丁燕超，曾子顏，鄭培源，霍苑桐，杜娟娟

（清華大學藥學院 生命有機磷化學教育部重點實驗室，北京 100084）

作為細胞與外界環(huán)境交流的門戶，細胞表面膜蛋白在維持細胞結(jié)構(gòu)、促進細胞通訊、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外分子的運輸?shù)确矫姘l(fā)揮重要功能[1]。同時，它們的功能與諸多疾病相關(guān)，如癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病、代謝疾病和自身免疫疾病等，約占可成藥蛋白質(zhì)組的30%[2]。其中，多次跨膜蛋白（multipass membrane protein，MMP）是一類包含2個或多個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，是重要的藥物靶點。MMP主要類型包括G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）[3]、離子通道（ion channel）[4]和轉(zhuǎn)運蛋白（transporter）[5]等，該類蛋白在細胞的跨膜信號傳導、物質(zhì)跨膜運輸、能量利用、免疫識別等方面都起到至關(guān)重要的作用。

GPCR，又稱7次跨膜受體，由胞外氨基末端、胞內(nèi)羧基末端和7段α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域組成。該類受體蛋白作為信號轉(zhuǎn)換器將細胞外刺激（激素、神經(jīng)遞質(zhì)、離子等）傳導到細胞內(nèi)，與胞內(nèi)效應蛋白結(jié)合后介導一系列生理或病理反應，對人類正常生理過程和疾病的發(fā)生至關(guān)重要[6]?；谝延械臄?shù)據(jù)分析表明，已批準上市的藥物中超40%的藥物靶向該類受體，涉及免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、心血管、視網(wǎng)膜等器官和組織[7]。針對該類靶點，已批準上市的藥物類型主要包括小分子、天然產(chǎn)物、多肽、抗體等，其中小分子類藥物約占92%，蛋白類藥物約占2%。

離子通道是一種成孔跨膜蛋白，是繼GPCR之后用于藥物發(fā)現(xiàn)的第2大類膜蛋白[8]。離子通道是在磷脂雙分子層中具有高度選擇性的親水性孔道，通過響應膜電位或特定化學物質(zhì)等信號，選擇性地控制特定離子透過磷脂雙分子層。離子通道的生物學功能包括建立靜息膜電位、形成動作電位等電信號、調(diào)節(jié)細胞體積等，按照其激活機制的不同可分為電壓門控、配體門控、機械門控等類型[9]。離子通道目前是治療2型糖尿病、高血壓、癲癇、心律失常和焦慮等疾病的重要藥物靶點。盡管離子通道是許多疾病的誘因，但批準的藥物僅適用于離子通道類蛋白的一小部分類型（約8%）[10]。迄今為止，大多數(shù)離子通道藥物開發(fā)都集中在小分子和多肽類調(diào)節(jié)劑，多是在缺乏結(jié)構(gòu)和功能信息情況下的偶然發(fā)現(xiàn)。許多離子通道調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)源于對天然物質(zhì)的研究，例如來自植物和有毒動物的毒素[11]。盡管早期的離子通道調(diào)節(jié)劑研發(fā)取得了成功，自20世紀90年代以來小分子/化合物文庫的篩選工具也取得重大進展，但近年來針對離子通道的創(chuàng)新藥研究進展卻較為緩慢，自2012年以來，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的靶向新靶點的離子通道藥物僅有2個（即ivacaftor和crofelemer）。

轉(zhuǎn)運蛋白幫助離子和生物分子跨越磷脂雙分子層進行運輸[12]。轉(zhuǎn)運體可分為2大類：溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運體（solute carrier，SLC）和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體（ATP binding cassette，ABC）。該類蛋白對人類的多種生理過程至關(guān)重要，主要涉及營養(yǎng)吸收、離子穩(wěn)態(tài)、藥物外排等。SLC轉(zhuǎn)運體是治療抑郁癥和糖尿病的靶點[13]。ABC轉(zhuǎn)運體與藥物耐藥有密切的關(guān)系，可能成為克服耐藥的潛在靶點[14]。然而，針對轉(zhuǎn)運蛋白的功能和藥物的研究仍然較少，難以充分開發(fā)這些蛋白作為藥物靶點的潛力。

目前針對MMP的藥物開發(fā)主要以小分子藥物和多肽藥物為主。MMP中存在的配體結(jié)合口袋為小分子/多肽藥物設(shè)計提供了獨特的機會。例如，GPCR的天然配體的結(jié)合口袋，即正構(gòu)位點，可以被多種合成配體所結(jié)合，為小分子/多肽藥物調(diào)控靶點功能提供了直接的途徑[15-16]。同時，GPCR中也存在多個別構(gòu)位點，為小分子藥物提供了額外的潛在調(diào)控機制[17-18]。在離子通道中，孔道區(qū)、電壓感受域和配體結(jié)合區(qū)中均存在可能結(jié)合的口袋[19-21]。轉(zhuǎn)運蛋白的正構(gòu)位點是其轉(zhuǎn)運底物的結(jié)合區(qū)域，是競爭性功能調(diào)控的有效結(jié)合口袋[22-23]。另外，轉(zhuǎn)運蛋白中也存在別構(gòu)位點，可以調(diào)控其結(jié)構(gòu)和功能[24-25]?；谛》肿优c這些口袋的結(jié)合，科學家們設(shè)計出多種針對MMP的小分子藥物，在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥等疾病治療中起到重要的作用。盡管小分子藥物在這類靶點的藥物開發(fā)中取得了長足的進展，但選擇性和成藥性的潛在問題致使了小分子/多肽新藥發(fā)現(xiàn)的成功率低。目前，許多MMP靶點尚無針對性小分子/多肽藥物，小分子/多肽藥物尚不能完全滿足針對MMP靶點的藥物開發(fā)。

在過去的30年中，單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）已經(jīng)徹底改變了許多疾病的治療，并顯著提升了醫(yī)學的精準度[26]。然而，目前獲批的抗體藥物的靶標仍然主要局限于分泌蛋白和具有較大胞外域的單次跨膜蛋白[2]。近年來，越來越多的研究者開始關(guān)注MMP靶點的抗體研發(fā)。然而，針對MMP的抗體藥物研發(fā)仍然十分具有挑戰(zhàn)性。因此，探索合適的藥物研發(fā)策略對于解決此類問題具有重要的臨床意義。本文概述了靶向MMP的抗體類藥物研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)及解決辦法，并對近年來MMP的抗體類藥物的研究進展進行簡要總結(jié)。

1 多次跨膜蛋白藥物研發(fā)的挑戰(zhàn)

長期以來，MMP被認為是具有挑戰(zhàn)性的抗體藥物靶點。面向MMP的抗體開發(fā)主要面臨如下挑戰(zhàn)：MMP自身結(jié)構(gòu)的特殊性使其胞外抗原表位有限，抗原制備難度較大，在高通量篩選時難以保證高特異性[27]；部分MMP缺乏關(guān)鍵的晶體結(jié)構(gòu)信息，使得基于結(jié)構(gòu)的藥物開發(fā)面臨挑戰(zhàn)；MMP多以家族形式存在，具有不同的亞型和不同的構(gòu)象/狀態(tài)，因此在實現(xiàn)亞型、構(gòu)象/狀態(tài)選擇性上難度較大[28]。此外，抗體的結(jié)合親和力并不完全等同于其功能性，部分抗體可與抗原結(jié)合但不影響受體功能[29]。下面將針對MMP抗體開發(fā)中面臨的主要挑戰(zhàn)進行討論。

1.1 抗原表位有限

很多MMP的結(jié)構(gòu)具有如下特點：蛋白大部分嵌入細胞膜中，導致細胞外抗原表位可及性較低；因此，高特異性抗體類藥物的獲取有一定難度。例如，對于許多電壓門控離子通道（voltage-gated ion channel，VGIC）以及A類GPCR，mAb最有可能結(jié)合的細胞外環(huán)很短并且包含很少的潛在表位（見圖1）[30]。此外，這些外環(huán)在氨基酸序列上往往存在物種間的保守性，在把免疫哺乳動物作為宿主時難以產(chǎn)生高效的免疫反應[31]。

圖1 膜蛋白的胞外域的大小和抗體發(fā)現(xiàn)難度的關(guān)系示意圖Figure 1 The correlation between extracellular domain of membrane proteins and the difficulty of discovering functional antibodies

納米抗體（nanobody，Nb）由于其具有更長的互補決定區(qū)3（complementarity-determining region 3，CDR3），可以結(jié)合MMP表面的凹形口袋，較之于傳統(tǒng)的mAb，可以與MMP形成更強的相互作用[32]。同時，由于其尺寸小、結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性高，Nb具有克服傳統(tǒng)mAb的其他局限性的潛力。例如，較小尺寸的Nb可以改善組織滲透性，可以穿透傳統(tǒng)mAb無法穿透的腫瘤，能夠在靶標附近得到更高的富集，實現(xiàn)更特異和更有效的藥物輸送[33]。因此，Nb也是針對MMP抗體研發(fā)中的一個具有前景的領(lǐng)域。

1.2 抗原制備難度大

抗原制備是開發(fā)靶向MMP的抗體類藥物的首要前提。理想狀態(tài)下，靶抗原需要包含與抗體識別相關(guān)的全部表位；即使不需要完整的抗原分子，但其關(guān)鍵表位的相關(guān)區(qū)域應是不可或缺的，同時還要盡可能地保留目的抗原蛋白的構(gòu)象和生物活性等特性。但是，MMP抗原制備難度較大，存在諸多技術(shù)挑戰(zhàn)。首先，由于MMP自身結(jié)構(gòu)中包含多個跨膜結(jié)構(gòu)域，需要磷脂雙層膜或者其他去垢劑的存在以維持穩(wěn)定性，加之自然條件下MMP表達量的限制，重組生產(chǎn)足夠量的全長蛋白用于藥物研發(fā)具有挑戰(zhàn)性[34-36]。同時，雖然磷脂雙層膜或者其他去垢劑可以保持MMP的結(jié)構(gòu)，但在免疫動物或體外篩選的過程中，MMP仍可能失活，為抗體篩選增加了挑戰(zhàn)[37]。同時，MMP的異源表達需要尋求最佳表達系統(tǒng)來改善其低豐度表達水平，在一定程度上增加了藥物研發(fā)成本[38]。

雖然部分抗原制備方法具有一定局限性，但為了兼顧抗原表位結(jié)構(gòu)的準確性以及制備的簡便性，目前經(jīng)常采取的抗原制備方法主要包括體外合成多肽、過表達目的MMP細胞株、體外純化抗原等[34,39]。體外合成的多肽通常為較簡單的線性或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，雖然難以完全模擬復雜膜蛋白的自然構(gòu)象，可以呈現(xiàn)的表位數(shù)量也非常有限，但其合成工藝簡單、易于大量生產(chǎn)，可以部分模擬蛋白的天然構(gòu)象，仍然是目前對于MMP抗體開發(fā)使用最廣泛的方法之一[40]。

以過表達目的靶蛋白的完整細胞作為抗原，能夠更好地保持抗原的三維結(jié)構(gòu)，并且具備必要的翻譯后修飾[41]。然而，蛋白的糖基化受細胞的影響，全細胞過表達抗原中的糖基化與天然條件下往往存在差異。同時，過表達抗原給細胞帶來壓力，可能導致其三維結(jié)構(gòu)與天然構(gòu)象不同。最后，全細胞抗原的免疫也會產(chǎn)生針對細胞上其他蛋白的抗體，需要進行大量的負向篩選來獲得目標抗原的特異性抗體。

體外純化的全長抗原是較為理想的抗原種類，其關(guān)鍵在于如何引入磷脂雙分子層維持抗原穩(wěn)定性，確保純化后的抗原能夠保持天然構(gòu)象。目前，比較成熟的MMP純化方法涉及納米盤、病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）等。納米盤技術(shù)平臺替代了傳統(tǒng)的去垢劑，利用由膜骨架蛋白和磷脂分子構(gòu)成磷脂雙分子層類膜結(jié)構(gòu)，將MMP整合到該結(jié)構(gòu)中，最大限度地維持其天然構(gòu)象及穩(wěn)定性，保持其生物學活性并有良好的水溶性[42]。VLP技術(shù)平臺能夠?qū)⑼暾烊粯?gòu)象的膜蛋白展示在類病毒顆粒的表面，與納米盤相比更接近于天然的細胞膜，與過表達細胞系相比，其表面的目標蛋白豐度更高，結(jié)合免疫方案的優(yōu)化能夠獲得特異性較高的抗體藥物[43]。此外，還可以在宿主體內(nèi)注射編碼抗原蛋白的DNA或mRNA，使宿主細胞表達產(chǎn)生抗原，并進一步促進宿主產(chǎn)生特異性的抗體[44-45]。

1.3 靶點的動態(tài)構(gòu)象致使構(gòu)象特異性的抗體篩選困難

MMP在行使生物學功能時常處于多種構(gòu)象動態(tài)變化的過程中，與不同構(gòu)象結(jié)合的抗體也往往具有不同的調(diào)控功能。例如，GPCR跨細胞膜傳遞信號的能力取決于其跨膜螺旋、細胞外環(huán)和細胞內(nèi)環(huán)的構(gòu)象重排。GPCR激活后將信號傳遞到細胞內(nèi)并招募下游效應蛋白，包括異源三聚體G蛋白（例如Gs、Gi/o、Gq、G12）和β-抑制蛋白（β-arrestin）等，以介導不同的生理效應[15]。針對于異源三聚體G蛋白通路，每個Gα亞基能獨立發(fā)出信號，而Gβ和Gγ亞基作為Gβγ異二聚體發(fā)揮作用；β-arrestin既可作為負性調(diào)節(jié)蛋白終止G蛋白信號傳導并導致受體脫敏，也可作為獨立的信號蛋白發(fā)揮信號傳導作用。傳統(tǒng)的配體分子與內(nèi)源性配體結(jié)合于相同的受體位點——正構(gòu)位點，分別均勻激活或抑制受體信號傳導途徑。這種機制存在固有的缺點，信號通路的統(tǒng)一激活和內(nèi)源性配體節(jié)律性調(diào)節(jié)的破壞導致潛在的在靶副作用（on-target side effects），而高度保守的正構(gòu)位點使其難以實現(xiàn)受體亞型選擇性，從而導致脫靶副作用（off-target side effects）[46]。隨著對GPCR研究的深入，發(fā)現(xiàn)在信號傳導過程中GPCR與潛在效應蛋白進行優(yōu)先偶聯(lián)，從而激活該類受體介導的完整信號庫中的通路子集，實現(xiàn)信號的偏向性激活[47]。GPCR偏向性激動的研究是一個相對較新的領(lǐng)域，它正在改變GPCR信號傳導的概念化方式。發(fā)揮信號偏向性傳導的配體多結(jié)合在正構(gòu)位點之外的變構(gòu)位點，靶向該位點的變構(gòu)調(diào)節(jié)藥物能夠?qū)⑿盘枏淖儤?gòu)位點傳遞到正構(gòu)位點和/或直接傳遞到胞內(nèi)效應蛋白，以調(diào)節(jié)受體活性[48]。但很多GPCR靶點缺乏變構(gòu)位點的位置和結(jié)構(gòu)信息，使變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的開發(fā)受限。

離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白也存在動態(tài)構(gòu)象，與特定構(gòu)象的偏向性結(jié)合可能會影響藥物的活性。離子通道在其門控周期中經(jīng)歷關(guān)閉、打開和失活等多個狀態(tài)。通常認為，對于電壓門控鈉離子通道阻斷劑，最理想的目標狀態(tài)為打開或失活狀態(tài)，而對于電壓門控鉀離子通道激動劑，理想的目標狀態(tài)則為關(guān)閉狀態(tài)[49]。然而，也有觀點認為非狀態(tài)選擇性的藥物可能具有更優(yōu)的療效[50-51]。在針對離子通道進行藥物篩選時，如果神經(jīng)元離子通道在HEK293或CHO細胞中表達，它們的電壓感應域（voltage-sensing domain，VSD）暴露于相對去極化的靜息膜電位（約-40 mV），而不是神經(jīng)元相對超極化的靜息膜電位（約-70 mV）[49]。這意味著，在過表達細胞系上，通道主要處于開放或失活狀態(tài)，這使得針對關(guān)閉狀態(tài)的離子通道進行藥物開發(fā)變得更有挑戰(zhàn)性。轉(zhuǎn)運蛋白的主要構(gòu)象包括外向開口構(gòu)象和內(nèi)向開口構(gòu)象。長期以來，對于小分子調(diào)節(jié)劑設(shè)計，人們認為最佳的轉(zhuǎn)運體構(gòu)象是外向開口構(gòu)象，例如血清素轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter，SERT）——依地普侖（escitalopram）復合體中SERT的構(gòu)象[52-53]。最近，也有針對內(nèi)向開口構(gòu)象的小分子抑制劑被開發(fā)出來[54-57]。針對轉(zhuǎn)運蛋白的抗體開發(fā)也可以獲得不同的構(gòu)象選擇性的抗體[58]，為轉(zhuǎn)運蛋白的新藥開發(fā)提供了新的思路。

2 抗體類藥物研究進展

近年來，針對MMP諸多研究機構(gòu)開展了抗體類藥物的研究，并發(fā)展出mAb、雙特異性抗體（bispecific Antibody，bsAb）、Nb、抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）等多個種類的靶向MMP的抗體類藥物（或候選物）。下面我們將分別針對GPCR、離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白這3個類別的MMP簡述近年來針對這些靶點的抗體類藥物的研究進展。

2.1 針對GPCR的抗體類藥物

2.1.1 針對GPCR的單克隆抗體研發(fā)進展對于靶向GPCR小分子藥物而言，獲得優(yōu)異的靶點選擇性是該類藥物開發(fā)的難題。相對地，mAb具有高度特異性，有望減輕脫靶效應提高安全性。除此之外，mAb還具有潛在的優(yōu)勢，包括：1）限制性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）滲透（多針對外周靶點而言）；2）患者的藥代動力學差異性較低；3）具有較長的作用持續(xù)時間導致用藥頻次減少，增加患者的用藥依從性[59-61]。針對Fc結(jié)構(gòu)域可進行蛋白質(zhì)工程改造，可根據(jù)自身需要消除或增強抗體介導的效應功能，例如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）、補體介導的細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity，CDC）或抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）[62]。通過針對特定構(gòu)象進行篩選，也有可能產(chǎn)生識別GPCR不同構(gòu)象狀態(tài)的mAb。此外，通過完善的先導mAb方法可以進一步增強其針對靶標的親和力和效力。

盡管mAb具有諸多優(yōu)勢，但從嚴格意義上講并未有一款對于GPCR功能有調(diào)控作用的mAb藥物上市。目前獲批上市的靶向降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）的mAb藥物eptinezumab、galcanezumab和fremanezumab并沒有改變其受體的功能，而是通過阻斷CGRP與細胞表面的受體結(jié)合發(fā)揮作用治療偏頭痛[63]；此外，臨床應用的efalizumab等通過與細胞表面受體相互結(jié)合，產(chǎn)生占位效應，阻止內(nèi)源性配體與受體結(jié)合發(fā)揮治療作用。處于臨床試驗階段的mAb藥物目前已超過30款（見表1），其中有3款已被終止研發(fā)；另外，有近50款靶向MMP的mAb處于藥物發(fā)現(xiàn)及臨床前階段。

表1 部分靶向GPCR的單克隆抗體藥物*Table 1 Selected monoclonal antibodies targeting GPCR

續(xù)表1

2.1.2 針對GPCR的雙（多）特異性抗體研發(fā)進展得益于mAb生產(chǎn)和重組技術(shù)的改進，推動了抗體新形式——bsAb的發(fā)展。bsAb可以用于識別2種不同表位或抗原，其有多種形式存在，從僅由2個相連的抗原結(jié)合片段組成的相對較小的蛋白質(zhì)到帶有附加結(jié)構(gòu)域的大型免疫球蛋白G（IgG）樣分子。bsAb的主要作用機制包括：1）招募T細胞或自然殺傷細胞，與其進行交聯(lián)，導致免疫細胞重定向至靶細胞（多指腫瘤細胞），增強其對靶細胞的殺傷力；2）同時阻斷致病進程中2種不同的信號傳導通路，從而發(fā)揮獨特的或疊加的功能，影響靶細胞的生長增殖、存活及免疫逃逸等；3）同時靶向細胞表面不同的抗原或表位，增強其與靶細胞的特異性結(jié)合并直接殺傷靶細胞[64]。bsAb的作用機制提高了抗體的選擇性和親合力，改善了藥物的安全性和有效性，與2種mAb連用相比減少了開發(fā)成本。bsAb與靶抗原結(jié)合既可以是按照時間上的先后順序進行，也可以同時發(fā)生，允許bsAb以不同的作用機制發(fā)揮多種特定的生物學效應。

截至目前，僅有強生研發(fā)的一款靶向CD3×G蛋白偶聯(lián)受體5家族亞型D（GPRC5D）的雙抗——talquetamab（TALVEY?）于2023年8月獲FDA加速批準上市，成為全球范圍內(nèi)首個獲批上市的靶向GPRC5D的“現(xiàn)貨型”雙特異性T細胞結(jié)合抗體，能夠激活帶有CD3受體的T細胞，并誘導其殺傷GPRC5D+的MM細胞，用于治療復發(fā)或難治性MM成人患者[65]。2023年10月12日，強生遞交的talquetamab新臨床適應證試驗獲國內(nèi)默示許可。此外，另有2款bsAb——gefurulimab和tebotelimab進入Ⅲ期臨床試驗，7款進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（見表2），13款處于藥物發(fā)現(xiàn)階段，其中包括2款多特異性抗體（MBS314[66]和SCR8572[67]）。

表2 部分靶向GPCR的雙（多）特異性抗體*Table 2 Selected bispecific/multispecific antibodies targeting GPCRs

續(xù)表2

2.1.3 針對GPCR的Nb研發(fā)進展盡管mAb在臨床上成功用于腫瘤治療，但由于腫瘤滲透性等問題限制其在治療開發(fā)中的應用。Nb作為一種單域抗體，在具有強大的抗原靶向和結(jié)合能力同時，更容易滲透到組織中，適合靶向?qū)嶓w瘤的治療；Nb還可以有效地穿過血腦屏障，為腦部疾病的治療提供了一種新的方法；此外，Nb因其尺寸小可以更方便地設(shè)計成多價/多特異性Nb，以獲得更多用于治療的功能。Nb在保持對抗原的高結(jié)合親和力（達到皮摩爾級別）的同時，其較長且靈活的CDR3允許其與目標抗原的裂口和空腔結(jié)合，可以識別mAb難以識別的隱匿表位。Nb的另一個重要優(yōu)勢是易于生產(chǎn)制造，其制造成本較mAb顯著降低。Nb只有一個鏈內(nèi)二硫鍵的結(jié)構(gòu)域，與傳統(tǒng)mAb相比其折疊結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定；由于缺乏輕鏈以及重鏈，骨架中疏水性殘基被親水性殘基取代，Nb表現(xiàn)出比mAb更高的溶解度；這些特性允許對Nb進行比其他類型抗體更嚴苛的化學修飾。Nb缺乏可觸發(fā)與免疫原性相關(guān)的Fc結(jié)構(gòu)域，具有低免疫原性[68]。此外，Nb的人源化為長期治療提供了安全的選擇。因此，Nb在對于多種疾病的治療研究中受到廣泛關(guān)注。

Nb作為抗原相關(guān)識別和調(diào)節(jié)的下一代抗體衍生物，已經(jīng)開發(fā)出許多Nb并在不同階段的癌癥治療臨床試驗中進行評估。針對GPCR靶點，僅有2款Nb進入臨床試驗，分別是靶向CXC型趨化因子受體3（C-X-C chemokine receptor type 3，CXCR3）的BI655088和靶向CXCR4的AD-114/214。另有一款靶向CXCR4的Nb（ALX-0651）因管線優(yōu)先級問題已被放棄研發(fā)。目前，共有8款靶向GPCR的Nb處于臨床前/藥物發(fā)現(xiàn)階段（見表3）。

表3 部分靶向GPCR的在研納米抗體*Table 3 Selected investigational nanobodies targeting GPCRs

2.1.4 其他針對GPCR的抗體類藥物研發(fā)進展隨著生物技術(shù)的不斷革新，各種偶聯(lián)藥物（X-drug conjugates，XDC）不斷涌現(xiàn)，形成了萬物皆可偶聯(lián)的藥物發(fā)展態(tài)勢。針對GPCR藥物研發(fā)領(lǐng)域，以ADC、抗體多肽偶聯(lián)物（antibody-peptide conjugation，APC）的發(fā)展最為迅速。ADC通過化學連接子將細胞毒性藥物和mAb以合適的方法進行共價連接，偶聯(lián)物既結(jié)合了mAb高度特異性的靶向能力，又含有細胞毒性藥物的強效殺傷作用，實現(xiàn)精準高效消滅癌細胞的目的，已成為抗癌藥物研發(fā)的熱點之一[69]。多年來，對GPCR功能、靶向治療的持續(xù)研究意味著已經(jīng)有大量信息可以為靶向GPCR的ADC合理設(shè)計提供基礎(chǔ)。得益于抗體療法的蓬勃發(fā)展與GPCR結(jié)構(gòu)的廣泛解析，表明GPCR可作為ADC開發(fā)的理想抗原。目前，超過20款靶向GPCR的ADC處于臨床（前）階段。其中，禮新醫(yī)藥基于自身知識產(chǎn)權(quán)LX-ADC?技術(shù)平臺開發(fā)的LM-305已進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NCT05647512），該款ADC靶向GPRC5D，用于MM的治療[70]。此外，禮新醫(yī)藥就該款ADC于2023年5月12日和阿斯利康達成全球獨家授權(quán)協(xié)議，本次交易總值達6億美元。抗體與多肽進行位點特異性偶聯(lián)產(chǎn)生的APC多靶向于胰高血糖素樣肽-1受體（glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R），發(fā)揮激動劑活性，主要用于2型糖尿病、肥胖的治療[71]。此外，針對GPCR的嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）療法[72]、基于Nb的溶瘤病毒治療方法也在進一步的開發(fā)當中[73]。

2.2 針對離子通道的抗體類藥物

相比于GPCR，離子通道具有更加復雜的結(jié)構(gòu)，致使其抗體開發(fā)更具挑戰(zhàn)性[30]，目前主要在研抗體如表4所示。唯一一個進入臨床試驗的針對離子通道的抗體是針對基底細胞癌的抗非功能P2X嘌呤受體7（nonfunctional P2X purinoceptor 7，nfP2X7）受體抑制劑BIL-010t[74]，是一種多克隆抗體。P2X嘌呤受體7（P2X purinoceptor 7，P2X7）是一個胞外域較大的離子通道，較容易獲得針對其的抗體。該多克隆抗體在2016年完成Ⅰ期臨床試驗后[74]，并未啟動Ⅱ期臨床試驗。BIL-010t的研發(fā)機構(gòu)（Bioceptre International）進一步從多克隆抗體中篩選了1個mAb BIL-03s[75]，但其研究目前仍然停留在臨床前階段。

表4 部分靶向離子通道的在研抗體類藥物*Table 4 Selected investigational antibody therapeutics targeting ion channels

VGSC也是抗體藥物開發(fā)的熱門靶點，其中NaV1.7、NaV1.8和NaV1.9 被認為是鎮(zhèn)痛的靶點，然而，VGSC具有較少的胞外表位，且全長蛋白表達較為困難，為其抗體開發(fā)帶來了挑戰(zhàn)。目前，有多家公司針對這幾個離子通道展開了抗體的開發(fā)，其中Ucb Pharma、Regeneron公司采用傳統(tǒng)的多肽免疫的方法獲得的mAb親和力中等，但是未在臨床前試驗展示出鎮(zhèn)痛效果[76-77]。Shionogi公司用類似的方法獲得的1株mAb則在動物模型中展示出了一定的陣痛效果[78]，說明采用多肽免疫的方法，針對這類離子通道的抗體篩選頗具挑戰(zhàn)，但是通過選擇合適的抗原肽仍然可以獲得較好的抗體。Oblique Therapeutics和Visterra等公司聚焦于如何選擇更好的抗原表位用于離子通道的抗體發(fā)現(xiàn)[79]。另一方面，Abilita Therapeutics、Tetragenetics和Integral Molecular等多家公司采用新的全長膜蛋白表達技術(shù)[80-81]，來獲取針對VGSC的mAb。這些新技術(shù)有望解決離子通道的抗體開發(fā)難點，但這些抗體仍然處于早期發(fā)現(xiàn)階段尚未有其藥效研究結(jié)果公布。

除了上述2類靶點，NMDAR[82]、鈣釋放激活鈣調(diào)節(jié)因子1（calcium release-activated calcium channel protein 1，CRCM1，也稱ORAI1）[83]、TRPM8[84]和Kv1.3[85]，也被選為靶點進行藥物的開發(fā)，用以治療腫瘤、疼痛以及自身免疫系統(tǒng)疾病。針對這些離子通道的抗體開發(fā)，為后續(xù)同類的研究提供了重要的參考價值。

2.3 針對轉(zhuǎn)運蛋白的抗體類藥物

針對轉(zhuǎn)運蛋白的抗體發(fā)現(xiàn)主要集中在如下幾類靶點（見表5）。第1類是在腫瘤細胞中高表達的轉(zhuǎn)運蛋白。例如，2b型鈉依賴性磷酸鹽轉(zhuǎn)運體（sodium-dependent phosphate transport protein 2B，NaPi-2b，又稱SLC34A2）在非小細胞肺癌和卵巢癌中有異常表達，還與肺泡微石癥、低磷血癥、不孕癥、睪丸微石癥和其他惡性腫瘤（包括甲狀腺癌、乳腺癌等）有關(guān)[86-87]。 目前有多個在研項目針對這一靶點開發(fā)治療性的抗體、ADC或者抗體-核素偶聯(lián)物，其主要作用機制是通過靶向表達NaPi-2b的腫瘤細胞，并殺死這些細胞。目前進展較快的ADC藥物 Upifitamab Rilsodotin已進入Ⅲ期臨床試驗[88]。鋅轉(zhuǎn)運蛋白（zinc transporter，ZIP6，又稱SLC39A6或LIV-1）在胰腺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌和宮頸癌等腫瘤細胞中存在著過表達，從而成為對于抗體和ADC藥物的潛在候選靶點[89]。目前，默克、西雅圖基因等多家公司均致力于針對LIV-1的ADC藥物研發(fā)，其中，Ladiratuzumab vedotin已經(jīng)啟動Ⅱ期臨床試驗。膽堿轉(zhuǎn)運蛋白樣蛋白4（choline transporter-like protein 4，CTL4）在多種癌癥中上調(diào)，也被作為ADC的靶點進行藥物研發(fā)，其中ASG-5ME在完成了Ⅰ期臨床試驗后由于其較窄的治療窗導致沒有進入后續(xù)的臨床試驗[90]。在這些在研抗體類藥物中，抗體主要功能不是調(diào)控靶點功能，而是識別腫瘤細胞，并通過招募免疫細胞或者激活補體系統(tǒng)來介導針對腫瘤的殺傷。

表5 部分靶向轉(zhuǎn)運蛋白的在研抗體類藥物*Table 5 Selected investigational antibodies targeting transporters

谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白在多種腫瘤中高表達，并在腫瘤生長中起著關(guān)鍵作用。近年來，谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白的研究越來越受到重視，其中，多個研究團隊針對丙氨酸半胱氨酸絲氨酸轉(zhuǎn)運蛋白2（alanine-serinecysteine transporter 2，ASCT2，也稱SLC1A5）、由SLC7A5和SLC3A2二聚組成的L型氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白1（L-type amino acid transporter 1，LAT1）和胱氨酸-谷氨酸交換轉(zhuǎn)運蛋白（cystine/glutamate antiporter，xCT，也稱SLC7A11）開發(fā)了mAb或ADC。 針對這些氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的抗體，往往可以抑制其轉(zhuǎn)運功能，從而抑制腫瘤的生長；同時這些在研抗體或者ADC可以進一步的結(jié)合抗體介導的ADCC作用，或者通過遞送細胞毒性的小分子載荷，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞更有效的殺傷。

3E10 是一個從MRL/lpr紅斑狼瘡小鼠模型中分離出來的抗DNA抗體，其可以在相對無毒的條件下進入細胞核[91]，因此可以用于胞內(nèi)大分子遞送。后期研究證明該抗體通過與細胞膜上的平衡核苷轉(zhuǎn)運蛋白2（equilibrative nucleoside transporter 2，ENT2）結(jié)合進入細胞[92]，并可以通過該受體跨越血腦屏障進入腦部[93]。3E10的人源化抗體與視黃酸誘導基因蛋白1（retinoic acid-inducible 1，RIG 1）激動劑的偶聯(lián)物正在多個腫瘤中被評估其治療潛力[94]。

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporter member，GLUT）負責人體組織細胞的葡萄糖攝取，GLUT1，也稱SLC2A1，被認為是腫瘤、糖尿病和心肌梗死等疾病的治療靶點[95-99]。Avaxia Biologics公司開發(fā)了針對GLUT1的多克隆抗體，并利用自然界中在消化道穩(wěn)定的?？贵w形式，以期實現(xiàn)口服給藥。同時，Immix Biopharma公司利用GLUT1在激活的免疫細胞上表達量上調(diào)這一現(xiàn)象，使用抗GLUT1的抗體進行藥物的遞送。針對這一家族中的另一個轉(zhuǎn)運蛋白GLUT4，來自Integral Molecular的Tucker等[100]采用VLP作為膜蛋白表達的載體，并采用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得了構(gòu)象特異性的mAb，證明了mAb穩(wěn)定特定轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)象的可能性。

3 結(jié)語與展望

MMP作為潛在的治療靶點，對于多種疾病的治療具有重要的價值。近年來，針對MMP進行抗體藥物研發(fā)的不斷探索為該領(lǐng)域帶來了長足的進展。在臨床研究方面，針對GPCRs的mAbs的應用得到了極大的拓展。這些抗體藥物在腫瘤學、免疫學等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的治療潛力。同時，bsAb和抗體藥物復合物等下一代抗體藥物方法的出現(xiàn)，進一步豐富了對GPCR靶點的應用。 針對離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白的抗體藥物研究相對滯后，目前，針對這2類膜蛋白的抗體藥物研發(fā)仍然主要停留在臨床前的階段，但也在Nav1.7、NaPi-2b、LIV-1等靶點上顯示出了潛力。

雖然這一領(lǐng)域近年來已經(jīng)取得了可喜的進展，目前仍存在許多技術(shù)障礙需要克服。例如，胞外表位的可及性差、穩(wěn)定的全長蛋白制備困難、蛋白結(jié)構(gòu)動態(tài)性高、跨越血腦屏障能力差等。但是，隨著技術(shù)的不斷進步，已經(jīng)出現(xiàn)一些創(chuàng)新的方法來解決這些問題。例如，Nb的伸展的CDR區(qū)域給觸及凹形的抗原表位提供了可能。使用納米盤、類病毒納米顆粒等作為載體穩(wěn)定全長MMP，為解決MMP穩(wěn)定性問題提供了新的思路，降低針對MMP抗體開發(fā)的難度。采用蛋白工程使抗體在消化道穩(wěn)定，利用腦血管內(nèi)皮細胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等受體介導的轉(zhuǎn)胞吞作用設(shè)計的腦部遞送系統(tǒng)，也為針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗體藥物和口服抗體帶來新的契機。

近年來，隨著科學技術(shù)研究的深入，我們對膜蛋白的結(jié)構(gòu)和生物功能的理解取得了顯著進展，這為針對MMP的抗體設(shè)計提供了新的支持。針對MMP的結(jié)構(gòu)生物學研究為靶點表面可及表位的鑒定、蛋白構(gòu)象和功能之間的關(guān)聯(lián)提供了重要的參考信息，也為闡述抗體和靶點的相互作用，以及后續(xù)的抗體優(yōu)化提供了強大的工具。通過對MMP生物學的研究，我們可以更好地理解其在疾病中的作用和功能。這將為我們發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的治療策略提供重要的指導。

近年來，人工智能的發(fā)展對于MMP抗體設(shè)計起到了重要的推動作用。隨著深度學習、機器學習等技術(shù)的不斷進步，人工智能已經(jīng)能夠自動化地處理大量數(shù)據(jù)，并從中提取出有價值的信息。在抗體藥物設(shè)計中，人工智能可以通過對MMP的結(jié)構(gòu)和功能進行模擬和預測[101]，幫助研究者更好地理解這些蛋白質(zhì)的行為，從而設(shè)計出更有效的抗體藥物。同時，人工智能可能預測蛋白的動態(tài)構(gòu)象[102]，為MMP抗體設(shè)計提供了更豐富的結(jié)構(gòu)信息。人工智能的發(fā)展還推動了抗體藥物的智能化設(shè)計和優(yōu)化。通過深度學習和機器學習等技術(shù)，人工智能可以對抗體藥物的親和力、穩(wěn)定性和免疫原性等進行預測和優(yōu)化[103-104]。這種方法可以幫助研究者設(shè)計出更具有臨床應用價值的抗體藥物。

綜上所述，MMP作為潛在的治療靶點具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑｋS著我們對MMP生物學的深入理解、抗體篩選技術(shù)的成熟和新興技術(shù)的發(fā)展，我們有信心克服目前所面臨的技術(shù)障礙，開發(fā)出更加有效的治療策略和藥物。這些進展將為生物醫(yī)學領(lǐng)域的發(fā)展提供重要的推動力，為人類健康事業(yè)做出更大的貢獻。