王 志，侯 強(qiáng)，冉 崢，楊建華*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017）

據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)，目前全世界大約有15% 的育齡夫婦患不孕不育癥，由男方原因所致的不育癥比例超過(guò)50%［1］。近年來(lái)，受環(huán)境污染、社會(huì)壓力增加等因素的影響，不育癥的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)［2］。不育癥病因復(fù)雜，目前其發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)不育癥的治療主要為經(jīng)驗(yàn)性藥物治療、手術(shù)以及輔助生殖技術(shù)，但療效不確定，且費(fèi)用昂貴［3］。

毛蕊花糖苷是列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物的活性成分中含量最高的苯乙醇苷類單體化合物［4］。2020 年版《中國(guó)藥典》 收載毛蕊花糖苷為控制肉蓯蓉藥材質(zhì)量的指標(biāo)成分［5］。肉蓯蓉作為歷代補(bǔ)腎壯陽(yáng)類處方中使用頻度最高的補(bǔ)益藥物，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血等功效［6］。臨床實(shí)驗(yàn)表明，以肉蓯蓉為君藥的名老中醫(yī)驗(yàn)方可重建生殖內(nèi)分泌環(huán)境的平衡，促進(jìn)精子質(zhì)量的提高［7］。研究顯示，肉蓯蓉苯乙醇苷能改善大鼠生殖功能指標(biāo)［8］。但目前尚未見(jiàn)有關(guān)毛蕊花糖苷對(duì)生殖功能改善作用的研究報(bào)道。因此，本研究擬建立腺嘌呤誘導(dǎo)的不育癥大鼠模型，以毛蕊花糖苷給藥干預(yù)，觀察其對(duì)不育癥大鼠生殖功能的改善效果，并初步探討可能的作用機(jī)制，以期為毛蕊花糖苷治療不育癥的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量（250±20） g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （新） 2021-0003］，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 屏障環(huán)境［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （新） 2021-0002］，環(huán)境溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度40% ～70%，每天晝夜交替，光照時(shí)間12 h，自由進(jìn)食和飲水，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)依照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代、減少、優(yōu)化的原則進(jìn)行操作，符合動(dòng)物倫理原則，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)20210301-180。

1.2 藥物 毛蕊花糖苷（湖南青純科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)516V079）； 復(fù)方玄駒膠囊（浙江施強(qiáng)制藥有限公司，批號(hào)20201126）。

1.3 試劑 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） （上海麥克林生化科技股份有限公司，批號(hào)2019010）； 腺嘌呤、BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)J05D10104855、2307001）； 睪酮（testosterone，T）、促黃體生成素 （luteinizing hormone，LH）、促卵泡激素 （follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH） ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào) 8LDB6IPQ9C、FRSF2TX2IP、YXTDI1VCB3）； 促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH） ELISA試劑盒 （美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)WXBB7889V）；4%組織細(xì)胞固定液、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-B（ microtubule-associatedproteinlightchain3-B，LC3B）、UNC-51 樣激酶1 （ULK1） 多克隆抗體（北京博奧森生物科技有限公司，批號(hào)BA02198228、BA09153033、AB10234578）； SDSPAGE 凝膠制備試劑盒（北京博泰斯生物技術(shù)有限公司，批號(hào)6110207）； PVDF 膜（瑞士羅氏公司，批號(hào)69290400）； 兔抗哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR抗體 （美國(guó)CST 公司，批號(hào)2983S、5536S）；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol 試劑、甲醇（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，批號(hào) 91258333、98597501、DU644-US）； qPCR 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)027E2260IA）。

1.4 儀器 全波長(zhǎng)自動(dòng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢驗(yàn)測(cè)試儀、Sorvall ST 16R 型高速冷凍離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）； DWHL678 型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）； 光學(xué)顯微鏡（江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）； 細(xì)胞計(jì)數(shù)板（日本島津公司）； ME215S型分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； 包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）； 病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）； 脫色搖床（北京六一生物科技有限公司）； 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）； PURELAB Chorus 1 Complete 型超純水儀（英國(guó)Elga 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方玄駒膠囊） 和毛蕊花糖苷低、高劑量組（50、100 mg/kg），每組8 只，大鼠給藥量按人與大鼠體表面積等效換算［9］，空白組灌胃生理鹽水（10 mL/kg），其余各組每天灌胃150 mg/kg 腺嘌呤，連續(xù)灌胃14 d 后，用大鼠代謝籠收集尿液，并計(jì)算大鼠24 h 的進(jìn)食量和尿量； 與空白組比較，模型組大鼠食量減少，尿量增加，精子計(jì)數(shù)減少，血清T 水平降低，即表示造模成功。第15 天起，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予100 mg/kg 復(fù)方玄駒膠囊溶液，毛蕊花糖苷低、高劑量組灌胃給予50、100 mg/kg 毛蕊花糖苷，空白組和模型組灌胃給予等量生理鹽水（10 mL/kg），連續(xù)給藥28 d。

2.2 樣本采集 末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g） 進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈采血，全血4 ℃放置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min，留取血清，分裝后保存待檢； 取血完成后處死大鼠，迅速剖取肝臟、腎臟、睪丸和附睪組織，使用生理鹽水漂洗后稱重，計(jì)算各臟器指數(shù)。肝臟、腎臟和睪丸分成2 份，一份于4% 組織細(xì)胞固定液中固定，用于病理學(xué)染色，另一份液氮速凍后于-80 ℃保存，附睪只做精子檢查。

2.3 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察各組大鼠體質(zhì)量變化、飲食變化、排尿變化、活動(dòng)情況及精神狀況等。

2.4 精子情況檢測(cè)

2.4.1 精子計(jì)數(shù) 將附睪置于37 ℃生理鹽水中，剪開(kāi)附睪孵育5 min。精子可以通過(guò)輕輕搖晃或擠壓完全游出去，然后用普通光學(xué)顯微鏡觀察精子的活力。當(dāng)附睪中的精子完全游出后，用不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，反復(fù)多次，濾液以4 000 r/min 離心5 min，留取沉淀，將沉淀加入預(yù)先準(zhǔn)備的1 mL 精子固定液中充分?jǐn)嚢?。混合后，用?xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)精子進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.4.2 精子活動(dòng)率 計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板上活精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比，即為精子活動(dòng)率。

2.4.3 精子指數(shù) 精子計(jì)數(shù)除以單位睪丸質(zhì)量（每100 g） 即為精子指數(shù)。

2.5 血清性激素水平檢測(cè) 從冷藏室取出各試劑盒，室溫平衡30 min，同時(shí)從-80 ℃冰箱取出血清樣本放至室溫，根據(jù)相應(yīng)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組大鼠血清T、LH、FSH、GnRH水平。

2.6 各臟器組織病理學(xué)檢測(cè) 取固定的組織，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制備4 μm 切片。石蠟切片用二甲苯、無(wú)水乙醇、梯度乙醇和蒸餾水處理，然后脫蠟、水化，用蘇木精染色劑染色，1% 鹽酸-甲醇分化，流水清洗，用伊紅染液染色，梯度乙醇和二甲苯脫水后，中性膠封片，于顯微鏡下觀察，收集圖像并進(jìn)行分析。其中睪丸組織切片于顯微鏡下觀察生精細(xì)胞的數(shù)量和排列情況，并采用Johnsen 評(píng)分定量判定精子發(fā)生，最高10 分，精子發(fā)生正常； 得分越低，生精細(xì)胞分化越差，生精細(xì)胞的破壞也越嚴(yán)重，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。每只小鼠取50 根圓形切片的輸精管進(jìn)行評(píng)分，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 Johnsen 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Johnsen scoring criteria

2.7 RT-qPCR 法檢測(cè)睪丸組織mTOR、LC3B、ULK1 mRNA 表達(dá) 取于-80 ℃保存的睪丸組織，采用TRIzol 試劑盒提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)熒光定量PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)，2-ΔΔCT法計(jì)算mTOR、LC3B、ULK1 mRNA相對(duì)表達(dá)。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司設(shè)計(jì)與合成，序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

2.8 Western blot 法檢測(cè)睪丸組織mTOR、pmTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達(dá) 稱取0.05 g 睪丸組織，用冰預(yù)冷PBS 洗滌，加入200 μL 裂解液，研磨勻漿，裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，移取120 μL 蛋白上清，加入5×loading buffer，混勻后變性。蛋白樣本經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模后封閉，加一抗mTOR （1 ∶500）、p-mTOR （1 ∶500）、LC3B （1 ∶500）、ULK1 （1 ∶500）、β-actin （1 ∶5 000） 4 ℃孵育過(guò)夜，次日加二抗（1 ∶5 000）孵育90 min，ECL 法顯色、曝光，掃描底片，采用Image J 軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠一般情況的影響模型組大鼠食量減少，尿量增加，精神萎靡，反映遲緩，嗜睡，毛質(zhì)粗糙化，色稍黃，存在弓背、豎發(fā)現(xiàn)象，尿量增加，墊料極度潮濕，表現(xiàn)不育癥陽(yáng)虛癥狀； 與模型組比較，給藥組大鼠食量增加，尿量恢復(fù)正常，活躍能力增強(qiáng)，精神好，弓背、豎發(fā)現(xiàn)象及墊料潮濕程度改善。

3.2 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠臟器指數(shù)的影響與空白組比較，模型組大鼠腎臟指數(shù)升高 （P＜0.05），肝臟、睪丸及附睪臟器指數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05）； 與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和毛蕊花糖苷各劑量組腎臟指數(shù)降低（P＜0.05），肝臟、睪丸及附睪臟器指數(shù)均無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠臟器指數(shù)的影響（±s，n＝8）Fig.1 Effects of verbascoside on organ indices levels in infertile rats （±s，n＝8）

3.3 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠精子情況的影響與空白組比較，模型組大鼠精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率及精子指數(shù)均降低（P＜0.05），說(shuō)明造模成功； 與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和毛蕊花糖苷高劑量組精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率增加（P＜0.05），精子指數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05），毛蕊花糖苷低劑量組精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率及精子指數(shù)均無(wú)明顯變化 （P＞0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠精子情況的影響（±s，n＝8）Fig.2 Effects of verbascoside on sperm conditions in infertile rats （±s，n＝8）

3.4 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠血清性激素水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清T、GnRH水平降低（P＜0.05），LH、FSH 水平升高 （P＜0.05），表明模型大鼠體內(nèi)性激素水平嚴(yán)重失調(diào)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和毛蕊花糖苷各劑量組大鼠血清T 水平升高（P＜0.05），F(xiàn)SH 水平降低（P＜0.05），GnRH 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），毛蕊花糖苷高劑量組大鼠血清LH 水平降低（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組和毛蕊花糖苷低劑量組大鼠血清LH 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠血清性激素水平的影響（±s，n＝8）Fig.3 Effects of verbascoside on serum sex hormone levels in infertile rats （±s，n＝8）

3.5 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠各臟器組織病理學(xué)的影響

3.5.1 肝臟 空白組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，而肝細(xì)胞索以中部靜脈為主要中樞，成輻射狀地完全排出，未發(fā)現(xiàn)變性或壞死的細(xì)胞，且細(xì)胞器構(gòu)造緊密； 與空白組比較，其余各組大鼠肝組織未表現(xiàn)出較為突出的異常，見(jiàn)圖4。

圖4 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠肝臟組織形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Fig.4 Effects of verbascoside on the liver morphology in infertile rats （HE staining，×200）

3.5.2 腎臟 空白組蠶狀腎切片大小相同，未見(jiàn)明顯病理改變，腎小管未見(jiàn)異物，管腔規(guī)則； 模型組蠶狀部分面積增大，腎小管內(nèi)可見(jiàn)大量棕黃色結(jié)晶，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、崩解，表現(xiàn)為病變萎縮，散在囊狀擴(kuò)張成空泡，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，顯示腺嘌呤可誘發(fā)腎實(shí)質(zhì)損害； 陽(yáng)性對(duì)照組蠶狀橫截面積增大； 毛蕊花糖苷各劑量組腎小球體積變小，管狀針狀棕色晶體沉積減少，上皮細(xì)胞萎縮、間質(zhì)纖維化、囊性擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度均存在不同程度減輕，見(jiàn)圖5。

圖5 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠腎臟組織形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Fig.5 Effects of verbascoside on the kidney morphology in infertile rats （HE staining，×200）

3.5.3 睪丸 空白組生精管基底膜完好無(wú)缺，視野中層次清晰，生精細(xì)胞層豐富，支持細(xì)胞排列緊密，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量生精細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞分布均勻； 模型組生精小管基底膜破壞嚴(yán)重，細(xì)胞層次不清，排列凌亂，可見(jiàn)大部分細(xì)胞脫落，細(xì)胞碎片散在管腔，管腔內(nèi)生精細(xì)胞欠缺，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量極少； 陽(yáng)性對(duì)照組和毛蕊花糖苷高劑量組生精管基底膜較為完整，生精細(xì)胞層相比模型組稍多，管腔生精細(xì)胞較多，間質(zhì)細(xì)胞散在排列，見(jiàn)圖6。Johnson評(píng)分見(jiàn)圖7，由此可知，與空白組比較，模型組Johnson 評(píng)分降低（P＜0.05）； 與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和毛蕊花糖苷各劑量組Johnson 評(píng)分均升高（P＜0.05）。

圖6 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠睪丸組織形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Fig.6 Effects of verbascoside on the testicular morphology in infertile rats （HE staining，×200）

圖7 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠睪丸Johnsen 評(píng)分的影響（±s，n＝8）Fig.7 Effects of of verbascoside on Johnsen score for testicular biopsy in infertile rats （±s，n＝8）

3.6 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠睪丸組織mTOR、LC3B、ULK1 mRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠睪丸組織mTORmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），LC3B、ULK1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組相比較，陽(yáng)性對(duì)照組和毛蕊花糖苷高劑量組大鼠睪丸組織mTORmRNA 表達(dá)降低 （P＜0.05），LC3B、ULK1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），毛蕊花糖苷低劑量組大鼠睪丸組織mTOR、LC3B、ULK1 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖8。

圖8 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠睪丸組織mTOR、LC3B、ULK1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝8）Fig.8 Effects of verbascoside on the testicular mRNA expressions of mTOR，LC3B and ULK1 in infertile rats （±s，n＝8）

3.7 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠睪丸組織mTOR、p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠睪丸組織mTOR 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和毛蕊花糖苷高劑量組大鼠睪丸組織mTOR 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），毛蕊花糖苷低劑量組大鼠睪丸組織mTOR、p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖9。

圖9 毛蕊花糖苷對(duì)不育癥大鼠睪丸組織mTOR、p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝8）Fig.9 Effects of verbascoside on the testicular protein expressions of mTOR，p-mTOR，LC3B and ULK1 in infertile rats（±s，n＝8）

4 討論

不育癥是一種男科常見(jiàn)疾病，因其病因復(fù)雜，目前尚無(wú)明確的治療藥物［3］。肉蓯蓉為補(bǔ)腎之要藥，在不育癥的治療方面優(yōu)勢(shì)顯著，而毛蕊花糖苷作為肉蓯蓉的主要功效成分，藥理作用不明確。腺嘌呤誘導(dǎo)的動(dòng)物模型不僅出現(xiàn)血清激素水平的異常，并出現(xiàn)睪丸的損害精子數(shù)量、活動(dòng)率下降，這些特征與不育癥臨床表征相一致［10-11］。因此，本研究選用腺嘌呤誘導(dǎo)構(gòu)建不育癥模型，通過(guò)藥效學(xué)方法評(píng)價(jià)毛蕊花糖苷對(duì)不育癥生殖功能的改善作用。

腺嘌呤經(jīng)體內(nèi)代謝，產(chǎn)生大量的氧自由基（reactive oxygen species，ROS），致使睪丸內(nèi)環(huán)境紊亂進(jìn)而對(duì)性激素等生物大分子產(chǎn)生毒性反應(yīng)［12］。下丘腦-垂體-睪丸軸 （hypothalamic-pituitary-testicular axis，HPTA） 作為男性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中GnRH 促進(jìn)LH、FSH 分泌，LH 可促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞（leydig cells，LCs） 合成T，F(xiàn)SH 和T 共同促進(jìn)精子生成，T 通過(guò)負(fù)反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)FSH 和LH的合成和釋放，維持激素之間的相對(duì)平衡［13］。本研究顯示，模型組大鼠T、GnRH 呈現(xiàn)低水平，同時(shí)LH、FSH 呈現(xiàn)一定程度的上升趨勢(shì)； 與模型組比較，毛蕊花糖苷可通過(guò)提高T 水平，繼而對(duì)HPTA 的激素發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。

不育癥的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，ROS引起的損傷可通過(guò)自噬途徑活化，形成自噬小體，從而導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境異常［14］。自噬是細(xì)胞拮抗應(yīng)激反應(yīng)、依賴溶酶體的細(xì)胞分解代謝過(guò)程，是有機(jī)生物體對(duì)不同環(huán)境自我調(diào)節(jié)的內(nèi)部機(jī)制［15］。作為合成、分泌睪酮的睪丸LCs，其基礎(chǔ)自噬水平較高，能夠通過(guò)自噬作用維持雄性生殖功能［16-18］。ROS 誘導(dǎo)LCs 自噬減弱，自噬影響睪酮合成，因此對(duì)自噬發(fā)生機(jī)制的深入研究，可能是探討調(diào)控睪酮合成非經(jīng)典通路新的重要線索。mTOR 是當(dāng)今公認(rèn)的與不育癥相關(guān)的LCs 自噬關(guān)鍵靶標(biāo)［19］。當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞能量物質(zhì)充裕時(shí)，激活的mTOR 磷酸化ULK1，抑制ULK1 激酶活性，從而抑制自噬； 當(dāng)能量物質(zhì)缺乏時(shí)，mTOR 被磷酸化，ULK1 解除抑制，促使自噬發(fā)生［20］。實(shí)驗(yàn)研究證明，mTOR 被抑制后可改變睪丸的結(jié)構(gòu)形態(tài)并促進(jìn)其細(xì)胞自噬的發(fā)生［21］。因此，選擇自噬通路中 mTOR、pmTOR、LC3B、ULK1 作為本研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予毛蕊花糖苷后，睪丸pmTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達(dá)升高，mTOR 蛋白表達(dá)降低，表明毛蕊花糖苷通過(guò)影響mTOR 磷酸化水平，促進(jìn)ULK1 表達(dá)，使自噬增強(qiáng)，進(jìn)而提高睪酮合成。

本實(shí)驗(yàn)以腺嘌呤誘導(dǎo)的不育癥大鼠為研究對(duì)象，對(duì)毛蕊花糖苷的干預(yù)作用進(jìn)行考察，并初步探討毛蕊花糖苷改善生殖功能的潛在作用靶點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷能夠有效地提高不育癥模型大鼠體內(nèi)的精子質(zhì)量，改善不育癥模型大鼠身體的一般機(jī)能狀態(tài)，對(duì)腎臟、睪丸組織結(jié)構(gòu)的病理性損傷有顯著的修復(fù)作用，可調(diào)節(jié)性腺軸激素水平，發(fā)揮改善生殖功能的功效，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)正性調(diào)控自噬，調(diào)節(jié)HPTA 紊亂，改善生殖功能有關(guān)。