且與腎臟纖維化程度相平行，表明黑地黃丸能夠調(diào)控IGF-1 因子發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。黑地黃丸是否能夠調(diào)控其他作用途徑改善腎纖維化，將是本課題將來探索的新方向。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建CRF 模型探究黑地黃丸對腎纖維化的影響，結(jié)果顯示黑地黃丸能夠通過上調(diào)IGF-1 表達(dá)，促進(jìn)IGF-1 與IGF-1R 受體相結(jié)合，激活I(lǐng)GF-1 通路，抑制腎纖維化，緩解CRF 腎損傷。該結(jié)果初步證實(shí)了黑地黃丸在CRF中的治療作用，為后期臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。