張亞柯，張宏偉，張振凌，2*，朱建光，李德華，孫夢(mèng)梅，趙永琪，王一鳴

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450018）

拱辰丹出自《葉氏錄驗(yàn)方》［1］，由當(dāng)歸、山萸肉、鹿茸、麝香組成，而加味拱辰丹是河南保和堂名中醫(yī)在其基礎(chǔ)上添加熟地黃、紅參而成，臨床上主要用于早發(fā)性卵巢功能不全的治療［2-3］。在拱辰丹傳承過(guò)程中，歷代醫(yī)家對(duì)當(dāng)歸、山萸肉是否使用炮制品入藥存在不同看法，（1） 當(dāng)歸，《魏氏家藏方》［4］等以酒當(dāng)歸入藥，《女科百問(wèn)》［3］《世醫(yī)得效方》［5］等以生當(dāng)歸入藥，而現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為，脈絡(luò)瘀阻為早發(fā)性卵巢功能不全持續(xù)存在的病理狀態(tài)［6］，酒制后其活血、祛瘀、通經(jīng)的作用可得到增強(qiáng)［7-8］； （2） 山萸肉，歷代古籍中均以生品入藥，而現(xiàn)代方加味拱辰丹以酒萸肉入藥，于慧等［9］發(fā)現(xiàn)，酒萸肉組中環(huán)烯醚萜苷等有效成分含量高于生萸肉組中，與山茱萸酒制前后環(huán)烯醚萜苷含量變化趨勢(shì)不同［10-12］，表明合理配伍可有效提高處方療效。課題組前期將加味拱辰丹開(kāi)發(fā)成濃縮丸以減少服用量、提高依從性，而本實(shí)驗(yàn)考察炮制對(duì)該制劑化學(xué)成分的影響，以期為其后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 VanquishTMFlex 型超高效液相色譜系統(tǒng)、Orbitrap ExplorisTM120 型高分辨率質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）； Waters 2489 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）； BT125D 型電子分析天平［十萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； GZX-9070 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）； HH-S6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 藁本內(nèi)酯、莫諾苷、綠原酸對(duì)照品 （四川省樂(lè)美天醫(yī)藥有限公司，批號(hào)DSTDH000702、DST210508-039、DSTDL002102，純度≥98%）； 馬錢(qián)苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111640-201606，純度98.3%）； 阿魏酸、馬錢(qián)苷酸、5-羥甲基糠醛對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào) G13S11L124423、M07HB177364、H12M9Z61023，純度≥98%）； 沒(méi)食子酸對(duì)照品（成都普思生物科技有限公司，批號(hào)PS0258-0050，純度98.5%）； 山茱萸新苷對(duì)照品 （ 成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF20091301，純度≥98%）。當(dāng)歸、山萸肉、熟地（批號(hào)211103781、210901601、210800199，康美藥業(yè)有限公司）； 鹿茸、紅參、麝香（河南省保和堂醫(yī)藥有限公司），均經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授鑒定為正品。甲酸、乙腈、甲醇均為質(zhì)譜純； 磷酸為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為超純水和飲用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備

2.1.1 酒當(dāng)歸 取凈當(dāng)歸片適量，加入一定量黃酒拌勻，稍悶潤(rùn)，待酒被吸盡后置于炒制容器中，文火加熱炒至深黃色，取出晾涼，即得（每100 kg當(dāng)歸片用10 kg 黃酒）。

2.1.2 酒萸肉 取凈山萸肉適量，黃酒拌勻后置于蒸制容器中，隔水蒸透至黑潤(rùn)，取出，干燥，即得（每100 kg 山萸肉用20 kg 黃酒）。

2.2 濃縮丸制備 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)條件，將當(dāng)歸、山萸肉、熟地黃粉碎后過(guò)4 號(hào)篩，加入15 倍量60%乙醇，加熱回流提取2 次，每次1.6 h，合并濾液，濃縮成相對(duì)密度為1.35 （60 ℃） 的稠膏；鹿茸、紅參粉碎后過(guò)6 號(hào)篩，人工麝香研細(xì)，與上述稠膏充分混勻，得到軟硬適中的丸塊，制丸，干燥，即得。

2.3 UPLC-MS 成分分析

2.3.1 色譜條件 Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～2 min，97%B； 2 ～21 min，97% ～75% B； 21 ～30 min，75% ～35% B；30～32 min，35%B）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 正負(fù)離子掃描； 質(zhì)量掃描范圍m/z80 ～1 200； 鞘氣體積流量45 arb； 輔助氣體積流量15 arb； 霧化溫度350 ℃； 離子傳輸管溫度320 ℃； 噴霧電壓3.5、-2.5 kV。

2.3.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，50%甲醇溶解得貯備液，精密吸取適量，制成分別含莫諾苷13.13 μg/mL、馬錢(qián)苷13.43 μg/mL、綠原酸12.37 μg/mL、藁本內(nèi)酯11.83 μg/mL、馬錢(qián)苷酸12.37 μg/mL 的溶液，即得。

2.3.4 供試品溶液制備 將濃縮丸粉碎后精密稱(chēng)取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液1 mL 至10 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，即得。

2.4 化學(xué)成分鑒定 在正負(fù)離子模式下分別對(duì)生品組、炮制品組、酒當(dāng)歸組、酒萸肉組數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，結(jié)果見(jiàn)圖1。再通過(guò)Xcalibur 3 軟件獲取保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片等信息，與已有對(duì)照品質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)、PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析。結(jié)果，共鑒定出97 個(gè)化合物，包括環(huán)烯醚萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、皂苷類(lèi)、苯肽類(lèi)、核苷類(lèi)、氨基酸類(lèi)等主要結(jié)構(gòu)，具體見(jiàn)表1。

表1 加味拱辰濃縮丸化學(xué)成分鑒定結(jié)果Tab.1 Results for chemical constituent identification of Supplemented Gongchen Concentrated Pills

圖1 加味拱辰濃縮丸BPI 圖Fig.1 BPI profiles of Supplemented Gongchen Concentrated Pills

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1 主成分分析（PCA） 采用SIMCA 14.1軟件對(duì)各組質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)監(jiān)督模式的PCA 分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，各組組內(nèi)聚合度良好，組間區(qū)分為4 類(lèi)，表明加入不同炮制品后化學(xué)成分存在明顯差異。

圖2 加味拱辰濃縮丸PCA 得分圖Fig.2 PCA score plot for Supplemented Gongchen Concentrated Pills

2.5.2 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）在PCA 分析基礎(chǔ)上采用有監(jiān)督模式的OPLS-DA 分析，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建5 個(gè)模型的R2X、R2Y、Q2均大于0.9，表明模型具有良好的預(yù)測(cè)能力和擬合度，再對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行200 次置換檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)交叉驗(yàn)證后模型截距均低于原始模型截距，R2擬合直線(xiàn)在Y軸的截距均小于0.3，Q2擬合直線(xiàn)在Y軸的截距均為負(fù)數(shù)，表明模型未存在過(guò)度擬合現(xiàn)象，預(yù)測(cè)能力良好，見(jiàn)圖3。

圖3 加味拱辰濃縮丸OPLS-DA 得分圖與驗(yàn)證模型Fig.3 OPLS-DA score plots and verification models for Supplemented Gongchen Concentrated Pills

然后，以VIP＞1、P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)兩兩組別之間進(jìn)行差異成分篩選，結(jié)果見(jiàn)圖4、表2。由此可知，生品組和炮制品組中26 種差異成分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，酒萸肉組和生品組中27 種差異成分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，酒當(dāng)歸組和生品組中21 種差異成分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，炮制品組和酒當(dāng)歸組中25 種差異成分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，炮制品組和酒萸肉組中22 種差異成分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 生品組和炮制品組、酒當(dāng)歸組和炮制品組、生品組和酒萸肉組中差異成分重合度高，數(shù)量相近，炮制品組和酒萸肉組、生品組和酒當(dāng)歸組中差異成分?jǐn)?shù)量減少，重合度降低，表明生品組和酒當(dāng)歸組相似度較高，炮制品組和酒萸肉組相似度較高。

表2 加味拱辰濃縮丸差異成分Tab.2 Differential constituents of Supplemented Gongchen Concentrated Pills

圖4 加味拱辰濃縮丸S-plot 散點(diǎn)圖Fig.4 S-plot scatter plots for Supplemented Gongchen Concentrated Pills

2.6 差異成分含量測(cè)定 在定性分析基礎(chǔ)上結(jié)合文獻(xiàn)［11，12，34-35］ 報(bào)道，綜合考慮含量、藥理活性、紫外吸收情況，選擇莫諾苷、馬錢(qián)苷、山茱萸新苷、沒(méi)食子酸、阿魏酸、綠原酸、馬錢(qián)苷酸、藁本內(nèi)酯、5-羥甲基糠醛進(jìn)行含量測(cè)定。

2.6.1 色譜條件 SymmetryShieldTMRP18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.5%磷酸（B），梯度洗脫（0～25 min，4% ～14%A；25 ～50 min，14% ～23% A； 50 ～60 min，23% ～25.5%A； 60～62 min，25.5% ～4% A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm； 進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 各成分HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取5-羥甲基糠醛、沒(méi)食子酸、馬錢(qián)苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、綠原酸對(duì)照品適量，50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.092、0.254、0.244、0.222、1.580、1.170、0.110、0.490、0.128 mg/mL的貯備液，精密吸取除5-羥甲基糠醛以外的8 種貯備液適量，混勻，50%甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度； 精密吸取5-羥甲基糠醛貯備液適量，50%甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度，即得。

2.6.3 供試品溶液制備 本品干燥、粉碎后精密稱(chēng)取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.6.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 取不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液適量，在“2.6.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表3 各成分線(xiàn)性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.6.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量，在“2.6.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得沒(méi)食子酸、馬錢(qián)苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、綠原酸、5-羥甲基糠醛峰面積RSD 分別為1.13%、1.21%、1.93%、1.68%、1.80%、1.02%、1.21%、1.82%、0.91%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備供試品溶液6 份，在“2.6.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、馬錢(qián)苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、綠原酸、5-羥甲基糠醛含量RSD分別為1.36%、0.75%、1.02%、1.85%、1.24%、1.71%、1.15%、1.69%、1.43%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.6.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、馬錢(qián)苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、綠原酸、5-羥甲基糠醛峰面積RSD 分別為1.54%、0.65%、1.80%、1.55%、1.92%、1.06%、0.78%、1.17%、1.29%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品粉末6 份，每份約0.25 g，精密稱(chēng)定，按100%水平精密加入對(duì)照品溶液適量，按“2.6.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒(méi)食子酸、馬錢(qián)苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、綠原酸、5-羥甲基糠醛平均加樣回收率分別為98.50%、99.28%、98.57%、100.08%、99.63%、99.90%、99.07%、100.12%、98.84%，RSD 分別為 1.69%、1.25%、0.86%、1.92%、0.67、1.37%、0.93%、1.56%、1.73%。

2.6.9 樣品含量測(cè)定 平行制備生品組、炮制品組、酒當(dāng)歸組、酒萸肉組樣品各 5 份，按“2.6.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，藁本內(nèi)酯在酒萸肉組中含量最高； 炮制品組和酒萸肉組中沒(méi)食子酸含量約為生品組和酒當(dāng)歸組中的4 倍，有機(jī)酸總含量約為后兩者中的1.5倍，環(huán)烯醚萜苷總含量接近。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Tab.4 Results for content determination of various constituents （mg/g）

2.6.10 聚類(lèi)分析 采用Heml 1.0 軟件，以各成分含量為指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。由此可知，同一組別5 批樣品各自聚為一類(lèi)，表明其質(zhì)量一致性良好； 生品組和酒當(dāng)歸組聚為一類(lèi)，炮制品組和酒萸肉組聚為一類(lèi)，表明兩兩組別之間各成分含量變化規(guī)律相似； 數(shù)值越大，顏色越暖，相應(yīng)成分含量越高，而炮制品組和酒萸肉組暖色調(diào)占比較大，表明其所含成分含量整體上較高。

圖6 各成分含量聚類(lèi)熱圖Fig.6 Cluster heatmap for contents of various constituents

3 討論

3.1 定性定量分析 生品組、炮制品組、酒當(dāng)歸組、酒萸肉組中均鑒定出環(huán)烯醚萜苷、有機(jī)酸、苯肽、核苷、氨基酸、皂苷6 種主要構(gòu)型，化學(xué)成分?jǐn)?shù)量也無(wú)明顯差異。以VIP ＞1、P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)兩兩組別進(jìn)行OPLS-DA 分析來(lái)篩選組間差異物，發(fā)現(xiàn)每2 組之間均得到20 種以上差異成分，并選出莫諾苷、馬錢(qián)苷、山茱萸新苷、沒(méi)食子酸、阿魏酸、馬錢(qián)苷酸、綠原酸、藁本內(nèi)酯、5-羥甲基糠醛9 種差異大、含量高、藥理活性和紫外吸收強(qiáng)的代表性成分進(jìn)行含量測(cè)定。OPLS-DA 分析、聚類(lèi)熱圖分析均顯示，炮制品組、酒萸肉組中各成分含量變化趨勢(shì)極為相似，表明酒萸肉的加入對(duì)增加組方配伍合理性起到主要貢獻(xiàn)； 炮制品組中有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜苷總量略高于酒萸肉組，推測(cè)酒當(dāng)歸的加入也具有一定協(xié)同增效作用； 炮制品組中各飲片相互配伍后有機(jī)酸總量顯著升高，但環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分含量未明顯降低，與山茱萸酒制后莫諾苷、馬錢(qián)苷、山茱萸新苷等環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分含量顯著降低的趨勢(shì)不同［10］。另外，酒當(dāng)歸、酒萸肉的加入對(duì)組方成分的影響可能與黃酒有關(guān)，該輔料可使加味拱辰濃縮丸中當(dāng)歸、山萸肉等飲片中有機(jī)酸類(lèi)成分溶解度增加，含量升高，進(jìn)一步改變了溶液pH［36］，從而影響環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分酸解效率，還可提高該類(lèi)成分前體物質(zhì)向環(huán)烯醚萜苷類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率［37］。

3.2 成分-藥效關(guān)聯(lián)分析 中醫(yī)認(rèn)為，早發(fā)性卵巢功能不全病機(jī)主要與腎、肝、心等臟腑有關(guān)； 西醫(yī)認(rèn)為，本病主要發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫功能、卵巢微環(huán)境、細(xì)胞自噬與凋亡等因素有關(guān)［2］。加味拱辰濃縮丸主要成分包括有機(jī)酸類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)等，具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)造血功能、保肝、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等作用，集中作用于神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)［34，38］，與早發(fā)性卵巢功能不全發(fā)病機(jī)制吻合，也與中醫(yī)“腎” “肝”藏象在宏觀層面所指一致［35，39］。由此推測(cè)，加味拱辰濃縮丸所含有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分含量的升高可能會(huì)增強(qiáng)其補(bǔ)益肝腎作用，從而提高療效。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)化學(xué)成分種類(lèi)、數(shù)量、含量對(duì)不同組成的加味拱辰濃縮丸質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)炮制品組、酒萸肉組質(zhì)量?jī)?yōu)于生品組、酒當(dāng)歸組，表明酒萸肉的加入對(duì)增加組方配伍的合理性起到主要貢獻(xiàn)，并且酒當(dāng)歸的加入具有一定協(xié)同增效作用。