吳蓮鳳 錢(qián)菁菁 詹玲玲 陸紅

巨噬細(xì)胞的表型具有可塑性，在不同的微環(huán)境作用下，能夠極化為功能狀態(tài)截然不同的兩種細(xì)胞，如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、IFN-γ 和IL-1β 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為經(jīng)典激活（M1 型）細(xì)胞，而IL-4和IL-13 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為替代激活（M2 型）細(xì)胞[1]。其中LPS 和IL-4 為巨噬細(xì)胞極化體外實(shí)驗(yàn)常用的誘導(dǎo)劑。近年來(lái)，對(duì)巨噬細(xì)胞在極化過(guò)程中代謝譜的相關(guān)性研究不斷增多，特別是鐵代謝研究成了學(xué)者們的關(guān)注熱點(diǎn)，認(rèn)為巨噬細(xì)胞在體內(nèi)鐵平衡中起著關(guān)鍵作用。有研究顯示，炎癥中巨噬細(xì)胞通過(guò)鐵吸收增加和輸出減少使體內(nèi)鐵的滯留增加，鐵的積累可進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M1 型。M1 型巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生活性氧、一氧化氮及炎癥因子等殺傷分子，損害鄰近的成纖維細(xì)胞，最終導(dǎo)致組織修復(fù)能力受損及無(wú)法愈合的慢性創(chuàng)傷[2]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，M2 型巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能更快地維持惡性和非惡性細(xì)胞株的生長(zhǎng)[3-4]。然而，目前尚不清楚不同極化亞型巨噬細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)控模式。本研究使用LPS、IL-4 處理巨噬細(xì)胞引起其表型極化，再將誘導(dǎo)后的亞型巨噬細(xì)胞與紅細(xì)胞和鐵劑共培養(yǎng)，檢測(cè)鐵蛋白含量的變化，觀察不同極化亞型巨噬細(xì)胞對(duì)鐵攝入及存儲(chǔ)的影響，從而為通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化影響疾病進(jìn)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，LPS（批號(hào)：IL2020）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，IL-4（批號(hào)：CK74）購(gòu)自蘇州近岸生物有限公司，鐵劑（右旋糖酐鐵注射液，批號(hào)：316012801）購(gòu)自浙江天瑞藥業(yè)公司，鐵蛋白檢測(cè)試劑盒（型號(hào)：H129-1-2）購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，兔抗鼠TNF-α 抗體（批號(hào)：60291-1-Ig）、精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1）抗體（批號(hào)：16001-1-AP）和一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體（批號(hào)：22226-1-AP）均購(gòu)自美國(guó)PeproTech 公司，脫纖維綿羊血（批號(hào)：X05002）購(gòu)自溫州康泰生物技術(shù)有限公司，瑞吉染液試劑（批號(hào)：BA4017C）購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，亞鐵氰化鉀（批號(hào)：20210725）購(gòu)自天津市恒星化學(xué)試劑制造有限公司，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Cy3 山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)ProteinTech 公司。緩沖液（磷酸二氫鉀13.28 g/2 L 購(gòu)自上海聯(lián)試化工有限公司、磷酸氫二鈉12.9 g/2 L 購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司），稀釋鹽酸購(gòu)自浙江中星化工試劑有限公司，中性紅購(gòu)自上海三愛(ài)思試劑有限公司，光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：ECLIPSE 50i 及Ti-s）購(gòu)自日本Nikon 公司，激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss 公司，型號(hào)：LSM710），凝膠成像儀（型號(hào)：Amersham Imager 680）購(gòu)自美國(guó)GE 公司，酶標(biāo)儀（型號(hào)：Infinite M200 PRO）購(gòu)自瑞士TECAN公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7 細(xì)胞置于37 ℃水浴鍋中快速震蕩1～2 min 以解凍，然后置于含有3 mL PBS溶液的15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑10 cm）后棄去上清液，加入DMEM 培養(yǎng)基（含10%滅活PBS 與雙抗）進(jìn)行重懸浮，細(xì)胞濃度約105個(gè)/mL，再置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d 后更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞濃度約為106個(gè)/mL時(shí)，加入LPS 20 ng/mL 或IL-4 10 ng/mL 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化。采用光學(xué)顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并采集圖像。

1.2.2 觀察TNF-α 和Arg-1 表達(dá)情況 采用免疫熒光染色法。將極化后的巨噬細(xì)胞與TNF-α 抗體（1∶500）或Arg-1抗體（1∶500）在室溫下孵育1 h，隨后與Cy3 山羊抗兔二抗避光孵育1 h。用PBS 洗滌3 次后，將細(xì)胞在含有40 mg/mL DAPI的培養(yǎng)基中孵育5 min，隨后在激光共聚焦顯微鏡下采集圖像，觀察誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞TNF-α 和Arg-1 表達(dá)情況。

1.2.3 TNF-α、iNOS 和Arg-1 表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot法。將極化后的巨噬細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3 次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，12 000 r/min 4 ℃離心20 min（離心半徑10 cm）。小心吸出上清液，用BCA 法進(jìn)行上清液的蛋白質(zhì)定量。用4%和20%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)樣品，濕轉(zhuǎn)法將分離膠的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，隨后分別加入抗β-actin（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、iNOS（1∶1 000）和Arg-1（1∶1 000）抗體4 ℃孵育過(guò)夜，第2 天用Cy3 山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，應(yīng)用超敏曝光液在凝膠成像儀上形成可視化條帶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參對(duì)條帶標(biāo)準(zhǔn)化后對(duì)照組相比進(jìn)行均一化處理，檢測(cè)累積光密度值（integrated optical density，IOD）并進(jìn)行TNF-α、iNOS 和Arg-1 表達(dá)水平的比較。

1.2.4 巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 取脫纖維綿羊紅細(xì)胞2 μL 分別與極化后的M1 型或M2 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48 h 后取細(xì)胞懸液滴加于玻片上，制備薄血膜片，待玻片充分干燥，滴加瑞吉染液及緩沖液，染色25 min，無(wú)菌水沖洗，自然晾干后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，分別計(jì)數(shù)1 000 個(gè)巨噬細(xì)胞，記錄吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)量，并采集圖像。

1.2.5 鐵染色實(shí)驗(yàn) 取鐵劑3 μL 分別與極化的M1 型或M2 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48 h 后取細(xì)胞懸液滴加在玻片上，制備薄血膜，充分干燥后滴加亞鐵氰化鉀與稀釋鹽酸溶液（5∶1）混合液，染色25 min，無(wú)菌水沖洗，加入稀釋中性紅溶液復(fù)染10 min，無(wú)菌水沖洗，待干燥后置于光學(xué)顯微鏡下觀察不同極化亞型細(xì)胞胞質(zhì)中吞噬鐵顆粒差異，并采集圖像。鐵顆粒細(xì)小、分布稀疏為（±），顆粒約占細(xì)胞質(zhì)1/4 為（+），占細(xì)胞質(zhì)1/4 至1/2 為（++），占細(xì)胞質(zhì)1/2 至3/4 為（+++），布滿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)為（++++）。

1.2.6 鐵蛋白含量測(cè)定 極化的巨噬細(xì)胞加入鐵劑共培養(yǎng)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)采用ELISA 法檢測(cè)不同極化亞型巨噬細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞培養(yǎng)液中鐵蛋白含量，并使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)量吸光度（A）。將A值傳輸?shù)杰浖礼raphPad Prism 中，并使用擬合5 個(gè)參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中鐵蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 及IL-4 處理后巨噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 未處理的巨噬細(xì)胞胞體規(guī)則呈圓形，核染色質(zhì)細(xì)致；LPS處理后巨噬細(xì)胞其胞體明顯增大且不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)突起易見(jiàn)，胞質(zhì)量豐富可見(jiàn)空泡，核染色質(zhì)偏粗，偶見(jiàn)多核；IL-4 處理后巨噬細(xì)胞其胞體偏大，胞質(zhì)量偏多，胞質(zhì)可見(jiàn)少量突起，核染色質(zhì)偏細(xì)致；見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

圖1 LPS 及IL-4 處理后巨噬細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)（A：未處理的巨噬細(xì)胞；B：LPS 處理后的巨噬細(xì)胞；C：IL-4 處理后的巨噬細(xì)胞）

2.2 LPS 及IL-4 處理后巨噬細(xì)胞TNF-α 和Arg-1 的表達(dá)情況 結(jié)果顯示，LPS 處理后巨噬細(xì)胞表達(dá)M1型標(biāo)志物TNF-α 明顯增加，IL-4 處理后巨噬細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化，相反表達(dá)了M2 型標(biāo)志物Arg-1 增加，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。

圖2 LPS 及IL-4 處理后巨噬細(xì)胞TNF-α 及Arg-1 表達(dá)差異的免疫熒光染色圖

2.3 LPS 及IL-4 處理后巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS 和Arg-1 表達(dá)水平的比較 Western blot 結(jié)果顯示，LPS 較IL-4處理的巨噬細(xì)胞表達(dá)M1 型標(biāo)志物TNF-α 及iNOS 顯著增加（均P＜0.05），而IL-4 較LPS 處理的巨噬細(xì)胞表達(dá)M2型標(biāo)志物Arg-1顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 LPS及IL-4處理后巨噬細(xì)胞TNF-α、iNOS和Arg-1表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較

2.4 M1 型與M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的吞噬作用差異 LPS 處理M1 型巨噬細(xì)胞和IL-4 誘導(dǎo)的M2 型巨噬細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)瑞氏染色鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)兩者吞噬紅細(xì)胞存在差異，M1 型巨噬細(xì)胞可見(jiàn)吞噬紅細(xì)胞（計(jì)數(shù)1 000 個(gè)巨噬細(xì)胞可見(jiàn)3 個(gè)吞噬紅細(xì)胞)，而M2 型巨噬細(xì)胞未見(jiàn)吞噬紅細(xì)胞（計(jì)數(shù)1 000 個(gè)巨噬細(xì)胞未見(jiàn)吞噬血細(xì)胞），見(jiàn)圖4（插頁(yè)）。

圖4 LPS 及IL-4 誘導(dǎo)不同極化亞型巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞差異效果圖[A、C：未處理的巨噬細(xì)胞及IL-4 誘導(dǎo)的M2 型巨噬細(xì)胞未見(jiàn)吞噬紅細(xì)胞細(xì)胞；B：LPS 誘導(dǎo)的M1 型巨噬細(xì)胞可見(jiàn)吞噬紅細(xì)胞（箭頭所示）]

2.5 M1 型與M2 型巨噬細(xì)胞對(duì)鐵的攝入差異 經(jīng)鐵染色鏡檢觀察，未處理巨噬細(xì)胞鐵染色陽(yáng)性程度（±）；M1 型巨噬細(xì)胞吞噬藍(lán)色鐵顆粒明顯增多，鐵染色陽(yáng)性程度為（++）至（+++），明顯高于M2 型巨噬細(xì)胞鐵染色陽(yáng)性程度（+），說(shuō)明M1 型巨噬細(xì)胞鐵攝入高于M2 型巨噬細(xì)胞，表現(xiàn)出固鐵優(yōu)勢(shì)，見(jiàn)圖5（插頁(yè)）。

圖5 LPS 及IL-4 處理后不同極化亞型巨噬細(xì)胞對(duì)鐵攝入差異效果圖（A：未處理巨噬細(xì)胞鐵染色陽(yáng)性程度；B：LPS 處理后M1 型巨噬細(xì)胞鐵染色陽(yáng)性程度；C：IL-4 處理后M2 型巨噬細(xì)胞鐵染色陽(yáng)性程度）

2.6 M1 型與M2 型巨噬細(xì)胞胞內(nèi)及細(xì)胞培養(yǎng)液鐵蛋白含量的比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M1 型巨噬細(xì)胞鐵蛋白含量明顯高于M2 型巨噬細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液鐵蛋白含量低于M2 型（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)M1 型巨噬細(xì)胞的合成儲(chǔ)存鐵增加，表現(xiàn)出固鐵優(yōu)勢(shì)，見(jiàn)圖6。

圖6 LPS 及IL-4 處理后不同極化亞型巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中鐵蛋白含量的比較

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在不同微環(huán)境的刺激下可以形成不同極化亞型，不同極化亞型巨噬細(xì)胞在功能上存在異質(zhì)性，M1 型巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)為促進(jìn)炎癥反應(yīng)并清除病原體作用，M2 型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為抑制炎癥反應(yīng)并組織修復(fù)作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS及IL-4 分別誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 在形態(tài)上可見(jiàn)明顯差異，LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞體明顯增大且不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)突起易見(jiàn)，胞質(zhì)量豐富可見(jiàn)空泡，核染色質(zhì)偏粗，偶見(jiàn)多核；IL-4 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞其胞體偏大，胞質(zhì)量偏多，胞質(zhì)可見(jiàn)少量突起，核染色質(zhì)偏細(xì)致。LPS 較IL-4 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)更突出的多形性。同時(shí)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表達(dá)M1 型標(biāo)志物炎癥因子TNF-α 及促進(jìn)氧和氮自由基生成的酶iNOS 顯著增高，相反，IL-4 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Arg-1 表達(dá)增加，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)成功利用LPS 及IL-4 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M1 型及M2 型。

鐵是機(jī)體必須營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是細(xì)胞多種生理過(guò)程的重要輔助因子。而巨噬細(xì)胞在機(jī)體鐵代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程中起到非常重要的作用。一方面巨噬細(xì)胞可以通過(guò)吞噬衰老紅細(xì)胞，回收紅細(xì)胞內(nèi)的鐵影響鐵的吸收，另一方面通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)鐵的可用性影響鐵的儲(chǔ)存和釋放[7-8]。但是不同亞型巨噬細(xì)胞在鐵代謝過(guò)程中表現(xiàn)明顯不同，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)紅細(xì)胞和鐵劑共培養(yǎng)觀察，LPS 誘導(dǎo)的M1 型巨噬細(xì)胞可見(jiàn)吞噬紅細(xì)胞并且胞內(nèi)著色鐵顆粒明顯增多，而M2 型巨噬細(xì)胞未見(jiàn)吞噬紅細(xì)胞且胞內(nèi)鐵顆粒較少，顯示了LPS 誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞較IL-4 誘導(dǎo)M2 型對(duì)鐵的攝入增加。筆者還發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)極化的M1 型巨噬細(xì)胞胞內(nèi)鐵蛋白含量明顯高于IL-4 誘導(dǎo)極化的M2 型巨噬細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了LPS 誘導(dǎo)極化的M1 型巨噬細(xì)胞對(duì)鐵儲(chǔ)存增加，而M2 型并未見(jiàn)明顯增加。說(shuō)明不同極化亞型巨噬細(xì)胞在鐵代謝過(guò)程中存在明顯差異，即M1亞型巨噬細(xì)胞對(duì)鐵攝入和儲(chǔ)存明顯增加，與M2 型巨噬細(xì)胞相比有明顯固鐵優(yōu)勢(shì)，與國(guó)內(nèi)相關(guān)學(xué)者研究相符[9]。在炎癥性疾病中，鐵在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的滯留是機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)對(duì)炎癥的主要反應(yīng)，被認(rèn)為是宿主阻止入侵病原體的重要作用[10]。但是同時(shí)這也限制了紅系祖細(xì)胞的鐵供應(yīng)，并可能導(dǎo)致炎癥相關(guān)貧血的常見(jiàn)情況[11-13]。早期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠腎組織炎癥損傷和修復(fù)過(guò)程中，M1 型巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)早期損傷，而M2型巨噬細(xì)胞參與損傷后的纖維修復(fù)[14]，極化的M1 型巨噬細(xì)胞對(duì)鐵吸收和滯留明顯增加，鐵的積累導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞的進(jìn)一步極化，繼續(xù)誘導(dǎo)活性氧及一氧化氮的合成，并釋放各種炎癥因子，造成組織炎癥損傷加重，難于修復(fù)[15]。由此可見(jiàn)，調(diào)控不同極化亞型巨噬細(xì)胞的鐵代謝，有望成為治療慢性炎癥性疾病等重要切入點(diǎn)，也是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究從形態(tài)改變及免疫方法等多種方式，利用LPS 及IL-4 成功的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為不同亞型，且不同亞型的巨噬細(xì)胞對(duì)鐵代謝表現(xiàn)不同，LPS 誘導(dǎo)的M1 型巨噬細(xì)胞較IL-4 誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞有明顯固鐵優(yōu)勢(shì)。而導(dǎo)致極化巨噬細(xì)胞胞內(nèi)和胞外鐵的有效性及其微環(huán)境的差異可以直接影響相鄰組織細(xì)胞增殖、分化甚至損傷等，所以明確不同極化亞型巨噬細(xì)胞對(duì)鐵代謝差異性調(diào)節(jié)，可為了解其在病理生理?xiàng)l件下的作用提供了理論依據(jù)，為臨床應(yīng)用提供新的治療策略。