趙勇強,袁家英,匡思穎,吳仕萍,張寧峰,黃統(tǒng)輝

(徐州醫(yī)科大學 江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室,江蘇 徐州 221000)

光動力療法(Photodynamic therapy,PDT)通過光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧(ROS)消融腫瘤細胞,是一種非侵入式的腫瘤治療新方法,具有毒性小、選擇性好、無耐藥性和可重復(fù)治療等突出優(yōu)點,抗腫瘤效果優(yōu)異[1-2]。已有多種光敏劑藥物,如光福啉(photofrin)、5-氨基酮戊酸(ALA)、亞甲基蘭(methylene blue)、血卟啉、喜泊芬和海姆泊芬等批準應(yīng)用于臨床治療皮膚癌、口腔癌、宮頸癌以及膀胱癌等疾病,顯示出良好的應(yīng)用前景[3-5]。光敏劑經(jīng)光觸發(fā)后可發(fā)生2種類型的光化學反應(yīng),即I型和II型[6-7]。相較于I型光化學反應(yīng),II型光化學反應(yīng)所產(chǎn)生的ROS壽命更長;相較于II型光化學反應(yīng),I型光化學反應(yīng)所需氧量相對較低[8]。因此,能同時發(fā)生I型和II型光化學反應(yīng)的光敏劑更有利于應(yīng)用于復(fù)雜的腫瘤環(huán)境,特別是缺氧的腫瘤環(huán)境[9-10]。

與正常組織細胞相比,腫瘤細胞微環(huán)境具有H2O2、HClO/ClO-和谷胱甘肽(GSH)含量高,缺氧及特殊酶過量表達等特點[11]。例如,HClO/ClO-是生物體內(nèi)的H2O2和Cl-在髓過氧化物酶(MPO)催化作用下產(chǎn)生的一種重要的活性物質(zhì),參與多種生理及病理過程,也是腫瘤等相關(guān)疾病的高表達物質(zhì)之一,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。因此,合理利用好這些區(qū)別,開發(fā)腫瘤環(huán)境響應(yīng)型的光敏劑,可以極大提高光動力治療的組織特異性,進而達到更加精準的診斷與治療的目的,具有重要的臨床應(yīng)用價值[14]。

酚噻嗪是一種含有氮和硫雜原子的芳香雜環(huán)化合物,具有較強的給電子能力和良好的光物理特性,其結(jié)構(gòu)中的硫原子能被HClO/ClO-選擇性地氧化為亞砜結(jié)構(gòu)[15]?；诖?本研究設(shè)計并合成了一種基于酚噻嗪結(jié)構(gòu)的ClO-響應(yīng)型光敏劑PTZPPy,響應(yīng)機制如圖1所示。其結(jié)構(gòu)包含酚噻嗪作為給電子基團,同時作為ClO-識別的片段。使用吡啶鹽片段作為強吸電子基團,使用C=C和苯環(huán),將酚噻嗪與吡啶鹽結(jié)構(gòu)相連,形成具有D-π-A結(jié)構(gòu)特征的分子結(jié)構(gòu),該化合物具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng),無明顯熒光信號[16-17]。但當其與ClO-反應(yīng)后,由于酚噻嗪中的硫原子被氧化為亞砜,導致ICT效應(yīng)減弱,熒光增強[18-19],起到“點亮”腫瘤組織的作用,可應(yīng)用于高表達ClO-的腫瘤檢測[20]。光照后,PTZPPy具有較好的ROS產(chǎn)生效率。使用取代的酚噻嗪(S-1)為原料,經(jīng)縮合、偶聯(lián)、成鹽等合成步驟得到目標產(chǎn)物PTZPPy(圖2),其結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和HR-MS(ESI)表征,體外抗腫瘤活性結(jié)果表明PTZPPy具有良好的抗腫瘤活性[21]。

圖1 PTZPPy對ClO-的響應(yīng)機制

圖2 化合物PTZPPy的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F4600型熒光分光光度計;JNM-ECZR 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6或CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標);Bruker maXis 4G UHR-TOF型質(zhì)譜儀。

所有試劑皆為分析純或化學純。

1.2 合成

(1) 化合物S-2的合成

將2-甲氧基-10-苯基-10H-吩噻嗪-3-甲醛(1.665 g,5.0 mmol)、t-BuONa(480.5 mg,5.0 mmol)和2-(4-溴苯基)乙腈(980.0 mg,5.0 mmol)溶解于30.0 mL乙腈溶液,在80 ℃下回流反應(yīng)3 h,薄層層析監(jiān)測反應(yīng)進程,待原料消耗完畢,將反應(yīng)液倒入50 mL水中,使用二氯甲烷(3×25.0 mL)萃取,用飽和食鹽水溶液洗滌有機層,有機層加入無水硫酸鈉干燥后脫溶。粗品經(jīng)硅膠柱層析純化(洗脫劑:石油醚∶乙酸乙酯=20∶1,V∶V)得到化合物S-2,收率61%,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.91(s,1H),7.76～7.60(m,3H),7.57～7.47(m,5H),7.42(d,J=8.0 Hz,2H),7.28～7.24(m,1H),7.05～6.99(m,2H),6.84(d,J=6.1 Hz,1H),6.17～6.10(m,1H),3.48(s,3H)。

(2) 化合物S-3的合成

將吡啶-4-硼酸(369.0 mg,3.0 mmol)溶解于5.0 mL甲醇溶液中,然后加入化合物1(1.020 g,2.0 mmol)、PdCl2(dppf)(146.0 mg,0.2 mmol)、K2CO3(29.2 mg,6.0 mmol)和1,4-二氧六環(huán)(25.0 mL),攪拌并在110 ℃下回流10 h。反應(yīng)完全后,將反應(yīng)液倒入50 mL水中,用二氯甲烷(3×25.0 mL)萃取,用飽和食鹽水溶液洗滌有機層,加入無水硫酸鈉干燥,粗品經(jīng)硅膠柱層析純化(洗脫劑:石油醚∶乙酸乙酯=2∶1,V∶V)得到化合物S-3,收率42%,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.68(s,1H),7.96(s,0H),7.83(s,1H),7.76(d,J=8.4 Hz,1H),7.67(dd,J=12.8 Hz,8.0 Hz,1H),7.54(d,J=5.6 Hz,1H),7.42(d,J=7.0 Hz,1H),7.07～6.98(m,1H),6.90～6.76(m,1H),6.18～6.09(m,1H),5.73(s,1H)。

(3) 化合物PTZPPy的合成

將化合物S-3(254.8 mg,0.5 mmol)溶解于5.0 mL乙腈溶液中,加入碘甲烷(71.0 mg,0.5 mmol),攪拌并在80 ℃下回流12 h。反應(yīng)完成后,過濾溶液。固體用乙酸乙酯洗滌并進一步真空干燥,得到黑色固體狀的PTZPPy,收率36%,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:9.02(d,J=6.8 Hz,2H),8.54(d,J=6.6 Hz,2H),8.19(d,J=8.6 Hz,2H),7.98(s,1H),7.89(d,J=8.4 Hz,2H),7.80(s,1H),7.75(t,J=7.6 Hz,2H),7.64(t,J=7.4 Hz,2H),7.53(d,J=7.4 Hz,1H),7.13(dd,J=7.2 Hz,2.0 Hz,1H),7.06～6.58(m,2H),6.12(dd,J=7.8 Hz,1.6 Hz,1H),5.82(s,1H),4.33(s,3H),3.49(s,3H);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:158.17,153.04,147.58,145.69,142.13,139.36,137.63,136.99,133.31,131.37,130.43,129.34,128.92,127.49,126.79,126.44,125.22,124.62,123.95,123.65,118.90,118.08,116.40,109.44,106.33,99.33,55.50,47.14; HR-MS(ESI) Calcd for C34H26N3OS[M]+:524.1791,found 524.1795。

2 結(jié)果與討論

2.1 光敏劑PTZPPy與ClO-響應(yīng)機制驗證及其光物理性質(zhì)

為探究光敏PTZPPy與ClO-的響應(yīng)機理,將化合物PTZPPy(15.0 mg,2.8 μmol)加入1 mL乙腈中溶解,攪拌狀態(tài)下逐滴加入NaOCl水溶液(其中含氯量5.5%～6.5%),使用365 nm紫外燈監(jiān)測,直至觀察到溶液由無熒光狀態(tài)完全轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色熒光狀態(tài)。使用二氯甲烷(3×25.0 mL)萃取反應(yīng)混合物,有機相用水洗滌,干燥,濃縮后得到棕色固體OPTZPPy。分別對PTZPPy與OPTZPPy進行高分辨質(zhì)譜表征,如圖3a所示,在m/z=524.1795處出現(xiàn)了PTZPPy的陽離子峰,如圖3b所示,在m/z=570.1742處片段與OPTZPPy的陽離子峰一致,說明PTZPPy中的硫原子在ClO-的氧化下轉(zhuǎn)化為亞砜結(jié)構(gòu)OPTZPPy。同時對光敏劑PTZPPy與OPTZPPy的光譜性質(zhì)進行了探究,將PTZPPy與OPTZPPy分別用乙腈配制成10 μM待測液后,測定二者的紫外-可見吸收光譜與熒光發(fā)射光譜(圖3c),PTZPPy的最大吸收波長為475 nm,在300～800 nm范圍內(nèi)無明顯熒光發(fā)射峰。相比較之下,OPTZPPy的最大吸收波長為410 nm,對應(yīng)的最大發(fā)射波長為605 nm,顯示出較大的Stokes位移(195 nm)。由于光敏劑PTZPPy與ClO-反應(yīng)后,酚噻嗪中的硫原子被氧化亞砜,導致分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)減弱,熒光強度明顯增加。

λ/nm

2.2 PTZPPy對ClO-的光譜響應(yīng)

為確定PTZPPy與ClO-的最佳響應(yīng)時間,在PTZPPy(10 μM)的PBS緩沖液(pH=7.4,PBS∶DMSO=99∶1,V∶V)中加入ClO-(1.0 mM),記錄其在605 nm處的熒光強度變化。如圖4a所示,隨著孵育時間增加,605 nm處的熒光強度逐漸增強,1 min后熒光強度基本保持不變。說明能夠在1 min內(nèi)與ClO-完成響應(yīng)。隨后配制PTZPPy(10 μM)的PBS緩沖液(pH=7.4,PBS∶DMSO=99∶1,V∶V)并加入不同濃度的ClO-,記錄熒光光譜變化,隨著ClO-濃度的增加,溶液在605 nm處的熒光強度逐漸增強(圖4b),并且ClO-的濃度在0～120 μM范圍與605 nm處的熒光強度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖4c),線性方程y=4.607x+258.207,R2=0.999,說明PTZPPy具有較好的靈敏度和定量檢測ClO-的能力。

Time/s

2.3 光敏劑PTZPPy的選擇性及OPTZPPy穩(wěn)定性

為驗證PTZPPy特異性響應(yīng)能力,向含有PTZPPy(5 μM)的PBS緩沖液中加入ClO-(100 μM)及其他干擾離子(100 μM)并分別測試其熒光光譜,如圖5(a)所示,只有在ClO-存在時605 nm處顯示出明顯的熒光增強,此結(jié)果說明PTZPPy對ClO-的檢測具有良好的特異性和抗干擾性,有助于觀察生物體內(nèi)ClO-在病理過程中的變化。為了驗證PTZPPy在不同pH值下是否穩(wěn)定,本文評估了其在不同pH值緩沖液中與ClO-的響應(yīng)能力。如圖5(b)所示,在pH=4～10范圍內(nèi),PTZPPy對ClO-的響應(yīng)基本穩(wěn)定,表明PTZPPy能夠應(yīng)用于大多數(shù)生物環(huán)境。如圖5(c)所示,使用20 mW cm-2的光照射OPTZPPy(5 μM)溶液,60 min后其熒光強度無明顯變化,24 h后略有衰減,表明PTZPPy與ClO-響應(yīng)后具有良好的光穩(wěn)定性。

pH

2.4 PTZPPy和OPTZPPy的ROS生成能力及類型

為了進一步研究光敏劑PTZPPy和OPTZPPy的ROS產(chǎn)生能力,選擇ROS指示劑2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)來驗證二者在光照下產(chǎn)生的總ROS,如圖6(a)所示,在20 mW cm-2的白光照射下,隨著光照時間的增加,500～650 nm范圍內(nèi)的熒光逐漸增強。說明PTZPPy和OPTZPPy在光照下均能產(chǎn)生ROS。使用9,10-蒽二甲酰基-雙(亞甲基)-二丙二酸(9,10-Anthracenediyl-bis(methylene)dimalonic Acid,ABDA)作為指示劑,測定了PTZPPy和OPTZPPy在光照下產(chǎn)生ROS的類型。ABDA被1O2氧化后會形成內(nèi)過氧化物,吸光度下降,應(yīng)用于II型ROS的檢測。如圖6(b)所示,隨著照射時間的延長,PTZPPy和OPTZPPy的吸光度逐漸下降。說明PTZPPy和OPTZPPy在光照下,均能產(chǎn)生1O2且相較于臨床上應(yīng)用的光敏劑藥物孟加拉玫瑰紅(RB),能夠更高效地產(chǎn)生1O2。使用二氫羅丹明123(DHR123)測試PTZPPy與OPTZPPy產(chǎn)生I型ROS能力,如圖6(c)所示,添加PTZPPy與OPTZPPy后,隨著照射時間的增加,DHR123熒光信號逐漸增強,加入清除劑VC后,隨著時間的增加,熒光強度明顯下降,說明PTZPPy與OPTZPPy具有產(chǎn)生I型ROS的能力。以上結(jié)果證明PTZPPy與OPTZPPy不僅具有產(chǎn)生ROS的能力,而且可以同時產(chǎn)生I型和II型ROS。

Time/s

2.5 抗腫瘤活性

采用CCK8法測試了PTZPPy與OPTZPPy對4T1細胞的光、暗毒性,將不同濃度的化合物加入到4T1細胞培養(yǎng)液中,孵育12 h后使用20 mW cm-2白光照射15 min,進一步孵育10 h后加入CCK8,2 h后使用酶標儀測定細胞液在450 nm處的吸光度。如圖7所示,PTZPPy與OPTZPPy在黑暗條件下的細胞毒性相對較低,表明它們良好的生物相容性。相反,在白光照射下,細胞活力逐漸迅速下降,10 μM的PTZPPy與OPTZPPy均可導致大多數(shù)4T1細胞的死亡,說明PTZPPy與OPTZPPy均具有較好的PDT抗腫瘤活性。

Concentration/μM

3 結(jié)論

本工作構(gòu)建了一種基于酚噻嗪的ClO-響應(yīng)型光敏劑PTZPPy,并將其應(yīng)用于細胞水平上的光動力治療研究。PTZPPy無熒光,當與ClO-反應(yīng)后生成OPTZPPy,熒光強度明顯增強,顯示出一種熒光開啟的效應(yīng),且具有較好的穩(wěn)定性及較高的靈敏度。對PTZPPy及OPTZPPy的ROS產(chǎn)生能力測試結(jié)果表明:在光照條件下PTZPPy和OPTZPPy均能產(chǎn)生I型和II型2種類型的ROS,其中PTZPPy產(chǎn)生ROS以II型為主,OPTZPPy產(chǎn)生的ROS以I型為主?？鼓[瘤活性結(jié)果表明,PTZPPy與OPTZPPy無光照條件下毒性較低,具有較好的生物相容性,在光照條件下具有良好的體外抗腫瘤活性。作為一種新的ClO-響應(yīng)型光敏劑,PTZPPy在熒光引導的光動力治療方面具有較大的應(yīng)用潛力和研究價值。