鄒喬 李雁 陳瑜 孔煜榮 陳一凡 劉通 曾燕鵬 沈冠彤

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由肺內(nèi)/肺外原因沖擊所導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭,臨床表現(xiàn)為頑固性低氧血癥和呼吸窘迫等,病死率超過40%[1]。臨床治療以肺保護(hù)通氣和保守液體管理為主,至今仍無特異性治療策略[2]。盡管其發(fā)病機(jī)制尚不明確,但大多數(shù)研究認(rèn)為以中性粒細(xì)胞為主的促炎細(xì)胞大量活化,跨內(nèi)皮遷移至肺間質(zhì)、肺泡腔內(nèi),釋放過量炎性介質(zhì),介導(dǎo)肺泡—毛細(xì)血管通透性破壞,是ARDS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。其中,中性粒細(xì)胞粘附是跨內(nèi)皮遷移的必要條件,也是誘導(dǎo)ARDS炎癥早期反應(yīng)的重要節(jié)點(diǎn)[4]。

Rap1b是小G蛋白R(shí)as家族的重要成員,是調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞粘附的重要蛋白,主要通過激活整合素變構(gòu)介導(dǎo)中性粒細(xì)胞粘附過程[5-6]。益氣化瘀解毒方是國家級(jí)名老中醫(yī)、首都國醫(yī)名師杜懷棠教授總結(jié)多年診療ARDS經(jīng)驗(yàn)所得的臨床效方。前期研究表明益氣化瘀解毒方可顯著改善脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的ARDS模型大鼠肺組織損傷,并調(diào)節(jié)炎癥通路蛋白及炎癥因子[7-9]。本研究擬觀察益氣化瘀解毒方對(duì)ARDS大鼠中性粒細(xì)胞粘附的影響,以期進(jìn)一步探討益氣化瘀解毒方在ARDS肺損傷以及炎癥過程中的保護(hù)作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠,6～7周齡,體質(zhì)量(180±10)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2019-0008。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障實(shí)驗(yàn)室,每籠6只,普通飲食,溫度22～24℃,濕度50%～70%。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審批通過(審批編號(hào):19-54)。

1.2 藥物、試劑與儀器

益氣化瘀解毒方(黃芪30 g、三七10 g、赤芍15 g、炒枳實(shí)12 g、金銀花15 g、黃芩10 g、桑白皮15 g、葶藶子15 g)、益氣化瘀解毒方拆方“益氣清熱方”(黃芪30 g、黃芩10 g、金銀花15 g)、拆方“益氣化瘀方”(黃芪30 g、三七10 g、赤芍15 g)及拆方“益氣逐飲方”(黃芪30 g、葶藶子15 g、桑白皮15 g、炒枳實(shí)12 g),由中國中醫(yī)科學(xué)院藥物研究所提供并制成中藥浸膏,批號(hào):20191030。

大腸桿菌脂多糖LPS(Sigma,L6511);Rap1b rabbit polyclonal antibody(Proteintech,10840-1-AP);大鼠Rap1b、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(leukocyte function-associated antigen-1,LFA-1)、巨噬細(xì)胞表面抗原-1(macrophage surface antigen-1,MAC-1) ELISA試劑盒(MB-7121A/ MB-7115A/ MB-7119A,江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司);BH2光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS);高速離心機(jī)(Thermo); Varioskan Flash光譜掃描多功能讀數(shù)儀(Thermo Scientific)。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、益氣清熱組、益氣化瘀組、益氣逐飲組、中藥全方組,每組6只。結(jié)合既往實(shí)驗(yàn)研究確定的最佳給藥劑量,按12.2 g/(kg·d)(給藥劑量為生藥劑量)用蒸餾水將中藥浸膏配制為中藥溶液,益氣清熱組、益氣化瘀組、益氣逐飲組、中藥組給予對(duì)應(yīng)中藥浸膏灌胃,連續(xù)灌胃7天;對(duì)照組及模型組給予等劑量蒸餾水灌胃,每日1次,連續(xù)灌胃7天。

1.4 ARDS大鼠模型制備

結(jié)合既往實(shí)驗(yàn)研究確定的最佳造模時(shí)間及劑量,在第7天灌胃6小時(shí)后,模型組和各中藥給藥組給予尾靜脈注射LPS(2 mg/kg)制備ARDS模型,對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行尾靜脈注射。六組均于注射16小時(shí)后以3%戊巴比妥鈉(0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉,進(jìn)行取材。

1.5 樣本取材

分別收集各組肺組織,步驟如下:大鼠開胸,生理鹽水灌注后取肺組織,右下肺用10%多聚甲醛溶液固定用于組織病理學(xué)檢測(cè),右上肺置于無RNA酶EP管,凍于-80℃冰箱保存,左肺則用于收集肺泡灌洗液。分別收集各組肺泡灌洗液,步驟如下:開胸結(jié)扎右肺門后,用PBS反復(fù)清洗左肺3次,回收所有沖洗液,然后將沖洗液離心(4℃,3 000r/min)10分鐘,取上清液置于-80℃冰箱中保存。

1.6 組織病理學(xué)形態(tài)檢測(cè)

取保存于10%多聚甲醛溶液中的右下肺組織,脫水后進(jìn)行石蠟包埋。采用蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察肺組織病理學(xué)形態(tài)變化。

1.7 ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液和肺勻漿中Rap1b、LFA-1、MAC-1蛋白表達(dá)水平

采用ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中Rap1b、LFA-1及MAC-1含量,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒中說明書操作。將凍存的肺組織室溫解凍,加入冰鹽水進(jìn)行漂洗后用濾紙吸干,稱重;按重量(g)∶體積(mL)為1∶9的比例加入勻漿介質(zhì),在冰浴條件下快速將肺組織塊剪碎,手動(dòng)勻漿6～8次,制備10%的肺組織勻漿。然后將肺組織勻漿離心(4℃,2 500r/min)10分鐘,取上清液,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒中說明書操作。

1.8 Western blotting法檢測(cè)肺勻漿中Rap1b表達(dá)水平

研磨剪碎的肺組織,4℃、10 000 r/min離心15分鐘,取上清液,BCA法檢測(cè)總蛋白濃度并配平,加入蛋白上樣緩沖液,100℃沸水浴5分鐘。制備分離膠和濃縮膠,進(jìn)行蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)模分離目標(biāo)蛋白,5%的脫脂奶粉封閉搖床1小時(shí)。加入一抗稀釋液(1∶2 000),使其充分浸泡,4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,每次10分鐘,加入相應(yīng)稀釋二抗(1∶10 000),于24℃恒溫?fù)u床孵育1小時(shí),TBST洗膜3次,每次10分鐘,ECL法顯影成像并分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)情況

HE染色顯示,對(duì)照組大鼠的肺組織病理可見肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整,肺泡腔及肺間質(zhì)無充血水腫,未見炎性細(xì)胞浸潤;模型組大鼠肺泡及肺間質(zhì)水腫明顯,肺泡壁增厚,部分肺泡塌陷,伴隨有大量炎性細(xì)胞浸潤;各拆方組較模型組肺組織損傷程度有所減輕,肺泡腔塌陷改善,出血、滲出減少;中藥全方組較模型組大鼠肺組織損傷程度明顯減輕,肺泡及肺間質(zhì)水腫改善,肺泡結(jié)構(gòu)較完整,塌陷較少,炎性細(xì)胞浸潤及出血點(diǎn)減少。見圖1。

注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 益氣清熱組;D 益氣化瘀組;E 益氣逐飲組;F 中藥全方組。

2.2 肺泡灌洗液和肺勻漿中Rap1b、LFA-1、MAC-1蛋白表達(dá)水平

2.2.1 各組大鼠肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ap1b表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,模型組大鼠的肺泡灌洗液中Rap1b表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,益氣清熱組、益氣化瘀組、益氣逐飲組和中藥全方組大鼠的肺泡灌洗液中Rap1b表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中Rap1b表達(dá)水平比較

2.2.2 各組大鼠肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞粘附分子LFA-1及MAC-1表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,模型組大鼠的肺泡灌洗液中,LFA-1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,各拆方組及中藥全方組大鼠的肺泡灌洗液中LFA-1表達(dá)水平有所降低,而中藥全方組降低最為明顯,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比,模型組大鼠的肺泡灌洗液中MAC-1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,益氣清熱組和中藥全方組大鼠的肺泡灌洗液中MAC-1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中LFA-1及MAC-1表達(dá)水平比較

2.2.3 各組大鼠肺勻漿中性粒細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ap1b表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,模型組大鼠的肺勻漿中Rap1b表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,各拆方組及中藥全方組Rap1b表達(dá)水平均有不同程度下降,但僅益氣逐飲組具差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肺勻漿中Rap1b表達(dá)水平比較

2.2.4 各組大鼠肺勻漿中性粒細(xì)胞粘附分子LFA-1及MAC-1表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,模型組大鼠的肺勻漿中LFA-1表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,各拆方組及中藥全方組大鼠的肺勻漿中LFA-1表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比,模型組大鼠的肺勻漿中MAC-1表達(dá)水平升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與模型組相比,各拆方組及中藥全方組大鼠的肺勻漿中MAC-1表達(dá)水平均有所降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肺勻漿中LFA-1及MAC-1表達(dá)水平比較

2.3 WB法檢測(cè)肺勻漿中Rap1b表達(dá)水平

與對(duì)照組相比,模型組大鼠的肺勻漿中Rap1b表達(dá)水平有所升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與模型組相比,益氣化瘀組大鼠的肺勻漿中Rap1b表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),其他拆方組及中藥全方組Rap1b表達(dá)水平均有所降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表5及圖2。

表5 各組大鼠肺勻漿中性粒細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ap1b表達(dá)水平比較

注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 益氣清熱組;D 益氣化瘀組;E 益氣逐飲組;D 中藥全方組。

3 討論

ARDS的核心病理機(jī)制是失控的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的屏障功能被破壞,其病情嚴(yán)重程度與中性粒細(xì)胞遷移到肺泡及肺毛細(xì)血管內(nèi)的數(shù)量呈正相關(guān)[10]。中性粒細(xì)胞粘附是中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移至肺泡腔的始動(dòng)環(huán)節(jié),抑制該環(huán)節(jié)可有效截?cái)嗥浜罄m(xù)的跨內(nèi)皮遷移過程,進(jìn)而延緩炎癥反應(yīng)進(jìn)展[11]。

Rap1屬于小鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(小G蛋白)Ras超家族成員之一,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、粘附運(yùn)動(dòng)等生物學(xué)功能[12]。Rap1b是中性粒細(xì)胞Rap1的主要亞型,可調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附的動(dòng)態(tài)變化[13],是抑制炎性刺激下中性粒細(xì)胞肺內(nèi)募集活化、跨內(nèi)皮遷移的關(guān)鍵蛋白[14]。整合素是一類細(xì)胞粘附分子,介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞之間及細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互識(shí)別和粘附[15],是重要的細(xì)胞“黏合劑”。而中性粒細(xì)胞主要表達(dá)LFA-1和MAC-1兩種整合素[16],均可與內(nèi)膜上的細(xì)胞間粘附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)結(jié)合,介導(dǎo)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮粘附[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺泡灌洗液、肺勻漿中Rap1b、LFA-1及MAC-1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均有明顯上調(diào),提示ARDS發(fā)病與中性粒細(xì)胞粘附活動(dòng)增強(qiáng)關(guān)系密切。

杜懷棠教授認(rèn)為ARDS的關(guān)鍵病機(jī)在于肺氣虛衰、毒瘀互阻、肺氣壅閉而致衰敗,針對(duì)病機(jī)予以“益氣扶正,解毒化瘀,滌痰逐飲”治法[18]。益氣化瘀解毒方遵其要義,扶正祛邪,標(biāo)本兼顧:君用黃芪補(bǔ)益正氣,御邪防變;臣用金銀花、黃芩清熱解毒,祛邪外出;再用桑白皮、葶藶子、枳實(shí)瀉肺滌痰,逐飲降氣;佐用三七、赤芍活血化瘀,通利血脈。全方祛邪而不傷正,用藥精妙,功專力宏,盡顯杜懷棠教授持中守正之組方特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以“益氣”之法為基礎(chǔ),與“清熱”“化瘀”“逐飲”三者進(jìn)行不同組合,將益氣化瘀解毒湯拆分為益氣清熱方、益氣化瘀方、益氣逐飲方,探究中藥全方及各拆方對(duì)ARDS模型大鼠的影響。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)益氣化瘀解毒方及拆方干預(yù)后,大鼠病理觀察顯示肺組織炎癥、充血水腫等肺損傷表現(xiàn)較模型組均有不同程度減輕,而中藥全方組改善最為明顯,提示益氣化瘀解毒方可有效改善ARDS的肺損傷,抑制肺部炎癥。研究結(jié)果表明,中藥全方組及各拆方組肺泡灌洗液中Rap1b蛋白表達(dá)水平、益氣逐飲組肺勻漿中Rap1b表達(dá)水平較模型組顯著降低;同時(shí),中藥全方組及拆方組肺勻漿中的LFA-1均明顯下調(diào),益氣清熱組和中藥全方組肺泡灌洗液中的MAC-1下調(diào)較其他拆方組更為顯著。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示益氣化瘀解毒方及拆方對(duì)粘附調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ap1b及粘附因子LFA-1和MAC-1表達(dá)水平有下調(diào)作用,且益氣化瘀解毒方及拆方可能通過下調(diào)粘附調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ap1b及粘附因子LFA-1和MAC-1表達(dá)水平,降低肺內(nèi)中性粒細(xì)胞粘附活性,阻斷其跨內(nèi)皮遷移,從而抑制ARDS的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而且,中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移與血栓形成和水腫液滲出關(guān)系密切,LFA-1和MAC-1均可通過配/受體直接結(jié)合的方式促進(jìn)中性粒細(xì)胞與血小板的相互作用,導(dǎo)致血栓形成[19];而減少肺毛細(xì)血管內(nèi)皮上的整合素釋放,可以降低肺血管通透性,抑制水腫液滲出,減輕LPS引起的肺損傷[20]?？傃灾?本實(shí)驗(yàn)中藥各方改善LPS引起的肺損傷的作用體現(xiàn)在可抑制中性粒細(xì)胞粘附、減少肺泡腔內(nèi)的炎性滲出及炎性細(xì)胞因子聚集,即解毒清熱[21];抑制肺微血管滲出、水腫及微血栓形成[22],即逐飲化瘀,均直接作用于肺損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié),與“清熱”“化瘀”“逐飲”之法相契合。

但在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),中藥全方組及拆方組肺勻漿中的MAC-1蛋白和肺泡灌洗液中的LFA-1蛋白較模型組未見顯著下調(diào),與肺泡灌洗液有較大區(qū)別,這可能與LFA-1、MAC-1存在部分功能差異有關(guān)[23]。部分研究認(rèn)為LFA-1主要作用于粘附過程,而MAC-1作用于后續(xù)的遷移過程[24],故而蛋白活性有所差異,可能導(dǎo)致LFA-1在毛細(xì)血管內(nèi)皮上活性較高,MAC-1在肺泡腔內(nèi)活性較高。

綜上,益氣化瘀解毒方及拆方對(duì)ARDS具有較好的治療作用,可能是通過抑制Rap1b、LFA-1和MAC-1蛋白表達(dá),降低中性粒細(xì)胞粘附活性,截?cái)嘀行粤＜?xì)胞跨內(nèi)皮遷移過程,進(jìn)而抑制ARDS失控的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),這也體現(xiàn)了“治病必求于本”的中醫(yī)學(xué)理念。