余雯斌 徐曉淵 盛清

摘要： 為探究靈芝中miRNA對細(xì)胞衰老的干預(yù)作用及影響，利用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞（Human skin fibroblasts，HSF）構(gòu)建了細(xì)胞衰老模型，將靈芝特有的miRNA Glu-miR-01和Glu-miR-03轉(zhuǎn)染HSF衰老細(xì)胞，分析細(xì)胞衰老相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)，并通過Western blotting檢測衰老相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示：構(gòu)建HSF細(xì)胞衰老模型的最適條件為H2O2濃度0.8 mmol/L，誘導(dǎo)時間3 h；Glu-miR-01和Glu-miR-03均能促使衰老細(xì)胞中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和總抗氧化能力（Total antioxidant capacity， T-AOC）水平上升，丙二醛（Malondialdehyde，MDA ）含量下降，細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（Senescence associated-β-Galactosidase，SA-β-gal）染色陽性率降低，線粒體膜電位升高；衰老信號通路中P53、P21和P16蛋白的表達(dá)顯著降低，Rb蛋白表達(dá)顯著升高。該結(jié)果表明靈芝中Glu-miR-01和Glu-miR-03對HSF衰老細(xì)胞具有保護(hù)作用，并對衰老相關(guān)的p53/p21/Rb信號通路具有調(diào)控作用，為闡明靈芝miRNA對細(xì)胞衰老的分子作用機制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 靈芝；miRNA；過氧化氫；氧化應(yīng)激；細(xì)胞衰老；p53/p21/Rb信號通路

中圖分類號： Q936

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號： 1673-3851 （2024） 01-0120-10

引文格式：余雯斌，徐曉淵，盛清. 靈芝miRNA對人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的作用研究［J］. 浙江理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)），2024，51（1）：120-129.

Reference Format： YU ?Wenbin，XU ?Xiaoyuan，SHENG ?Qing. Effect of Ganoderma lucidum miRNA on the senescence of human skin fibroblasts［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2024，51（1）：120-129.

Effect of Ganoderma lucidum miRNA on the senescence of human skin

fibroblasts

YU ?Wenbin，XU ?Xiaoyuan，SHENG ?Qing

（College of Life Sciences and Medicine， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract： ?To investigate the intervention effect and impact of miRNA in Ganoderma lucidum （G. lucidum） on cell aging， we used hydrogen peroxide （H2O2） to induce human skin fibroblasts （HSF） and constructed a cell senescence model. The HSF senescent cells were transfected with miRNA Glu-miR-01 and Glu-miR-03， which were unique to G. lucidum， and the oxidative stress indexes related to cell aging were analyzed. The change of the expression levels of age-related proteins was detected by Western blotting. The results indicated that the optimal conditions for establishing the HSF cell senescence model were 0.8 mmol/L H2O2 and 3 h induction time. Both Glu-miR-01 and Glu-miR-03 could enhance the activity of superoxide dismutase （SOD） and total antioxidant capacity（T-AOC）， reduce the content of malondialdehyde （MDA）， decrease the positive rate of senescence-β-galactosidase （SA-β-gal） staining and increase mitochondrial membrane potential in senescence cells. In the aging signaling pathway， the expression of P53， P21 and P16 proteins was significantly downregulated， while the expression of Rb protein was significantly upregulated. These findings suggest that Glu-miR-01 and Glu-miR-03 from G. lucidum exert protective effects on HSF senescent cells， and regulate the p53/p21/Rb signaling pathway associated with aging. This provides a theoretical basis for elucidating the molecular mechanism of G. lucidum miRNA on cell senescence.

Key words： Ganoderma lucidum; miRNA; hydrogen peroxide; oxidative stress; cell senescence; p53/p21/Rb signaling pathway

0引言

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種大型藥用真菌，擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬［1］。靈芝作為藥食同源的傳統(tǒng)中藥已有兩千多年的歷史，具有滋補強壯、延年益壽等功效，對多種不同疾病都有有益作用［2］。目前，對靈芝發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理研究主要集中在靈芝多糖、靈芝三萜及部分甾醇類物質(zhì)等領(lǐng)域［3-5］，而對其核酸、蛋白質(zhì)等初級代謝產(chǎn)物尤其是各種RNA的活性研究相對較少［6-10］。microRNA（miRNA）是一類含有18～25個核苷酸的非編碼小RNA（Non-coding small RNA），在動植物和微生物中普遍存在，能夠調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化和衰老等過程中起著重要的作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與不同細(xì)胞類型和環(huán)境老化過程，可作為重要的衰老生物學(xué)標(biāo)志物［12］；miR-126等25種外泌體miRNA對血管細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、炎癥和分化等衰老相關(guān)功能具有調(diào)控作用［13］。miRNA通過p53/p21/Rb通路、p16-pRb通路、PI3K/AKT/mTOR通路和SIRT1通路等多個與細(xì)胞衰老相關(guān)的信號通路參與細(xì)胞衰老的生物過程［14-15］。在衰老過程中，miRNA的表達(dá)改變與包括癌癥和心血管疾病在內(nèi)的衰老性疾病有關(guān)，使用miRNA的治療方法將促進(jìn)衰老相關(guān)疾病的治療或預(yù)防［16-17］。

2012年，Zhang等［18］首次發(fā)現(xiàn)，植物miRNA可以通過口服攝入調(diào)控人體內(nèi)的基因表達(dá)；自此以來，越來越多的證據(jù)表明，外源miRNA可以調(diào)控動物體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮重要的生物學(xué)作用［19］。通過連續(xù)灌胃可顯著增加小鼠外周血和肺中金銀花miR2911的表達(dá)量，且合成的 miR2911 模擬物能顯著抑制H1N1 病毒的復(fù)制［20］；紅景天煎煮液中的miRNA在體內(nèi)和體外實驗中均表現(xiàn)出較強的抗纖維化作用等［21］。Huang等［22］在對10種草藥的研究中發(fā)現(xiàn)，每種草藥中有大量小RNA能夠進(jìn)入哺乳動物的血液和肺部，能以序列特異性的方式對哺乳動物基因進(jìn)行跨界調(diào)控。

靈芝具有極高的藥用價值，是延緩衰老的珍品［23］；《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，靈芝“久服輕身不老，延年神仙”［24］。現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝多種活性成分具有延緩衰老的作用［25］，但其延緩衰老的分子機制尚有待進(jìn)一步闡明。中藥miRNA可以發(fā)揮跨界調(diào)控作用，那么靈芝中的miRNA對衰老會有怎樣的作用和影響？Li等［26］首次報道了靈芝miRNA的鑒定研究，從靈芝子實體中分離并確證了132個已知miRNA和34個靈芝特有的miRNA；靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，靈芝中的miRNA針對人生命過程的靶基因多達(dá)111個，多數(shù)miRNA具有不止一個靶基因，或一個靶基因可以受多個miRNA調(diào)控，而豐度較高的靈芝特有miRNA Glu-miR-01、Glu-miR-03能夠靶向與衰老相關(guān)信號通路中的關(guān)鍵基因。

本文研究靈芝特有miRNA Glu-miR-01，Glu-miR-03對細(xì)胞衰老的作用。通過探究靈芝miRNA模擬物（miRNA mimics）對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的作用，檢測其對細(xì)胞衰老相關(guān)指標(biāo)的變化、衰老相關(guān)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平的影響等，探明靈芝miRNA作為靈芝新活性成分對延緩細(xì)胞衰老的作用及機制，為闡明靈芝miRNA跨界調(diào)控的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1實驗部分

1.1材料

1.1.1細(xì)胞

人皮膚成纖維HSF細(xì)胞（美國模式培養(yǎng)物集存庫，ATCC）。

1.1.2miRNA模擬物

Glu-miR-01模擬物（Glu-miR-01 mimics）、Glu-miR-03模擬物（Glu-miR-03 mimics）和陰性對照（Negative control）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）按表1中序列制備。

1.1.3試劑

3%過氧化氫（H2O2）、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和胰酶（Trypsin）（美國Sigma公司），DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗（青霉素、鏈霉素）和PBS（維森特生物技術(shù)（南京）有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒和總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所），胎牛血清（美國Gibco公司），細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色試劑盒、線粒體膜電位（JC-1）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），ECL顯色液（美國Advansta公司），LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司），SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.1.4抗體

p53（DO-1）抗體（1∶500）、p16INK4a（JC8）抗體（美國Santa Cruz公司，1∶500），p21Waf1/Cip1（DCS60）抗體（1∶2000）、Rb（4H1）抗體（美國Cell Signaling Technology公司，1∶2000），α-tubulin抗體（1∶5000）和羊抗兔IgG（HRP標(biāo)記，美國Proteintech公司，1∶5000）。

1.2HSF細(xì)胞衰老模型的構(gòu)建

采用H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞的方法構(gòu)建氧化應(yīng)激導(dǎo)致的HSF細(xì)胞衰老模型，具體參見文獻(xiàn)［27］。將HSF細(xì)胞鋪板過夜，設(shè)置H2O2濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L和1.2 mmol/L，H2O2誘導(dǎo)的時間梯度為3、6、12 h和24 h，對 HSF 細(xì)胞進(jìn)行 H2O2 誘導(dǎo)；經(jīng)不同濃度、不同時間誘導(dǎo)后，觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，采用MTT實驗檢測細(xì)胞活力的變化，以確定H2O2最適濃度與誘導(dǎo)時間；收集細(xì)胞后檢測SOD、MDA和T-AOC等氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，以確定HSF細(xì)胞衰老模型的成功構(gòu)建。

1.3細(xì)胞中靈芝miRNA表達(dá)量的檢測

將靈芝miRNA mimics轉(zhuǎn)染HSF細(xì)胞后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，以總RNA為模板，使用特異性莖環(huán)引物，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。快速啟動通用SYBR Green Master的RT-qPCR程序，程序設(shè)置為：95 ℃處理10 min，然后95 ℃處理15 s，隨后轉(zhuǎn)為60 ℃處理15 s，最后72 ℃處理30 s，共40個循環(huán)，以人源5.8 S 為內(nèi)參檢測miRNA的相對表達(dá)量。莖環(huán)引物和反轉(zhuǎn)錄引物序列見表2。使用ABI 7500 Software（V2.3）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4靈芝miRNA對衰老細(xì)胞活力影響的檢測

采用MTT法評價Glu-miR-01和Glu-miR-03對H2O2誘導(dǎo)的HSF衰老細(xì)胞的活力影響。將HSF細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為2.5×104/孔。用質(zhì)量濃度為0.75、3.5 μg/mL和7.5 μg/mL的Glu-miR-01 mimics、Glu-miR-03 mimics和對應(yīng)陰性對照，分別轉(zhuǎn)染HSF細(xì)胞，每個濃度6個復(fù)孔。參照LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作：取HSF細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染試劑、Glu-miR-01 mimics、Glu-miR-03 mimics以及陰性對照分別用無血清DMEM培養(yǎng)液按說明書比例稀釋混勻。將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑分別與已稀釋的Glu-miR-01 mimics/Glu-miR-03 mimics/陰性對照按照1∶1比例混勻。室溫靜置孵育15～20 min。將孵育充分的混合物分別加入設(shè)定孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含有0.8 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基；誘導(dǎo)3 h后吸去培養(yǎng)基，再加入濃度為5 mg/mL的20 μL MTT溶液，在CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育4 h后加入150 μL DMSO溶液，搖勻，待結(jié)晶充分溶解后，使用酶標(biāo)儀于波長570 nm處測定每個孔的吸光度值（OD）。細(xì)胞活力（Cell viability， CV）計算如式（1）所示：

CV/%=OD實驗OD對照×100（1）

其中：CV為細(xì)胞存活率，%；OD實驗為實驗組在570 nm處的吸光度；OD對照為對照組570 nm處的吸光度。

1.5衰老相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)和細(xì)胞SA-β-gal的檢測

氧化應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞衰老的特征性指標(biāo)主要包括SOD、MDA和T-AOC等［28］。SOD是生物體內(nèi)清除超氧陰離子自由基的一種重要的抗氧化酶，可以保護(hù)氧自由基機體免受氧自由基的損害；MDA是脂質(zhì)與氧自由基形成的產(chǎn)物之一，其含量代表脂質(zhì)過氧化的程度；T-AOC是指各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平，用于評價生物活性物質(zhì)的抗氧化能力。選擇培養(yǎng)的HSF細(xì)胞接種于6孔板，使每孔細(xì)胞密度為 1×106個，分為0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)的模型組、實驗組即0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)+轉(zhuǎn)染Glu-miR-01 mimics（Glu-miR-03 mimics）的Glu-miR-01組（Glu-miR-03組）、0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)+轉(zhuǎn)染陰性對照的陰性對照組，在轉(zhuǎn)染miRNA mimics 24 h后，吸去舊培養(yǎng)基，每組都分別加入1 mL含有0.8 mmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行SOD、MDA和T-AOC等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測。

細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是檢測細(xì)胞衰老的常用指標(biāo)，利用衰老細(xì)胞中SA-β-gal活性水平上升進(jìn)行細(xì)胞染色［29］。正常細(xì)胞中僅觀察到零星的SA-β-gal陽性細(xì)胞；研究發(fā)現(xiàn)，長時間暴露于H2O2可導(dǎo)致細(xì)胞過早衰老，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖受到抑制，SA-β-gal染色增強［30］。細(xì)胞衰老相關(guān)SA-β-gal的檢測參照以上分組并按照試劑說明書進(jìn)行。

1.6細(xì)胞線粒體膜電位的檢測

線粒體膜電位（ΔΨm）用于評估線粒體的活力，線粒體膜電位ΔΨm的變化反映細(xì)胞衰老變化。熒光探針JC-1可用于檢測線粒體膜電位ΔΨm，細(xì)胞活力強時，ΔΨm較高，呈現(xiàn)紅色熒光，而ΔΨm較低時呈綠色熒光，提示細(xì)胞衰老凋亡［29］。選擇培養(yǎng)的HSF細(xì)胞接種于6孔板，使每孔細(xì)胞密度為 1×106個，分為正常細(xì)胞的正常組、0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)的模型組、實驗組即0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)+轉(zhuǎn)染Glu-miR-01 mimics（Glu-miR-03 mimics）的Glu-miR-01（Glu-miR-03）組、0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)+轉(zhuǎn)染陰性對照的陰性對照組，在轉(zhuǎn)染miRNA mimics 24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，除正常組外分別加入含有0.8 mmol/L濃度H2O2的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后使用線粒體膜電位試劑盒檢測每組細(xì)胞的線粒體膜電位ΔΨm變化。

1.7細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)量的檢測（Western blotting）

細(xì)胞衰老的作用機制包括p53、p21Cip1/Waf1、p16INK4a等衰老相關(guān)分子標(biāo)志物的調(diào)控，以及Rb蛋白的磷酸化狀態(tài)（pRb /tRb）等［31］。p53受到DNA損傷和端粒侵蝕的刺激，導(dǎo)致P21表達(dá)增加，Rb蛋白去磷酸化，最終導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制性衰老［32］。P53的失活則促進(jìn)衰老細(xì)胞的增殖，而P21缺乏則延緩衰老過程，提示p53/p21/Rb通路可能是調(diào)控細(xì)胞衰老的主要途徑之一。選擇在培養(yǎng)的HSF細(xì)胞，將Glu-miR-01 mimics和Glu-miR-03 mimics轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，24 h后加入0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞，3 h后收集細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液提取總蛋白。采用 SDS-PAGE分離總蛋白，用免疫印跡法將總蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶與吐溫（pH 7.4）在室溫下封閉2 h后，用p53抗體、p16INK4A抗體、p21Waf1/Cip1抗體、Rb抗體在4 ℃過夜孵育，以羊抗兔IgG（HRP標(biāo)記）作為二抗，使用ECL顯色液檢測蛋白表達(dá)。

1.8統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)都是以平均值±SD表示3個獨立實驗的平均值，采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行單因素方差A(yù)檢驗和LSD檢驗。當(dāng)p值<0.05時，差異顯著。

2結(jié)果與討論

2.1H2O2誘導(dǎo)HSF細(xì)胞衰老模型的細(xì)胞活力變化

細(xì)胞衰老是由細(xì)胞內(nèi)氧自由基堆積產(chǎn)生導(dǎo)致［33］，正常有氧代謝產(chǎn)生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）對生物分子造成損害，并最終導(dǎo)致組織功能下降和衰老［34］。氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞衰老一直被視為衰老研究中經(jīng)典的體外模型，H2O2是產(chǎn)生ROS的主要成分，H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可引起人體皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷［35］。圖1為不同濃度H2O2誘導(dǎo)下HSF細(xì)胞的活力變化。圖1表明：當(dāng)H2O2的濃度大于等于1.0 mmol/L時，經(jīng)3 h誘導(dǎo)后細(xì)胞存活率CV約為50%，但經(jīng)6 h以上誘導(dǎo)后，細(xì)胞存活率CV逐漸降低至20%以下，細(xì)胞大多數(shù)已經(jīng)死亡。通過比較，最終選擇0.8 mmol/L為最適濃度，3 h為最適作用時間，確定為H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激構(gòu)建細(xì)胞衰老模型的最適條件。

2.2HSF細(xì)胞衰老模型中氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

圖2為H2O2刺激下HSF細(xì)胞內(nèi)各氧化應(yīng)激指標(biāo)含量的變化。由圖2可知，相比于正常細(xì)胞組，在0.8 mmol/L H2O2誘導(dǎo)3 h的模型組中，SOD和T-AOC的水平顯著降低（p<0.01），而MDA含量相對于正常組顯著增加（p<0.05）。這些氧化應(yīng)激指標(biāo)的顯著改變，表明采用0.8 mmol/L H2O2、處理3 h的條件進(jìn)行誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞衰老模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗。

2.3靈芝miRNA在HSF細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率

因為陰性對照組帶有熒光標(biāo)記（FAM），并且其核酸結(jié)構(gòu)與合成的miRNA mimics相似，所以其熒光強度可以近似反映出Glu-miRNA的轉(zhuǎn)染效率，圖3為轉(zhuǎn)染miRNA mimics 后細(xì)胞熒光強度，以及Glu-miR-01和Glu-miR-03在HSF細(xì)胞中的相對表達(dá)水平，由圖3（a）—（b）可知，Glu-miRNA的轉(zhuǎn)染效率相對較高；如圖3（c）—（d） 相對表達(dá)水平檢測實驗結(jié)果顯示，相比于對照組，實驗組中Glu-miR-01 和Glu-miR-03表達(dá)水平都有顯著升高，表明HSF細(xì)胞中Gas-miR-01 和Glu-miR-03都有較高的轉(zhuǎn)染效率。

2.4靈芝miRNA對HSF衰老細(xì)胞活力的影響

為了探究轉(zhuǎn)染靈芝miRNA對HSF細(xì)胞模型的影響是否具有劑量依賴性，在轉(zhuǎn)染不同濃度miRNA mimics后，對H2O2誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞模型細(xì)胞活力的變化進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，相比于只有正常細(xì)胞的正常組，模型組的HSF細(xì)胞由于一定濃度H2O2的誘導(dǎo)，細(xì)胞存活率CV明顯下降至正常組的50%～60%；而轉(zhuǎn)染靈芝miRNA mimics實驗組相比于模型組的細(xì)胞存活率明顯升高，并且不同濃度的Glu-miR-01mimics組細(xì)胞存活率CV顯著高于陰性對照組（p<0.01）；Glu-miR-03組具有相似的作用效果（p<0.05），說明轉(zhuǎn)染的靈芝miRNA mimics可以逆轉(zhuǎn)HSF的細(xì)胞活力，而跟劑量無關(guān)。

2.5靈芝miRNA對HSF衰老細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)和衰老細(xì)胞SA-β-gal生成的影響

圖5和圖6分別為Glu-miR-01、 Glu-miR-03對H2O2誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞模型各個氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響結(jié)果。圖5表明：相較于H2O2誘導(dǎo)后HSF細(xì)胞的SOD和T-AOC活性降低，MDA含量升高，轉(zhuǎn)染了靈芝miRNA mimics的HSF衰老細(xì)胞相應(yīng)氧化應(yīng)激指標(biāo)發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染Glu-miR-01 mimics組SOD活力相對于只加入H2O2誘導(dǎo)的模型組顯著升高（p<0.01），而MDA含量顯著降低（p<0.01），T-AOC則明顯上升（p<0.05）。由圖6可知：Glu-miR-03 與 Glu-miR-01 具有一致的作用效果，SOD、MDA和 T-AOC 的變化亦呈顯著性差異（p<0.05）。

SA-β-gal活性變化結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：H2O2誘導(dǎo)的模型組中SA-β-gal染色陽性細(xì)胞顯著增加，而轉(zhuǎn)染Glu-miR-01 mimics和轉(zhuǎn)染Glu-miR-03 mimics的HSF衰老細(xì)胞中SA-β-gal陽性占比均明顯低于模型組。這說明靈芝特異miRNA對緩解HSF細(xì)胞衰老具有一定作用。

2.6靈芝miRNA對HSF衰老細(xì)胞中線粒體膜電位ΔΨm的影響

圖8為靈芝miRNA對HSF細(xì)胞衰老模型中線粒體膜電位ΔΨm的影響結(jié)果。圖8表明，正常細(xì)胞中，紅色占比較高，而經(jīng)H2O2處理的HSF中綠色熒光占比增加，表明衰老細(xì)胞增加，活力減弱，而經(jīng)Glu-miR-01 mimics和Glu-miR-03 mimics分別處理HSF衰老細(xì)胞后，紅色熒光增加，相比于模型組具有顯著差異（p<0.05），表明靈芝miRNA mimics 逆轉(zhuǎn)了HSF衰老細(xì)胞的線粒體活力。

2.7靈芝miRNA對HSF衰老細(xì)胞中p53/p21/Rb信號通路的作用

越來越多的研究［14］證實，miRNAs可以參與衰老相關(guān)的信號通路如p53/p21/Rb通路的調(diào)節(jié)。因此，本文探究了靈芝miRNA對HSF衰老細(xì)胞中p53/p21/Rb信號通路相關(guān)蛋白的作用影響。圖9為靈芝miRNA對H2O2誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞衰老模型中p53/p21/Rb信號通路上相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響結(jié)果。圖9表明：通過H2O2誘導(dǎo)的HSF衰老細(xì)胞所在模型相比于正常細(xì)胞組，P53、P21以及P16蛋白水平升高，Rb蛋白水平降低；轉(zhuǎn)染靈芝Glu-miR-01后，各蛋白表達(dá)水平發(fā)生了改變；相比于模型組，P53、P21和P16蛋白水平明顯下降，Rb蛋白水平顯著上升，結(jié)果由圖9（a）—（b）所示。轉(zhuǎn)染Glu-miR-03的結(jié)果與之一致，結(jié)果如圖9（c）—（d）所示。以上結(jié)果表明，靈芝miRNA mimics對衰老相關(guān)p53/p21/Rb信號通路的關(guān)鍵蛋白具有調(diào)控作用，提示靈芝特異miRNA可能通過調(diào)控p53/p21/Rb信號通路延緩HSF細(xì)胞衰老。

3結(jié)論

衰老是生命體發(fā)展必然的過程。氧化應(yīng)激和氧自由基的堆積參與了衰老的發(fā)生發(fā)展，與衰老相關(guān)的信號通路有著密切的關(guān)系。本文探究了以延緩衰老著稱的中藥靈芝中特異miRNA對細(xì)胞衰老的作用及影響，主要結(jié)論如下：

a）靈芝特異Glu-miR-01和Glu-miR-03能夠使HSF衰老細(xì)胞的SOD和T-AOC水平上升，MDA含量下降，并且能減少SA-β-gal陽性細(xì)胞的生成，提高衰老細(xì)胞的線粒體膜電位，從而增強細(xì)胞的抗氧化能力，對衰老細(xì)胞具有積極的修復(fù)作用。

b）靈芝Glu-miR-01和Glu-miR-03都能下調(diào)HSF衰老細(xì)胞中p53/p21/Rb信號通路上的關(guān)鍵蛋白P53、P21、P16表達(dá)，上調(diào)Rb蛋白的表達(dá)，證明靈芝Glu-miR-01和Glu-miR-03對衰老細(xì)胞的p53/p21/Rb信號通路具有調(diào)控作用。本文為闡明靈芝特異miRNA對延緩衰老的作用機制提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究靈芝miRNA跨界調(diào)控的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：張會巍）

收稿日期： 2023-05-29網(wǎng)絡(luò)出版日期：2023-07-14網(wǎng)絡(luò)出版日期

基金項目： 浙江省基礎(chǔ)公益研究計劃項目（LGF18H250004）

作者簡介： 余雯斌（1995—），男，杭州人，碩士研究生，主要從事中藥分子藥理方面的研究。

通信作者： 盛清，E-mail：csheng@zstu.edu.cn